Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

इस कार्य को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी, से आर ज़िया), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस क्लॉस, 81Z0600206 से S. Kab, 81Z0600204 से C.S.S.), कोरोना फाउंडेशन (S199/10079/2019 से S. C. C.S. पांडुलिपि तैयार करने में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।

म्यूनिख विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार पशु देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का आयोजन किया गया था और चूहों पर की गई सभी प्रक्रियाओं को बवेरिया, म्यूनिख, ?...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

इस पांडुलिपि में, हम विशेष रूप से उच्च शुद्धता पर सैन और एवीएन क्षेत्रों से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
मैक्रोफेज को उनके शारीरिक स्थान और का?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

साइनोएट्रियल नोड (सैन) शारीरिक रूप से विद्युत आवेग शुरू करता है और इसलिए, हृदय का प्राथमिक पेसमेकर है। एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) एट्रिया से वेंट्रिकल्स तक विद्युत आवेग का संचालन करता है और सहायक पेसमेकर1 के रूप में भी कार्य करता है। सामान्य तौर पर, विद्युत आवेगों का उत्पादन और चालन एक जटिल प्रक्रिया है जिसे सैन / एवीएन क्षेत्रों में निवासी मैक्रोफेज सहित विभिन्नकारकों 2 द्वारा संशोधित किया जा सकता है। हुल्समैन्स एट अल द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की एक विशिष्ट आबादी प्रदर्शित होती है जो एवीएन में समृद्ध होते हैं औरस्थिर दिल की धड़कन को बनाए रखने में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में कार्य करते हैं। उन्होंने पाया कि मैक्रोफेज कार्डियोमायोसाइट्स के साथ विद्युत रूप से युग्मित होते हैं और युग्मित कार्डियोमायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकते हैं। लेखकों ने यह भी ध्यान दिया कि मैक्रोफेज के साथ इंटरलीविंग ऐसी संचालन कोशिकाएं कार्डियक चालन प्रणाली के अन्य घटकों में भी मौजूद हैं, जैसे कि सैन।
वर्तमान में, यह पूरी तरह से ज्ञात नहीं है कि निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का फेनोटाइप हृदय क्षेत्रों के बीच भिन्न होता है या नहीं। हालांकि, यह दिखाया गया है कि ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट ऊतक मैक्रोफेज4 के प्रतिलेखन और प्रोलिफेरेटिव नवीकरण को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स फेनोटाइप को क्षेत्रों के बीच अलग-अलग दिखाया गया है, कार्डियोमायोसाइट्स पर मैक्रोफेज के कार्यात्मक प्रभाव भी क्षेत्र-विशिष्ट हो सकते हैं, भले ही मैक्रोफेज फेनोटाइप स्वयं समान हो। इसलिए, विशिष्ट हृदय क्षेत्रों पर आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि, स्थिर अवस्था में, ऊतक निवासी मैक्रोफेज प्रसवपूर्व रूप से स्थापित होते हैं, जो निश्चित हेमटोपोइजिस से स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होते हैं, और वयस्कता5 में बने रहते हैं। हालांकि, मैक्रोफेज की कमी के बाद या हृदय की सूजन के दौरान, लाइ6सीहाय मोनोसाइट्स कार्डियक मैक्रोफेज आबादी 6 को फिर से भरनेमें योगदान करते हैं। आनुवंशिक वंश अनुरेखण, पैराबायोसिस, भाग्य मानचित्रण और सेल ट्रैकिंग से जुड़े अध्ययनों ने अंगों और ऊतकों में विभिन्न प्रकार के ऊतक निवासी मैक्रोफेज आबादी के सह-अस्तित्व को दिखाया, और, मैक्रोफेज उपसमुच्चय के विभिन्न सेलुलर व्यवहार जो संभावित रूप से उनके ऑन्टोजेनी 7,8,9 से जुड़े हैं।
निवासी कार्डियक मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन ने चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के उपयोग से लाभ उठाया है। ये विधियां विशेष रूप से विशिष्ट सेल आबादी को उनके सेल सतह मार्करों के साथ लेबल करके कई ऊतक अंशों से अलग करने के लिए उपयोगी हैं। यह न केवल पृथक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की उच्च शुद्धता की ओर जाता है, बल्कि फेनोटाइपिक विश्लेषण की भी अनुमति देता है। यहां, हम विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्र से अलग कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के साथ चुंबकीय मोती-लेपित कोशिकाओं सहित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
चालन प्रणाली में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की विशेषताओं और कार्डियक चालन और अरिदमोजेनेसिस के लिए उनके कार्य का पता लगाने के लिए, सैन और एवीएन का सटीक स्थानीयकरण और विच्छेदन महत्वपूर्ण है। सैन और एवीएन के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, क्षेत्र पहचान10 के लिए शारीरिक स्थलों का उपयोग किया जाता है। संक्षेप में, सैन बेहतर वेना कावा और दाएं आलिंद के जंक्शन पर स्थित है। एवीएन कोच के त्रिकोण के भीतर स्थित है, जो ट्राइकसपिड वाल्व के सेप्टल पत्रक से घिरा हुआ है, और पीछे की ओर टोडारो11 के कण्डरा से घिरा हुआ है। हम चूहों में सैन और एवीएन की एक सटीक सूक्ष्म विच्छेदन प्रक्रिया भी प्रदान करते हैं जो हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की जाती है।
पृथक निवासी मैक्रोफेज का उपयोग आरएनए अनुक्रमण जैसे आगे के प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या विभिन्न इन विट्रो प्रयोगों की अनुमति देने वाले दो सप्ताह से अधिक समय तक पुनर्प्राप्त और खेती की जा सकती है। इसलिए, हमारा प्रोटोकॉल इम्यूनो-रिदमोलॉजिस्ट के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान प्रक्रिया का वर्णन करता है। तालिका 1 आवश्यक सभी समाधानों की संरचना को दर्शाती है, चित्र 1 सैन और एवीएन के लिए माइक्रोडिसेक्शन लैंडमार्क दिखाता है। चित्रा 2 सैन और एवीएन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण है। चित्रा 3 सैन और एवीएन (मैसन के ट्राइक्रोम और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला) के हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन को दर्शाता है। चित्रा 4 प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण गेटिंग रणनीति दिखाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

हृदय में विद्युत चालन को सुविधाजनक बनाने के लिए निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का प्रदर्शन किया गया है। फिजियोलॉजिकल हृदय ताल को सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) में उत्पन्न विद्युत आवेगों द्वारा शुरू किया जाता है और फिर एट्रिओवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) के माध्यम से वेंट्रिकल्स में आयोजित किया जाता है। कार्डियक चालन प्रणाली में निवासी मैक्रोफेज की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, सैन और एवीएन से निवासी मैक्रोफेज का उचित अलगाव आवश्यक है, लेकिन यह चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम निवासी मैक्रोफेज के अलगाव और संस्कृति के बाद मुराइन दिलों में सैन और एवीएन के विश्वसनीय सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
दोनों, सैन जो क्रिस्टा टर्मिनल के जंक्शन पर बेहतर वेना कावा के साथ स्थित है, और एवीएन जो कोच के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है, की पहचान की जाती है और सूक्ष्म विच्छेदन किया जाता है। मैसन के ट्राइक्रोम दाग के साथ और एंटी-एचसीएन 4 द्वारा किए गए ऊतक के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा सही स्थान की पुष्टि की जाती है।
माइक्रोविच्छेदित ऊतकों को तब एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है, जिसके बाद इनक्यूबेशन सेल-प्रकार विशिष्ट सतह मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के एक विशिष्ट पैनल के साथ होता है। यह फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा विभिन्न सेल आबादी की पहचान, गिनती या अलग करने की अनुमति देता है। मायोकार्डियम में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए, विशेष रूप से भर्ती मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, एक नाजुक तैयार गेटिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, लिम्फोइड वंश कोशिकाओं का पता लगाया जाता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। फिर, माइलॉयड कोशिकाओं की पहचान निवासी मैक्रोफेज के साथ की जाती है जो सीडी 45 और सीडी 11 बी दोनों की उच्च अभिव्यक्ति और एलवाई 6 सी की कम अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित की जाती है। सेल सॉर्टिंग के साथ, पृथक कार्डियक मैक्रोफेज को आगे की जांच के लिए कई दिनों तक विट्रो में खेती की जा सकती है। इसलिए, हम कार्डियक चालन प्रणाली के भीतर स्थित कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सैन और एवीएन को माइक्रोडिसेक करने और पचाने में नुकसान पर चर्चा करते हैं, और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक मैक्रोफेज को विश्वसनीय रूप से पहचानने, गिनती करने और सॉर्ट करने के लिए एक गेटिंग रणनीति प्रदान करते हैं।

हम विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्र से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। एक सही विच्छेदन की पुष्टि करने के लिए, मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग और इम्यू...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस दिल के सिनोट्रियल नोड (एसएएन) और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) क्षेत्र से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करता है।

मुराइन सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड से निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का अलगाव और संस्कृति

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

हम विशेष रूप से माउस में साइनस और एवी नोड से फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक निवासी माइक्रोफेज के माइक्रोडिसेक्शन और बाद में अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। साइनस और वी नोड के सटीक माइक्रोडिसेक्शन के साथ, चुंबकीय और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के संयोजन के बाद, हम विशेष रूप से उच्च शुद्धता पर साइनस और वी नोड से निवासी मैक्रोफेज को अलग करने में सक्षम हैं। हृदय में अलग-अलग क्षेत्रों से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की पहचान और अलगाव उनके फेनोटाइप और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर उनके क्षेत्र-विशिष्ट प्रभाव का आगे अध्ययन करने की अनुमति देता है।दिल को अलग करने के बाद, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बर्फ ठंडे एक बार पीबीएस के साथ विच्छेदन डिश में सूक्ष्म विच्छेदन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें। हृदय के बाएं-दाएं और पूर्ववर्ती-पीछे निर्धारित करने के लिए महाधमनी, फुफ्फुसीय धमनी, कोरोनरी साइनस और बाएं या दाएं वेंट्रिकल जैसे हृदय शारीरिक स्थलों का उपयोग करें। अभिविन्यास निर्धारित होने के बाद, पीछे की बड़ी नसों को उजागर करने के लिए डिश के निचले हिस्से में सामने वाले के साथ दिल को रखें।वेंट्रिकल्स के बहुमत को हटाने के लिए वेंट्रिकल्स और एट्रिया के बीच नाली के साथ काटें। एट्रियल भाग रखें। एलवी मुक्त दीवार और एलएए के शेष भाग के माध्यम से पिन डालकर विच्छेदन डिश में हृदय को ठीक करें।शेष आरवी मुक्त दीवार को ट्राइकसपिड वाल्व और बेहतर वेना कावा के माध्यम से ऊपर की ओर काटें। आरए और आरवी को दूर करें और आरए गुहा इंटरकैवल क्षेत्र और एट्रियल सेप्टम को उजागर करने के लिए आरएए को पिन करें। सैन के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, सैन नमूना प्राप्त करने के लिए इंटरकैवल क्षेत्र को अलग करने के लिए क्रिस्टा टर्मिनलिस के समानांतर इंटरट्रियल सेप्टम के साथ दिल को काटें।नमूने को बर्फ पर एक खाली 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। एवीएन के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, इंटरएट्रियल सेप्टम और इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम से सटे ऊतक के माध्यम से हृदय के शेष हिस्सों को पिन करें ताकि इंटरट्रियल सेप्टम के दाहिने एट्रियल पक्ष का सामना किया जा सके। कोच के त्रिकोण के लिए एंडोकार्डियल सतह पर दाएं आलिंद को देखें जो ट्राइकसपिड वाल्व के सेप्टल पत्रक की हिंज रेखा से और पीछे की ओर टोडारो के कण्डरा से घिरा होगा।कोरोनरी साइनस का छिद्र आधार पर देखा जाता है। स्केलपेल के साथ सैन और एवीएन ऊतक कीमा करें। फिर प्रत्येक नमूने में ताजा तैयार पाचन बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार से सभी कीमा ऊतक धो लें।नमूने को पचाने और एक भंवर मशीन पर ऊतक को समरूप बनाने में मदद करने के लिए धीरे से पिपेट। पाचन के बाद, ऊतक निलंबन को 40 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से पारित करके एक ताजा 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पाचन को रोकने के लिए अतिरिक्त पांच मिलीलीटर सेल सॉर्टिंग बफर के साथ सेल स्ट्रेनर को कुल्ला करें।सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सेल छंटाई बफर के 90 माइक्रोलीटर के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करने के बाद, 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन में प्रति 10 मिलियन कुल कोशिकाओं में सीडी 45 माइक्रोबीड्स के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं।माइक्रोबीड्स और एंटीबॉडी मिश्रण के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करने के समय के दौरान, चुंबकीय स्तंभ को एक उपयुक्त चुंबकीय विभाजक से जोड़कर और फिर चुंबकीय स्तंभ के नीचे एक संग्रह ट्यूब रखकर चुंबकीय पृथक्करण सेट तैयार करें। स्तंभ के शीर्ष पर जोड़े गए सेल सॉर्टिंग बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ कुल्ला करके चुंबकीय कॉलम तैयार करें और बफर को गुजरने की अनुमति दें। सेल सस्पेंशन को तुरंत कॉलम पर लागू करें, हवा के बुलबुले से बचें, जबकि सेल सॉर्टिंग बफर गुजर रहा है।कॉलम को सेल सॉर्टिंग बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं। कॉलम पर एक मिलीलीटर सेल सॉर्टिंग बफर जोड़ें। चुंबकीय विभाजक से स्तंभ निकालें और इसे एक नई संग्रह ट्यूब पर रखें।चुंबकीय रूप से लेबल कोशिकाओं वाले प्रवाह-थ्रू को प्राप्त करने के लिए कॉलम के साथ आपूर्ति किए गए प्लंजर को दृढ़ता से लागू करके कॉलम को तुरंत फ्लश करें। बिना दाग वाले नमूने और मुआवजा ट्यूबों को लागू करने के बाद, अक्ष की उचित स्थिति में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों चोटियों को संरेखित करने के लिए प्रत्येक चैनल के वोल्टेज को समायोजित करें। व्यवहार्यता मार्कर के रूप में DAPI का उपयोग करके पाठ पांडुलिपि में वर्णित गेटिंग रणनीति सेट करें।यह पुष्टि करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री चार्ट की जांच करें कि चार्ट पर रुचि की सेल आबादी ठीक से दिखाई गई है। बाद के प्रयोगों की आवश्यकता के आधार पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को मध्यम या बफर में एकत्र करें। एक सही विच्छेदन की पुष्टि करने के लिए, सैन और एवीएन की पहचान इम्यूनोफ्लोरोसेंट और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग का उपयोग करके की गई थी।सैन और एवीएन में एचसीएन 4 सकारात्मक चालन प्रणाली कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन, साथ ही साथ मैसन के सैन और एवीएन के ट्राइक्रोम धुंधलापन यहां दिखाया गया है। निवासी कार्डियक मैक्रोफेज की सेल सॉर्टिंग के लिए गेटिंग रणनीति ने वाई-अक्ष बनाम एक्स-अक्ष के आगे के स्कैटर क्षेत्र में डबल्स के बहिष्करण द्वारा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की पहचान करने में मदद की। DAPI द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया था।सीडी 45 पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स के लिए लाइव कोशिकाओं को गेट किया गया था, फिर सीडी 11 बी पॉजिटिव माइलॉयड कोशिकाओं के लिए। कार्डियक मैक्रोफेज की पहचान एफ 4/80 और सीडी 64 दोनों की अभिव्यक्ति से की गई थी, फिर लिम्फोसाइट एंटीजन छह अभिव्यक्ति द्वारा स्तरीकृत किया गया था। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत ताजा क्रमबद्ध कोशिकाओं को देखा गया था।फ्लोरोफोरे पीई चैनल के तहत देखे जाने पर कोशिकाएं सीडी 45 के लिए सकारात्मक थीं। जब फ्लोरोफोरे एपीसी आकार के सात चैनल के तहत देखा गया, तो क्रमबद्ध कोशिकाओं के एक ही दृश्य ने सीडी 11 बी सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाया। फ्लोरोफोरे पीई आकार सात चैनल का उपयोग एफ 4/80 सकारात्मक फेनोटाइप की पहचान करने के लिए किया गया था।और ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं को कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के रूप में पहचाना गया था। छह दिनों तक मध्यम में संवर्धित पृथक कार्डियक मैक्रोफेज को सफेद तीर के साथ इंगित किया जाता है, जबकि काले तीर मृत कोशिकाओं का संकेत देते हैं। क्रमबद्ध मैक्रोफेज का उपयोग आगे के कार्यात्मक अध्ययनों जैसे पैच क्लैंप प्रयोगों या अभिव्यक्ति अध्ययन जैसे आरएनए अनुक्रमण या प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Murine आइलेट अलगाव और Subcapsular गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए एक विधि

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति और CD133 का अलगाव<sup&gt; +</sup&gt; मेलेनोमा से ख्यात कैंसर स्टेम सेल

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

अलगाव, cryopreservation और संस्कृति नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

के दृश्य<em&gt; स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em&gt; कार्डिएक Microlesions और बाद में कार्डिएक Remodeling के भीतर

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

एक माउस कर्क मॉडल से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और प्रचार

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

यूरीन कार्डिएक पेरिसाइट्स का अलगाव और शुद्धि

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

वयस्क चूहे से एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

एकल Myofiber अलगाव और संस्कृति एमरी के एक Murine मॉडल से-Dreifuss मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जल्दी प्रसव के बाद विकास में

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

स्थान, विच्छेदन, और मुरीन स्टेलेट गैंगलियन का विश्लेषण

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...