Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל- R. Xia), המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK; 81X2600255 ל- S. Clauss, 81Z0600206 ל- S. Kääb, 81Z0600204 ל- C.S.), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל- S. Massberg), ה- ERA-NET למחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל- S. Clauss) וקרן היינריך ולוטה מולפנצל (ל- S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה של אוניברסיטת מינכן וכל ההליכים שבוצעו על עכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה. עכברי C57BL6/J הושגו באופן מסחרי.
1. הכנות
<ol><li>הכן את מאגר מיון התאים (טבלה 1) ואחסן ב- 4 °C. הערה: במהלך...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול להעשרת מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזורי SAN ו- AVN בטוהר גבוה.
מקרופאגים מחולקים לתת-אוכלוסיות על סמך מיקומם האנטומי והפנוטיפ התפקודי שלהם. הם יכולים גם לעבור מפנוטיפ פונקציונלי אחד למשנהו בתגובה לאותות מיקרו-סביבתיים משתנים13. בהשו...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

הצומת הסינואטריאלי (SAN) יוזם פיזיולוגית את הדחף החשמלי ולכן הוא קוצב הלב העיקרי של הלב. הצומת האטריובנטריקולרי (AVN) מוליך את הדחף החשמלי מהאטריה אל החדרים ופועל גם כקוצב לב בת1. באופן כללי, ייצור והולכה של דחפים חשמליים הוא תהליך מורכב שניתן לווסת על ידי גורמים שונים2, כולל מקרופאגים תושבים באזורי SAN/AVN. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Hulsmans et al. מדגים אוכלוסייה ספציפית של מקרופאגים תושבי לב המועשרים ב- AVN ומתפקדים כשחקני מפתח בשמירה על דופק יציב3. הם מצאו כי מקרופאגים מצומדים חשמלית לקרדיומיוציטים ויכולים לשנות את התכונות החשמליות של קרדיומיוציטים מצומדים. המחברים מציינים גם כי תאים מוליכים כאלה המשולבים עם מקרופאגים נמצאים גם ברכיבים אחרים של מערכת ההולכה הלבבית, כגון SAN.
נכון לעכשיו, לא ידוע אם הפנוטיפ של מקרופאגים לבביים תושבים שונה בין אזורי הלב. עם זאת, הוכח כי מיקרו-סביבה של רקמות יכולה להשפיע על שעתוק והתחדשות שגשוג של מקרופאגים רקמתיים4. יתר על כן, מאחר שפנוטיפ הקרדיומיוציטים הוכח כשונה בין אזורים, ההשפעות התפקודיות של מקרופאגים על קרדיומיוציטים עשויות להיות גם ספציפיות לאזור, גם אם הפנוטיפ של המקרופאגים עצמו עשוי להיות זהה. לכן, יש צורך במחקרים נוספים על אזורי לב ספציפיים.
מחקרים אחרונים הראו כי במצב יציב, המקרופאגים השוכנים ברקמה נקבעים לפני הלידה, נובעים ללא תלות בהמטופויזה סופית, ונמשכים לבגרות5. עם זאת, לאחר דלדול מקרופאגים או במהלך דלקת לב, Ly6cהיי מונוציטים לתרום לחידוש אוכלוסיית מקרופאגים לבביים6. מחקרים שכללו מעקב אחר שושלת גנטית, פרביוזה, מיפוי גורלות ומעקב אחר תאים הראו את הדו-קיום של מגוון אוכלוסיות מקרופאגים תושבי רקמות באיברים וברקמות, וכן, התנהגות תאית שונה של תת-קבוצות מקרופאגים שעשויות להיות קשורות לאונטוגניה שלהם 7,8,9.
האפיון של מקרופאגים לבביים מקומיים נהנה משימוש במיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS) ומיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. שיטות אלה שימושיות במיוחד לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות משברי רקמות מרובים על ידי תיווגם עם סמני פני התא שלהם. זה לא רק מוביל לטוהר גבוה יותר של סוג התא החיסוני המבודד, אלא גם מאפשר ניתוח פנוטיפי. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל תאים מצופים חרוזים מגנטיים ולאחר מכן מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים להעשרת מקרופאגים תושבי לב שבודדו במיוחד מאזור SAN ו- AVN.
כדי לחקור את המאפיינים של מקרופאגים תושבי לב במערכת ההולכה ואת תפקודם עבור הולכה לבבית והפרעות קצב, לוקליזציה מדויקת ודיסקציה של SAN ו- AVN הם קריטיים. עבור מיקרודיסקציה של SAN ו- AVN, ציוני דרך אנטומיים משמשים לזיהוי האזור10. בקצרה, SAN ממוקם בצומת של הווריד הנבוב העליון והאטריום הימני. AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך, אשר גובל קדמית על ידי עלון מחיצה של שסתום tricuspid, ומאחור על ידי הגיד של Todaro11. אנו מספקים גם הליך מיקרו-דיסקציה מדויק של SAN ו- AVN בעכברים אשר אושר על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
מקרופאגים מקומיים מבודדים יכולים לשמש לניסויים נוספים כגון ריצוף RNA או שניתן לשחזר ולטפח אותם במשך יותר משבועיים ולאפשר ניסויים שונים במבחנה. לכן, הפרוטוקול שלנו מתאר הליך בעל ערך רב עבור האימונו-ריתמולוג. טבלה 1 מציגה את ההרכב של כל הפתרונות הדרושים, איור 1 מראה את ציוני הדרך של מיקרו-דיסקציה עבור SAN ו-AVN. איור 2 הוא המחשה סכמטית של לוקליזציה של SAN ו-AVN. איור 3 מראה את הכתמים ההיסטולוגיים של SAN ו-AVN (הכתם הטריכרום והאימונופלואורסצנציה של מאסון). איור 4 מראה אסטרטגיית מיון שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

מקרופאגים לבביים מקומיים הוכחו כמקלים על ההולכה החשמלית בלב. קצב הלב הפיזיולוגי מופעל על ידי דחפים חשמליים הנוצרים בצומת הסינואטרלי (SAN) ולאחר מכן מוליכים אותם לחדרים דרך צומת אטריובנטריקולרי (AVN). כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של מקרופאגים תושבים במערכת הולכת הלב, יש צורך בבידוד נכון של מקרופאגים תושבים מ-SAN ו-AVN, אך הוא עדיין מאתגר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה אמינה של ה-SAN וה-AVN בלבבות מורין ואחריה הבידוד והתרבות של מקרופאגים מקומיים.
שניהם, SAN אשר ממוקם בצומת של crista terminalis עם הווריד הנבוב העליון, ו AVN אשר ממוקם בקצה המשולש של קוך, מזוהים microdissected. מיקום נכון מאושר על ידי ניתוח היסטולוגי של הרקמה המבוצע עם כתם טריכרום של מסון ועל ידי אנטי HCN4.
לאחר מכן, רקמות מיקרו-דיסקרטיות מתעכלות באופן אנזימטי כדי לקבל תרחיפים של תאים בודדים ולאחר מכן הדגירה עם פאנל מסוים של נוגדנים המכוונים נגד סמני פני שטח ספציפיים מסוג תא. זה מאפשר לזהות, לספור או לבודד אוכלוסיות תאים שונות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כדי להבדיל בין מקרופאגים תושבי לב לבין תאים חיסוניים אחרים בשריר הלב, במיוחד מקרופאגים שמקורם במונוציטים, יש צורך באסטרטגיית גיתור עדינה. ראשית, תאי שושלת לימפואידים מזוהים ואינם נכללים בניתוח נוסף. לאחר מכן, תאים מיאלואידים מזוהים עם מקרופאגים מקומיים הנקבעים על ידי ביטוי גבוה של CD45 ו- CD11b, וביטוי נמוך של Ly6C. באמצעות מיון תאים, ניתן לטפח מקרופאגים לבביים מבודדים במבחנה במשך מספר ימים לצורך חקירה נוספת. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד מקרופאגים תושבי לב הממוקמים בתוך מערכת ההולכה הלבבית. אנו דנים במלכודות במיקרו-דיסקציה ובעיכול SAN ו-AVN, ומספקים אסטרטגיית גידור לזיהוי, ספירה ומיון אמינים של מקרופאגים לבביים על-ידי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה.

אנו מתארים הליך מעשי לבידוד של מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזור SAN ו- AVN. כדי לאשר דיסקציה נכונה, מבוצעים צביעת Trichrome של Masson וצביעת HCN4 אימונופלואורסצנטית (איור 3)12. בעזרת פרוטוקול זה יכולנו לאסוף כ-60,000 מקרופאגים מלב שלם אחד. איור 4 מציג את אסטרטגיית ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

אנו מתארים פרוטוקול למיקרודיסקציה ובידוד לאחר מכן של מיקרופגים תושבי לב על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה במיוחד מסינוסים וצומת AV בעכבר. בעזרת המיקרו-דיסקציה המדויקת של הסינוס וצומת ה-V, ולאחריה השילוב של מיון תאים מגנטי ופלואורסצנטי, אנו מסוגלים לבודד באופן ספציפי מקרופאגים מקומיים מהסינוס ומצומת ה-V בטוהר גבוה. זיהוי ובידוד של מקרופאגים תושבי לב מאזורים שונים בלב מאפשר להמשיך ולחקור את הפנוטיפ שלהם ואת ההשפעה הספציפית לאזור שלהם על אלקטרופיזיולוגיה של הלב.לאחר בידוד הלב, בצע את הליכי המיקרודיסקציה בצלחת דיסקציה עם PBS חד פעמי קר כקרח תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בציוני דרך אנטומיים לבביים כגון אבי העורקים, עורק הריאה, הסינוס הכלילי והחדר השמאלי או הימני כדי לקבוע את השמאלי-ימני והקדמי-אחורי של הלב. לאחר קביעת הכיוון, מקם את הלב עם החלק הקדמי בתחתית המנה כדי לחשוף את הוורידים הגדולים האחוריים.חותכים לאורך החריץ בין החדרים לאטריה כדי להסיר את רוב החדרים. שמור על החלק הפרוזדורים. הצמידו את הלב לצלחת הנתיחה על ידי הכנסת פינים דרך החלק הנותר של הקיר החופשי LV וה-LAA.חותכים כלפי מעלה את הדופן נטולת הקרוואנים הנותרים דרך שסתום הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. הפוך את ה-RA וה-RV והצמד את ה-RAA כדי לחשוף את האזור הבין-קברי של חלל ה-RA ואת מחיצת הפרוזדורים. עבור microdissection של SAN, לחתוך את הלב לאורך מחיצה interatrial במקביל crista terminalis כדי להפריד את האזור intercaval כדי לקבל את דגימת SAN.שים את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מיליליטר על קרח. עבור מיקרו-דיסקציה של AVN, הצמד את החלקים הנותרים של הלב דרך הרקמה הסמוכה למחיצת הבין-פרוזדורים ולמחיצה הבין-חדרית כדי להתמודד עם הצד הימני של המחיצה הבין-פרוזדורית כלפי מעלה. התבונן באטריום הימני על פני השטח האנדוקרדיאליים למשולש קוך אשר יהיה גובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של שסתום הטריקוספיד ומאחור על ידי הגיד של טודרו.הפתח של הסינוס הכלילי נצפה בבסיס. טחנו את רקמת ה-SAN וה-AVN עם אזמלים. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ עיכול מוכן טרי לכל דגימה ושטוף את כל הרקמה הטחונה מהקיר של צינור microcentrifuge.פיפטה עדינה כדי לעזור לעכל את הדגימה ולהומוגניזציה של הרקמה במכונת מערבולת. לאחר העיכול, העבר את תרחיף הרקמה לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שטפו את מסננת התאים עם חמישה מיליליטר נוספים של חיץ מיון תאים כדי לעצור את העיכול.הסר את הסופרנטנט. לאחר החייאת גלולת התא עם 90 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים, הוסף 10 מיקרוליטרים של מיקרובידים CD45 לכל 10 מיליון תאים סה"כ לתרחיף התא בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. מערבבים היטב את הדגימות.במהלך הזמן לדגירת ההשעיה התאית עם מיקרובים ותערובת נוגדנים, הכינו את ההפרדה המגנטית שנקבעה על ידי חיבור העמודה המגנטית למפריד מגנטי מתאים ולאחר מכן הצבת צינור איסוף מתחת לעמודה המגנטית. הכינו עמודות מגנטיות על ידי שטיפה עם 500 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים שנוספו בראש העמודה ואפשרו למאגר לעבור. החל את השעיית התא באופן מיידי על העמודה, תוך הימנעות מבועות אוויר, בזמן שמאגר מיון התאים עובר דרכו.לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ מיון תאים. הוסף מיליליטר אחד של מאגר מיון תאים לעמודה. הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והנח אותה על צינור איסוף חדש.שטפו מיד את העמודה על ידי החלת הבוכנה המסופקת עם העמודה כדי לקבל את זרימת הדרך המכילה את התאים המסומנים מגנטית. לאחר החלת צינורות הדגימה והפיצוי שלא הוכתמו, התאם את המתחים של כל ערוץ כדי ליישר את הפסגות החיוביות והשליליות למיקום הנכון של הציר. הגדר את אסטרטגיית ההטיה כמתואר בכתב היד של הטקסט באמצעות DAPI כסמן כדאיות.בדוק את תרשימי הציטומטריה של הזרימה כדי לוודא שאוכלוסיית התאים המעניינים מוצגת כראוי בתרשימים. אסוף את התאים הממוינים למדיום או למאגר בהתבסס על הצורך בניסויים הבאים. כדי לאשר כריתה נכונה, זיהוי ה-SAN וה-AVN נעשה באמצעות צביעת אימונופלואורסצנט וטריכרום של מאסון.צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי מערכת הולכה חיובית HCN4 ב-SAN וב-AVN, כמו גם צביעה טריכרומטית של SAN ו-AVN של Masson מוצגת כאן. אסטרטגיית המיון למיון תאים של מקרופאגים לבביים מקומיים סייעה לזהות תאים חד-גרעיניים על ידי הרחקה של כפילים באזור הפיזור הקדמי של ציר ה-y לעומת זה של ציר ה-x. תאים מתים לא נכללו על ידי DAPI.תאים חיים היו מגודרים עבור לויקוציטים חיוביים ל-CD45, ולאחר מכן עבור תאים מיאלואידים חיוביים ל-CD11b. מקרופאגים לבביים זוהו על ידי ביטוי של F4/80 ו- CD64, ולאחר מכן רובד על ידי ביטוי אנטיגן לימפוציטים שש. תאים ממוינים טריים נצפו תחת מיקרוסקופיה של שדה בהיר.התאים היו חיוביים ל-CD45 כאשר נצפו מתחת לתעלת PE פלואורופור. כאשר נצפתה תחת פלואורופור APC בגודל שבעה ערוצים, אותה תצוגה של התאים הממוינים הראתה תאים חיוביים CD11b. פלואורופור PE בגודל שבעה ערוצים שימש לזיהוי הפנוטיפ החיובי F4/80.והתאים החיוביים המשולשים זוהו כמקרופאגים תושבי הלב. מקרופאגים לבביים מבודדים שגודלו בתרבית בינונית עד שישה ימים מסומנים בחצים לבנים, ואילו החיצים השחורים מציינים תאים מתים. מקרופאגים ממוינים יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים נוספים כגון ניסויי מהדק טלאים או מחקרי הבעה כגון ריצוף RNA או מחקרים פרוטאומיים.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

מיקום, ניתוח וניתוח של גנגליון מורין סטלה

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...