Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb, 81Z0600204 à C.S.), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à S. Massberg), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.

Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne. Les souris C57BL6/J ont été obtenues commercialement.
1. Préparatifs
<ol><li>Préparer le tampon de tri des cellules (tableau 1) et conserver à 4 °C. RE...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’enrichissement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement des régions SAN et AVN à haute pureté.
Les macrophages sont divisés en sous-populations en fonction de leur emplacement anatomique et de leur phénotype fonctionnel. Ils peuvent également passer d’un phénotype fonctionnel à un autre en réponse à des signaux microenvironnementaux variables13. Comparativement à d’autres organes comme ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Le nœud sino-auriculaire (SAN) initie physiologiquement l’impulsion électrique et est donc le principal stimulateur cardiaque du cœur. Le nœud auriculo-ventriculaire (AVN) conduit l’impulsion électrique des oreillettes aux ventricules et agit également comme un stimulateur cardiaque auxiliaire1. En général, la génération et la conduction d’impulsions électriques est un processus complexe qui peut être modulé par divers facteurs2, y compris les macrophages résidents dans les régions SAN / AVN. Une étude récente de Hulsmans et al. démontre une population spécifique de macrophages cardiaques résidents qui sont enrichis en AVN et fonctionnent comme des acteurs clés dans le maintien d’un rythme cardiaque régulier3. Ils ont constaté que les macrophages sont couplés électriquement aux cardiomyocytes et pourraient modifier les propriétés électriques des cardiomyocytes couplés. Les auteurs notent également que de telles cellules conductrices s’entrelacent avec les macrophages sont également présentes dans d’autres composants du système de conduction cardiaque, tels que le SAN.
Actuellement, on ne sait pas exactement si le phénotype des macrophages cardiaques résidents diffère entre les régions cardiaques. Cependant, il a été démontré que le microenvironnement tissulaire peut affecter la transcription et le renouvellement prolifératif des macrophages tissulaires4. De plus, puisqu’il a été démontré que le phénotype des cardiomyocytes est différent d’une région à l’autre, les effets fonctionnels des macrophages sur les cardiomyocytes peuvent également être spécifiques à une région, même si le phénotype du macrophage lui-même peut être le même. Par conséquent, d’autres études sur des régions cardiaques spécifiques sont nécessaires.
Des études récentes ont démontré qu’à l’état d’équilibre, les macrophages résidents tissulaires sont établis avant la naissance, apparaissant indépendamment de l’hématopoïèse définitive, et persistent jusqu’à l’âge adulte5. Cependant, après l’épuisement des macrophages ou lors d’une inflammation cardiaque, les monocytes Ly6chi contribuent à reconstituer la population de macrophages cardiaques6. Des études impliquant le traçage génétique de la lignée, la parabiose, la cartographie du destin et le suivi cellulaire ont montré la coexistence d’une variété de populations de macrophages résidents dans les organes et les tissus, ainsi que le comportement cellulaire différent des sous-ensembles de macrophages potentiellement associés à leur ontogenèse 7,8,9.
La caractérisation des macrophages cardiaques résidents a bénéficié de l’utilisation du tri des cellules activées magnétiques (MACS) et du tri des cellules activées par fluorescence. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour isoler des populations cellulaires spécifiques de plusieurs fractions tissulaires en les marquant avec leurs marqueurs de surface cellulaire. Cela conduit non seulement à une plus grande pureté du type de cellule immunitaire isolée, mais permet également une analyse phénotypique. Ici, nous présentons un protocole comprenant des cellules recouvertes de billes magnétiques suivies d’un tri cellulaire activé par fluorescence pour l’enrichissement des macrophages résidents cardiaques spécifiquement isolés de la région SAN et AVN.
Pour explorer les caractéristiques des macrophages cardiaques résidents dans le système de conduction et leur fonction pour la conduction cardiaque et l’arythmogenèse, une localisation et une dissection précises du SAN et de l’AVN sont essentielles. Pour la microdissection du SAN et de l’AVN, des repères anatomiques sont utilisés pour l’identification de la région10. En bref, le SAN est situé à la jonction de la veine cave supérieure et de l’oreillette droite. AVN est situé dans le triangle de Koch, qui est bordé antérieurement par le feuillet septal de la valve tricuspide, et postérieurement par le tendon de Todaro11. Nous fournissons également une procédure de microdissection précise du SAN et de l’AVN chez la souris, confirmée par histologie et coloration par immunofluorescence.
Des macrophages résidents isolés pourraient être utilisés pour d’autres expériences telles que le séquençage de l’ARN ou pourraient être récupérés et cultivés pendant plus de deux semaines, ce qui permettrait diverses expériences in vitro. Par conséquent, notre protocole décrit une procédure très précieuse pour l’immuno-rythmologiste. Le tableau 1 montre la composition de toutes les solutions nécessaires, la figure 1 montre les repères de microdissection pour SAN et AVN. La figure 2 illustre schématiquement la localisation SAN et AVN. La figure 3 montre la coloration histologique du SAN et de l’AVN (coloration trichrome et immunofluorescence de Masson). La figure 4 montre une stratégie de contrôle étape par étape pour isoler les macrophages résidents cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Il a été démontré que les macrophages cardiaques résidents facilitent la conduction électrique dans le cœur. Le rythme cardiaque physiologique est initié par des impulsions électriques générées dans le nœud sino-auriculaire (SAN), puis conduites vers les ventricules via le nœud auriculo-ventriculaire (AVN). Pour étudier plus avant le rôle des macrophages résidents dans le système de conduction cardiaque, une isolation appropriée des macrophages résidents du SAN et de l’AVN est nécessaire, mais cela reste difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour la microdissection fiable du SAN et de l’AVN dans les cœurs murins, suivie de l’isolement et de la culture des macrophages résidents.
Le SAN, situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure, et l’AVN, situé au sommet du triangle de Koch, sont identifiés et microdisséqués. L’emplacement correct est confirmé par l’analyse histologique du tissu réalisée avec la coloration trichrome de Masson et par l’anti-HCN4.
Les tissus microdisséqués sont ensuite digérés par voie enzymatique pour obtenir des suspensions unicellulaires suivies de l’incubation avec un panel spécifique d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire. Cela permet d’identifier, de compter ou d’isoler différentes populations cellulaires par tri cellulaire activé par fluorescence. Pour différencier les macrophages cardiaques résidents des autres cellules immunitaires du myocarde, en particulier des macrophages dérivés de monocytes recrutés, une stratégie de déclenchement délicate est nécessaire. Tout d’abord, les cellules de la lignée lymphoïde sont détectées et exclues d’une analyse plus approfondie. Ensuite, les cellules myéloïdes sont identifiées avec des macrophages résidents déterminés par une expression élevée de CD45 et CD11b, et une faible expression de Ly6C. Avec le tri cellulaire, des macrophages cardiaques isolés peuvent ensuite être cultivés in vitro pendant plusieurs jours pour une étude plus approfondie. Nous décrivons donc un protocole pour isoler les macrophages résidents cardiaques situés dans le système de conduction cardiaque. Nous discutons des pièges de la microdissection et de la digestion du SAN et de l’AVN, et fournissons une stratégie de contrôle pour identifier, compter et trier de manière fiable les macrophages cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.

Nous décrivons une procédure pratique pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement de la région SAN et AVN. Pour confirmer une dissection correcte, la coloration trichrome de Masson et la coloration HCN4 immunofluorescente sont effectuées (Figure 3)12. Avec ce protocole, nous pourrions collecter environ 60 000 macrophages d’un cœur entier. La figure 4 montre la stratégie de contrôle pour le tri des mac...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Le protocole présenté ici fournit une approche étape par étape pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents de la région du ganglion sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) du cœur de souris.

Isolement et culture de macrophages cardiaques résidents du nœud sino-auriculaire murin et auriculo-ventriculaire

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Nous décrivons un protocole pour la microdissection et l’isolement ultérieur des microphages cardiaques résidents par tri cellulaire activé par fluorescence spécifiquement à partir des sinus et des ganglions AV chez la souris. Grâce à la microdissection précise du sinus et du nœud V, suivie de la combinaison du tri cellulaire magnétique et activé par fluorescence, nous sommes en mesure d’isoler spécifiquement les macrophages résidents du sinus et du nœud V avec une grande pureté. L’identification et l’isolement de macrophages résidents cardiaques provenant de régions distinctes du cœur permettent d’étudier davantage leur phénotype et leur impact spécifique à la région sur l’électrophysiologie cardiaque.Après avoir isolé le cœur, effectuer les procédures de microdissection dans une boîte de dissection avec du PBS glacé une fois sous un microscope à dissection. Utilisez des repères anatomiques cardiaques tels que l’aorte, l’artère pulmonaire, les sinus coronaires et le ventricule gauche ou droit pour déterminer le gauche-droit et l’antéro-postérieur du cœur. Une fois l’orientation déterminée, placez le cœur avec l’avant au bas du plat pour exposer les grosses veines postérieures.Couper le long de la rainure entre les ventricules et les oreillettes pour enlever la majorité des ventricules. Conservez la partie auriculaire. Fixez le cœur à la boîte de dissection en insérant des broches à travers la partie restante du mur libre BT et le LAA.Coupez le mur libre de VR restant vers le haut à travers la valve tricuspide et la veine cave supérieure. Retournez le PR et le RV et épinglez le RAA pour exposer la région intercavale de la cavité RA et le septum auriculaire. Pour la microdissection du SAN, couper le cœur le long du septum interauriculaire parallèle à la crista terminalis pour séparer la région intercavale afin d’obtenir l’échantillon SAN.Placez l’échantillon dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour la microdissection de l’AVN, épingler les parties restantes du cœur à travers le tissu adjacent au septum interauriculaire et au septum interventriculaire pour faire face au côté auriculaire droit du septum interauriculaire vers le haut. Regardez l’oreillette droite sur la surface endocardique pour le triangle de Koch qui sera bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide et postérieurement par le tendon de Todaro.L’orifice du sinus coronaire est observé à la base. Hachez le tissu SAN et AVN avec des scalpels. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de digestion fraîchement préparé à chaque échantillon et lavez tous les tissus émincés de la paroi du tube de microcentrifugation.Pipeter doucement pour aider à digérer l’échantillon et homogénéiser le tissu sur une machine à vortex. Après digestion, transférer la suspension tissulaire dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres en la faisant passer à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres. Rincez la passoire cellulaire avec cinq millilitres supplémentaires de tampon de tri cellulaire pour arrêter la digestion.Retirez le surnageant. Après avoir remis en suspension la pastille de cellule avec 90 microlitres de tampon de tri cellulaire, ajoutez 10 microlitres de microbilles CD45 par 10 millions de cellules totales à la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Bien mélanger les échantillons.Pendant le temps d’incubation de la suspension cellulaire avec des microbilles et un mélange d’anticorps, préparer le jeu de séparation magnétique en fixant la colonne magnétique à un séparateur magnétique approprié, puis en plaçant un tube de collecte sous la colonne magnétique. Préparer les colonnes magnétiques en rinçant avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire ajouté en haut de la colonne et en laissant passer le tampon. Appliquez immédiatement la suspension de cellule sur la colonne, en évitant les bulles d’air, pendant le passage du tampon de tri des cellules.Lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire. Ajoutez un millilitre de tampon de tri cellulaire sur la colonne. Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube de collecte.Rincer immédiatement la colonne en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne pour obtenir le flux continu contenant les cellules marquées magnétiquement. Après avoir appliqué l’échantillon non coloré et les tubes de compensation, ajustez les tensions de chaque canal pour aligner les pics positifs et négatifs sur la position correcte de l’axe. Définissez la stratégie de contrôle telle que décrite dans le manuscrit en utilisant DAPI comme marqueur de viabilité.Vérifiez les diagrammes de cytométrie de flux pour confirmer que la population cellulaire d’intérêt est correctement indiquée sur les graphiques. Rassemblez les cellules triées dans un milieu ou un tampon en fonction de la nécessité d’expériences ultérieures. Pour confirmer une dissection correcte, l’identification du SAN et de l’AVN a été effectuée à l’aide d’immunofluorescence et de coloration trichrome de Masson.La coloration immunofluorescente des cellules du système de conduction positive HCN4 dans le SAN et l’AVN, ainsi que la coloration trichrome de Masson du SAN et de l’AVN sont présentées ici. La stratégie de contrôle pour le tri cellulaire des macrophages cardiaques résidents a permis d’identifier les cellules mononucléaires en excluant les doublets dans la zone de diffusion vers l’avant de l’axe des y par rapport à celle de l’axe des x. Les cellules mortes ont été exclues par le DAPI.Les cellules vivantes ont été fermées pour les leucocytes CD45 positifs, puis pour les cellules myéloïdes CD11b positives. Les macrophages cardiaques ont été identifiés par l’expression de F4/80 et de CD64, puis stratifiés par l’expression de l’antigène lymphocytaire six. Des cellules fraîchement triées ont été observées en microscopie à fond clair.Les cellules étaient positives pour CD45 lorsqu’elles ont été observées sous le canal PE fluorophore. Lorsqu’on a observé un fluorophore de taille APC à sept canaux, la même vue des cellules triées a montré des cellules CD11b positives. Le fluorophore PE taille sept canaux a été utilisé pour identifier le phénotype positif F4/80.Et les cellules triples positives ont été identifiées comme des macrophages résidents cardiaques. Les macrophages cardiaques isolés cultivés en milieu jusqu’à six jours sont indiqués par des flèches blanches, tandis que les flèches noires indiquent les cellules mortes. Les macrophages triés peuvent être utilisés pour d’autres études fonctionnelles telles que des expériences de pince patch ou des études d’expression telles que le séquençage de l’ARN ou des études protéomiques.

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