Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb, 81Z0600204 aan C.S.), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 aan S. Massberg), het ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.

Dierverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Ethics-commissie van de Universiteit van München en alle procedures die op muizen werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de regering van Beieren, München, Duitsland. C57BL6/J muizen werden commercieel verkregen.
1. Voorbereidingen
<ol><li>Bereid celsorteerbuffer voor (tabel 1) en bewaar bij 4 °C. OPMERKING: Tijdens de hele experimentele pro...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de verrijking van cardiale macrofagen specifiek uit de SAN- en AVN-regio's met een hoge zuiverheidsgraad.
Macrofagen zijn onderverdeeld in subpopulaties op basis van hun anatomische locatie en functioneel fenotype. Ze kunnen ook overschakelen van het ene functionele fenotype naar het andere als reactie op variabele micro-omgevingssignalen13. In vergelijking met andere organen zoals beenmerg en lever bevat hartweefsel ee...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

De sinoatriale knoop (SAN) initieert fysiologisch de elektrische impuls en is daarom de primaire pacemaker van het hart. De atrioventriculaire knoop (AVN) geleidt de elektrische impuls van de boezems naar de ventrikels en fungeert ook als een secundaire pacemaker1. Over het algemeen is het genereren en geleiden van elektrische impulsen een complex proces dat kan worden gemoduleerd door verschillende factoren2, waaronder residente macrofaag in SAN / AVN-regio's. Een recente studie van Hulsmans et al. toont een specifieke populatie van cardiale macrofagen die verrijkt zijn in de AVN en functioneren als belangrijke spelers bij het houden van een stabiele hartslag3. Ze ontdekten dat macrofagen elektrisch gekoppeld zijn aan de cardiomyocyten en de elektrische eigenschappen van gekoppelde cardiomyocyten kunnen veranderen. De auteurs merken ook op dat dergelijke geleidende cellen die interleaving met macrofagen ook aanwezig zijn in andere componenten van het hartgeleidingssysteem, zoals het SAN.
Momenteel is het niet volledig bekend of het fenotype van residente cardiale macrofagen verschilt tussen de hartregio's. Het is echter aangetoond dat de weefselmicro-omgeving de transcriptie en proliferatieve vernieuwing van weefselmacrofagen kan beïnvloeden4. Aangezien is aangetoond dat het fenotype van cardiomyocyten verschilt tussen regio's, kunnen de functionele effecten van macrofagen op cardiomyocyten ook regiospecifiek zijn, zelfs als het macrofaagfenotype zelf hetzelfde kan zijn. Daarom zijn verdere studies over specifieke hartregio's nodig.
Recente studies hebben aangetoond dat, in steady state, de weefselresidente macrofagen prenataal worden vastgesteld, onafhankelijk van definitieve hematopoëse ontstaan en aanhouden tot in de volwassenheid5. Echter, na macrofaag uitputting of tijdens hartontsteking, Ly6chi monocyten bijdragen aan het aanvullen van cardiale macrofaag populatie6. Studies met betrekking tot genetische afstammingstracering, parabiose, lotkartering en celtracking toonden de coëxistentie aan van een verscheidenheid aan weefselresidente macrofagenpopulaties in organen en weefsels, en ook verschillend cellulair gedrag van macrofaagsubsets die mogelijk geassocieerd zijn met hun ontogenie 7,8,9.
Karakterisering van residente cardiale macrofagen heeft geprofiteerd van het gebruik van magnetische geactiveerde celsortering (MACS) en fluorescente geactiveerde celsortering. Deze methoden zijn vooral nuttig voor het isoleren van specifieke celpopulaties van meerdere weefselfracties door ze te labelen met hun celoppervlakmarkers. Dit leidt niet alleen tot een hogere zuiverheid van het geïsoleerde immuunceltype, maar maakt ook fenotypische analyse mogelijk. Hier presenteren we een protocol met magnetische kralen-gecoate cellen gevolgd door fluorescente geactiveerde celsortering voor de verrijking van cardiale residente macrofagen die specifiek geïsoleerd zijn uit het SAN- en AVN-gebied.
Om de kenmerken van cardiale macrofagen in het geleidingssysteem en hun functie voor hartgeleiding en aritmogenese te onderzoeken, zijn nauwkeurige lokalisatie en dissectie van SAN en AVN van cruciaal belang. Voor microdissectie van SAN en AVN worden anatomische oriëntatiepunten gebruikt voor de regio-identificatie10. Kortom, SAN bevindt zich op de kruising van de superieure vena cava en het rechter atrium. AVN bevindt zich binnen de driehoek van Koch, die vooraan wordt begrensd door de septumfolder van de tricuspidalisklep en achteraan door de pees van Todaro11. We bieden ook een nauwkeurige microdissectieprocedure van SAN en AVN bij muizen, die wordt bevestigd door histologie en immunofluorescentiekleuring.
Geïsoleerde residente macrofagen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten zoals RNA-sequencing of kunnen worden hersteld en gedurende meer dan twee weken worden gekweekt, waardoor verschillende in vitro experimenten mogelijk zijn. Daarom beschrijft ons protocol een zeer waardevolle procedure voor de immunoritmoloog. Tabel 1 toont de samenstelling van alle benodigde oplossingen, figuur 1 toont de microdissectie-oriëntatiepunten voor SAN en AVN. Figuur 2 is een schematische illustratie van SAN- en AVN-lokalisatie. Figuur 3 toont de histologische kleuring van SAN en AVN (Masson's trichrome en immunofluorescentiekleuring). Figuur 4 toont een stapsgewijze gatingstrategie om cardiale residente macrofagen te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Van residente cardiale macrofagen is aangetoond dat ze de elektrische geleiding in het hart vergemakkelijken. Het fysiologische hartritme wordt geïnitieerd door elektrische impulsen gegenereerd in sinoatriale knoop (SAN) en vervolgens geleid naar ventrikels via atrioventriculaire knoop (AVN). Om de rol van residente macrofagen in het hartgeleidingssysteem verder te bestuderen, is een goede isolatie van residente macrofagen van SAN en AVN noodzakelijk, maar het blijft een uitdaging. Hier bieden we een protocol voor de betrouwbare microdissectie van de SAN en AVN in muizenharten, gevolgd door de isolatie en cultuur van residente macrofagen.
Zowel SAN, dat zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava bevindt, als AVN dat zich op de top van de driehoek van Koch bevindt, worden geïdentificeerd en gemicrodisseceerd. De juiste locatie wordt bevestigd door histologische analyse van het weefsel uitgevoerd met Masson's trichrome kleuring en door anti-HCN4.
Microdissected weefsels worden vervolgens enzymatisch verteerd om eencellige suspensies te verkrijgen, gevolgd door de incubatie met een specifiek panel van antilichamen gericht tegen celtypespecifieke oppervlaktemarkers. Dit maakt het mogelijk om verschillende celpopulaties te identificeren, te tellen of te isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering. Om cardiale residente macrofagen te onderscheiden van andere immuuncellen in het myocardium, met name gerekruteerde van monocyten afgeleide macrofagen, is een delicate bedachte gatingstrategie nodig. Ten eerste worden lymfoïde afstammingscellen gedetecteerd en uitgesloten van verdere analyse. Vervolgens worden myeloïde cellen geïdentificeerd met residente macrofagen die worden bepaald door hoge expressie van zowel CD45 als CD11b en lage expressie van Ly6C. Met celsortering kunnen geïsoleerde hartmacrofagen vervolgens gedurende meerdere dagen in vitro worden gekweekt voor verder onderzoek. We beschrijven daarom een protocol om cardiale residente macrofagen te isoleren die zich in het hartgeleidingssysteem bevinden. We bespreken valkuilen bij het microdissecteren en verteren van SAN en AVN, en bieden een gating-strategie om cardiale macrofagen betrouwbaar te identificeren, tellen en sorteren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.

We beschrijven een praktische procedure voor de isolatie van cardiale resident macrofagen specifiek uit de SAN- en AVN-regio. Om een juiste dissectie te bevestigen, wordt Masson's Trichrome-kleuring en immunofluorescente HCN4-kleuring uitgevoerd (figuur 3)12. Met dit protocol konden we ongeveer 60.000 macrofagen uit één heel hart verzamelen. Figuur 4 toont de gatingstrategie voor het sorteren van hartmacrofagen. Levende residente cardia...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Het hier gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze aanpak voor de isolatie van cardiale residente macrofagen uit het sinoatriale knooppunt (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) gebied van muizenharten.

Isolatie en kweek van residente cardiale macrofagen van de Murine Sinoatriale en Atrioventriculaire Knoop

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

We beschrijven een protocol voor microdissectie en daaropvolgende isolatie van cardiale resident microfagen door fluorescentie-geactiveerde celsortering specifiek van sinus en AV-knoop in de muis. Met de precieze microdissectie van de sinus en de V-knoop, gevolgd door de combinatie van magnetische en fluorescentie-geactiveerde celsortering, zijn we in staat om residente macrofagen specifiek te isoleren van de sinus en de V-knoop met hoge zuiverheid. Identificatie en isolatie van cardiale macrofagen uit verschillende regio's in het hart maakt het mogelijk om hun fenotype en hun regiospecifieke impact op cardiale elektrofysiologie verder te bestuderen.Na het isoleren van het hart, voert u de microdissectieprocedures uit in een dissectieschaal met ijskoude eenmalige PBS onder een ontleedmicroscoop. Gebruik cardiale anatomische oriëntatiepunten zoals aorta, longslagader, coronaire sinus en linker- of rechterkamer om de linker-rechts en anterieur-achterste van het hart te bepalen. Nadat de oriëntatie is bepaald, plaatst u het hart met de voorkant aan de onderkant van de schaal om de achterste grote aderen bloot te leggen.Snijd langs de groef tussen de ventrikels en de boezems om het grootste deel van de ventrikels te verwijderen. Houd het atriale gedeelte. Bevestig het hart aan de snijschaal door pinnen door het resterende deel van de LV-vrije wand en de LAA in te steken.Snijd de resterende RV-vrije wand naar boven door de tricuspidalisklep en superieure vena cava. Draai de RA en RV weg en pin de RAA om het RA-holte intercavalgebied en het atriumtussenschot bloot te leggen. Snijd voor de microdissectie van SAN het hart langs het interatriale septum parallel aan de crista terminalis om het intercavalgebied te scheiden om het SAN-monster te verkrijgen.Doe het monster in een lege microcentrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs. Voor microdissectie van AVN pint u de resterende delen van het hart door het weefsel naast het interatriale septum en het interventriculaire septum om de rechter atriale kant van het interatriale septum omhoog te kijken. Kijk naar het rechter atrium op het endocardiale oppervlak voor de driehoek van Koch die vooraan wordt begrensd door de scharnierlijn van de septumfolder van de tricuspidalisklep en achteraan door de pees van Todaro.De opening van de coronaire sinus wordt waargenomen aan de basis. Gehakt het SAN- en AVN-weefsel met scalpels. Voeg vervolgens 500 microliter vers bereide verteringsbuffer toe aan elk monster en was al het gehakte weefsel uit de wand van de microcentrifugebuis.Pipet voorzichtig om het monster te helpen verteren en homogeniseer het weefsel op een vortexmachine. Breng na de vertering de weefselsuspensie over naar een verse centrifugebuis van 15 milliliter door deze door een celzeef van 40 micrometer te laten gaan. Spoel de celzeef af met nog eens vijf milliliter celsorteerbuffer om de spijsvertering te stoppen.Verwijder het supernatant. Na het resuspenderen van de celpellet met 90 microliter celsorteerbuffer, voegt u 10 microliter CD45-microbeads per 10 miljoen totale cellen toe aan de celsuspensie in een centrifugebuis van 15 milliliter. Meng de monsters goed.Gedurende de tijd voor het incuberen van de celsuspensie met microbeads en antilichaammengsel, bereidt u de magnetische scheidingsset voor door de magnetische kolom aan een geschikte magnetische separator te bevestigen en vervolgens een verzamelbuis onder de magnetische kolom te plaatsen. Bereid magnetische kolommen voor door te spoelen met 500 microliter celsorteerbuffer toegevoegd aan de bovenkant van de kolom en laat de buffer passeren. Breng de celsuspensie onmiddellijk aan op de kolom en vermijd luchtbellen, terwijl de celsorteerbuffer passeert.Was de kolom drie keer met 500 microliter celsorteerbuffer. Voeg een milliliter celsorteerbuffer toe aan de kolom. Verwijder de kolom uit de magnetische afscheider en plaats deze op een nieuwe opvangbuis.Spoel de kolom onmiddellijk door de bij de kolom geleverde zuiger stevig aan te brengen om de doorstroming met de magnetisch gelabelde cellen te verkrijgen. Nadat u de niet-gekleurde monster- en compensatiebuizen hebt aangebracht, past u de spanningen van elk kanaal aan om zowel de positieve als de negatieve pieken uit te lijnen met de juiste positie van de as. Stel de gating-strategie in zoals beschreven in het tekstmanuscript met DAPI als levensvatbaarheidsmarker.Controleer de flowcytometriegrafieken om te bevestigen dat de interessante celpopulatie correct wordt weergegeven op de grafieken. Verzamel de gesorteerde cellen in medium of buffer op basis van de noodzaak van volgende experimenten. Om een juiste dissectie te bevestigen, werd de SAN en AVN geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie en Masson's trichrome kleuring.Immunofluorescente kleuring van HCN4-cellen van het positieve geleidingssysteem in de SAN en AVN, evenals Masson's trichrome kleuring van SAN en AVN wordt hier getoond. De gatingstrategie voor celsortering van residente cardiale macrofagen hielp om mononucleaire cellen te identificeren door doubletten in het voorwaartse spreidingsgebied van de y-as versus dat van de x-as uit te sluiten. Dode cellen werden uitgesloten door DAPI.Levende cellen werden afgesloten voor CD45-positieve leukocyten en vervolgens voor CD11b-positieve myeloïde cellen. Cardiale macrofagen werden geïdentificeerd door de expressie van zowel F4/80 als CD64, vervolgens gestratificeerd door lymfocytenantigeen zes expressie. Vers gesorteerde cellen werden waargenomen onder brightfield microscopie.De cellen waren positief voor CD45 wanneer ze werden waargenomen onder het fluorofoor PE-kanaal. Bij observatie onder fluorofoor APC grootte zeven kanaal, toonde hetzelfde beeld van de gesorteerde cellen CD11b-positieve cellen. Het fluorofoor PE-kanaals van grootte zeven werd gebruikt om het F4/80-positieve fenotype te identificeren.En de drievoudige positieve cellen werden geïdentificeerd als cardiale residente macrofagen. Geïsoleerde cardiale macrofagen gekweekt in medium gedurende maximaal zes dagen worden aangegeven met witte pijlen, terwijl de zwarte pijlen dode cellen aangeven. Gesorteerde macrofagen kunnen worden gebruikt voor verdere functionele studies zoals patchklemexperimenten of expressiestudies zoals RNA-sequencing of proteomische studies.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisatie van<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolatie en zuivering van Murine cardiale Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...