Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-og-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Bidragyderne havde ingen rolle i manuskriptforberedelsen.

Dyrepleje og alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra dyrepleje- og etikkomitéen ved universitetet i München, og alle procedurer, der blev udført på mus, blev godkendt af regeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J mus blev kommercielt opnået.
1. præparater
<ol><li>Klargør cellesorteringsbuffer (tabel 1), og opbevares ved 4 °C. BEMÆRK: Under hele forsøgsproceduren skal cellesorteringsbufferen altid være på is.</li>...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

I dette manuskript beskriver vi en protokol for berigelse af hjerteboende makrofager specifikt fra SAN- og AVN-regionerne ved høj renhed.
Makrofager er opdelt i subpopulationer baseret på deres anatomiske placering og funktionelle fænotype. De kan også skifte fra en funktionel fænotype til en anden som reaktion på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer såsom knoglemarv og lever indeholder hjertevæv en lavere procentdel af immunceller og l...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Sinoatrialknuden (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impuls og er derfor hjertets primære pacemaker. Den atrioventrikulære knude (AVN) leder den elektriske impuls fra atrierne til ventriklerne og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning af elektriske impulser en kompleks proces, der kan moduleres af forskellige faktorer2, herunder resident makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig undersøgelse af Hulsmans et al. viser en specifik population af hjerteboende makrofager, der er beriget i AVN og fungerer som nøgleaktører i at holde et stabilt hjerteslag3. De fandt ud af, at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytterne og kunne ændre de elektriske egenskaber af koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemærker også, at sådanne ledende celler, der forbinder med makrofager, også er til stede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, såsom SAN.
I øjeblikket er det ikke fuldt ud kendt, om fænotypen af hjemmehørende hjertemakrofager adskiller sig mellem hjerteregionerne. Det har imidlertid vist sig, at vævsmikromiljøet kan påvirke transkription og proliferativ fornyelse af vævsmakrofager4. Da kardiomyocytfænotypen har vist sig at være forskellig mellem regioner, kan de funktionelle virkninger af makrofager på kardiomyocytter også være regionsspecifikke, selvom makrofagfænotypen selv kan være den samme. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser af specifikke hjerteregioner.
Nylige undersøgelser har vist, at vævsresidente makrofager ved steady state etableres prænatalt, opstår uafhængigt af endelig hæmatopoiesis og vedvarer ind i voksenalderen5. Efter makrofagudtømning eller under hjertebetændelse bidrager Ly6chi monocytter imidlertid til at genopbygge hjertemakrofagpopulationen6. Undersøgelser, der involverer genetisk afstamningssporing, parabiose, skæbnekortlægning og cellesporing, viste sameksistensen af en række vævsresidente makrofagpopulationer i organer og væv og også forskellige cellulære adfærd af makrofagundergrupper, der potentielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering af residente hjertemakrofager har nydt godt af brugen af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) og fluorescerende aktiveret cellesortering. Disse metoder er især nyttige til isolering af specifikke cellepopulationer fra flere vævsfraktioner ved at mærke dem med deres celleoverflademarkører. Dette fører ikke kun til en højere renhed af den isolerede immuncelletype, men giver også mulighed for fænotypisk analyse. Her præsenterer vi en protokol, der inkluderer magnetiske perlebelagte celler efterfulgt af fluorescerende aktiveret cellesortering til berigelse af hjerteboende makrofager specifikt isoleret fra SAN- og AVN-regionen.
For at undersøge egenskaberne ved hjerteboende makrofager i ledningssystemet og deres funktion til hjerteledning og arytmogenese er præcis lokalisering og dissektion af SAN og AVN kritisk. Til mikrodissektion af SAN og AVN anvendes anatomiske vartegn til regionsidentifikation10. Kort sagt er SAN placeret ved krydset mellem den overlegne vena cava og højre atrium. AVN er placeret inden for trekanten af Koch, som er anteriort omgivet af septalbrochuren af tricuspidventilen og bagud af senen af Todaro11. Vi leverer også en nøjagtig mikrodissektionsprocedure af SAN og AVN hos mus, som bekræftes af histologi og immunfluorescensfarvning.
Isolerede residente makrofager kunne bruges til yderligere eksperimenter såsom RNA-sekventering eller kunne genvindes og dyrkes i mere end to uger, hvilket tillod forskellige in vitro-eksperimenter. Derfor beskriver vores protokol en meget værdifuld procedure for immuno-rytmikologen. Tabel 1 viser sammensætningen af alle de nødvendige løsninger, figur 1 viser mikrodissektionsmærkerne for SAN og AVN. Figur 2 er skematisk illustration af SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser den histologiske farvning af SAN og AVN (Massons trichrom- og immunfluorescensfarvning). Figur 4 viser en trin-for-trin gating-strategi til isolering af hjerteboende makrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Residente hjertemakrofager har vist sig at lette den elektriske ledning i hjertet. Den fysiologiske hjerterytme initieres af elektriske impulser genereret i sinoatrialknude (SAN) og ledes derefter til ventrikler via atrioventrikulær knude (AVN). For yderligere at studere beboermakrofagernes rolle i hjerteledningssystemet er en ordentlig isolering af residente makrofager fra SAN og AVN nødvendig, men det er stadig udfordrende. Her leverer vi en protokol til pålidelig mikrodissektion af SAN og AVN i murinehjerter efterfulgt af isolering og kultur af residente makrofager.
Både SAN, der er placeret ved krydset mellem crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN, der er placeret i toppen af Koch-trekanten, identificeres og mikrodissekeres. Korrekt placering bekræftes ved histologisk analyse af vævet udført med Massons trikrome plet og ved anti-HCN4.
Mikrodissekeret væv fordøjes derefter enzymatisk for at opnå enkeltcellesuspensioner efterfulgt af inkubation med et specifikt panel af antistoffer rettet mod celletypespecifikke overflademarkører. Dette gør det muligt at identificere, tælle eller isolere forskellige cellepopulationer ved fluorescerende aktiveret cellesortering. For at differentiere hjerteboende makrofager fra andre immunceller i myokardiet, især rekrutterede monocytafledte makrofager, er der behov for en delikat udtænkt gatingstrategi. For det første detekteres lymfoide afstamningsceller og udelukkes fra yderligere analyse. Derefter identificeres myeloide celler med residente makrofager, der bestemmes ved høj ekspression af både CD45 og CD11b og lav ekspression af Ly6C. Med cellesortering kan isolerede hjertemakrofager derefter dyrkes in vitro over flere dage til yderligere undersøgelse. Vi beskriver derfor en protokol til isolering af hjerteboende makrofager placeret i hjerteledningssystemet. Vi diskuterer faldgruber ved mikrodissekering og fordøjelse af SAN og AVN og giver en gating-strategi til pålideligt at identificere, tælle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.

Vi beskriver en praktisk procedure for isolering af hjerteboende makrofager specifikt fra SAN- og AVN-regionen. For at bekræfte en korrekt dissektion udføres Massons Trichrome-farvning og immunfluorescerende HCN4-farvning (figur 3)12. Med denne protokol kunne vi indsamle ca. 60.000 makrofager fra et helt hjerte. Figur 4 viser gating-strategien for sortering af hjertemakrofager. Levende residente hjertemakrofager blev identificeret som C...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Protokollen, der præsenteres her, giver en trinvis tilgang til isolering af hjerteboende makrofager fra sinoatrialknuden (SAN) og atrioventrikulær knude (AVN) region af musehjerter.

Isolering og kultur af residente hjertemakrofager fra Murine Sinoatrial og Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Vi beskriver en protokol for mikrodissektion og efterfølgende isolering af hjerteboende mikrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering specifikt fra sinus og AV-knude i musen. Med den præcise mikrodissektion af sinus og V-knude efterfulgt af kombinationen af magnetisk og fluorescensaktiveret cellesortering er vi i stand til specifikt at isolere residente makrofager fra sinus og V-knude ved høj renhed. Identifikation og isolering af hjerteboende makrofager fra forskellige regioner i hjertet gør det muligt yderligere at studere deres fænotype og deres regionsspecifikke indvirkning på hjerteelektrofysiologi.Efter isolering af hjertet udføres mikrodissektionsprocedurerne i en dissektionsskål med iskold engangs PBS under et dissekeringsmikroskop. Brug hjerteanatomiske landemærker som aorta, lungearterie, koronar sinus og venstre eller højre ventrikel til at bestemme venstre højre og forreste bageste af hjertet. Når orienteringen er bestemt, skal du placere hjertet med fronten i bunden af skålen for at udsætte de bageste store vener.Skær langs rillen mellem ventriklerne og atrierne for at fjerne størstedelen af ventriklerne. Behold den atriale del. Fastgør hjertet til dissektionsskålen ved at indsætte stifter gennem den resterende del af LV-fri væg og LAA.Skær den resterende RV-fri væg opad gennem tricuspidventilen og den overlegne vena cava. Vend RA og RV væk og fastgør RAA for at udsætte RA-hulrummet intercaval region og atrial septum. Til mikrodissektion af SAN skal du skære hjertet langs det interatriale septum parallelt med crista terminalis for at adskille intercavalområdet for at opnå SAN-prøven.Sæt prøven i et tomt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. For mikrodissektion af AVN skal du fastgøre de resterende dele af hjertet gennem vævet ved siden af det interatriale septum og interventrikulære septum for at vende den højre atriale side af den interatriale septum opad. Se på højre atrium på endokardialoverfladen for Kochs trekant, som vil blive omkranset anteriort af hængsellinjen på septalbladet på tricuspidventilen og bagud ved Todaros sene.Åbningen af koronar sinus observeres ved bunden. Hak SAN- og AVN-vævet med skalpeller. Tilsæt derefter 500 mikroliter frisklavet fordøjelsesbuffer til hver prøve og vask alt hakket væv fra mikrocentrifugerørets væg.Pipetter forsigtigt for at hjælpe med at fordøje prøven og homogenisere vævet på en hvirvelmaskine. Efter fordøjelsen overføres vævssuspensionen til et frisk 15 milliliter centrifugerør ved at føre det gennem en 40 mikrometer cellesi. Skyl cellesien med yderligere fem milliliter cellesorteringsbuffer for at stoppe fordøjelsen.Fjern supernatanten. Efter at have resueret cellepelleten med 90 mikroliter cellesorteringsbuffer, tilsættes 10 mikroliter CD45 mikroperler pr. 10 millioner celler i alt til cellesuspensionen i et 15 milliliter centrifugerør. Bland prøverne godt.I løbet af tiden til inkubation af cellesuspensionen med mikroperler og antistofblanding skal du forberede magnetisk adskillelsessæt ved at fastgøre den magnetiske søjle til en passende magnetisk separator og derefter placere et opsamlingsrør under den magnetiske søjle. Forbered magnetiske søjler ved at skylle med 500 mikroliter cellesorteringsbuffer tilføjet øverst i kolonnen og lade bufferen passere igennem. Påfør cellesuspensionen straks på søjlen, undgå luftbobler, mens cellesorteringsbufferen passerer igennem.Søjlen vaskes tre gange med 500 mikroliter cellesorteringsbuffer. Tilsæt en milliliter cellesorteringsbuffer på kolonnen. Fjern søjlen fra magnetseparatoren, og læg den på et nyt opsamlingsrør.Skyl straks søjlen ved at påføre stemplet, der følger med søjlen, fast for at opnå gennemstrømningen indeholdende de magnetisk mærkede celler. Efter påføring af den ufarvede prøve og kompensationsrørene skal du justere spændingerne i hver kanal for at justere både de positive og negative toppe til den korrekte position af aksen. Indstil gating-strategien som beskrevet i tekstmanuskriptet ved hjælp af DAPI som en levedygtighedsmarkør.Kontroller flowcytometridiagrammerne for at bekræfte, at cellepopulationen af interesse vises korrekt på diagrammerne. Saml de sorterede celler i medium eller buffer baseret på behovet for efterfølgende eksperimenter. For at bekræfte en korrekt dissektion blev identifikation af SAN og AVN udført ved hjælp af immunfluorescerende og Massons trichromfarvning.Immunofluorescerende farvning af HCN4-positive ledningssystemceller i SAN og AVN samt Massons trichromfarvning af SAN og AVN er vist her. Gating-strategien for cellesortering af residente hjertemakrofager bidrog til at identificere mononukleære celler ved udelukkelse af dubletter i y-aksens fremadrettede spredningsområde versus x-aksen. Døde celler blev udelukket af DAPI.Levende celler blev gated for CD45 positive leukocytter og derefter for CD11b positive myeloide celler. Hjertemakrofager blev identificeret ved ekspression af både F4/80 og CD64, derefter stratificeret af lymfocytantigen seks ekspression. Frisk sorterede celler blev observeret under brightfieldmikroskopi.Cellerne var positive for CD45, når de blev observeret under fluorophore PE-kanalen. Når det observeres under fluorophore APC størrelse syv kanal, viste den samme visning af de sorterede celler CD11b positive celler. Fluorophore PE størrelse syv kanal blev brugt til at identificere F4/80 positiv fænotype.Og de tredobbelte positive celler blev identificeret som hjerteboende makrofager. Isolerede hjertemakrofager dyrket i medium i op til seks dage er angivet med hvide pile, mens de sorte pile angiver døde celler. Sorterede makrofager kan bruges til yderligere funktionelle undersøgelser såsom patch clamp eksperimenter eller ekspressionsundersøgelser såsom RNA-sekventering eller proteomiske undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisering af<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Inden Hjerte småsår og efterfølgende Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolation og formering af cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering og rensning af murine hjerte Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Single Myofiber Isolation og kultur fra en Murine Model af Emery-Dreifuss muskelsvind i tidlig postnatal udvikling

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Placering, dissektion og analyse af Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...