Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), l'SFB 914 (progetto Z01 a S. Massberg), l'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.

La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania. I topi C57BL6/J sono stati ottenuti commercialmente.
1. Preparativi
<ol><li>Preparare il buffer di selezione delle celle (Tabella 1) e conservare a 4 °C. NOTA: Durante l'intera proce...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalle regioni SAN e AVN ad alta purezza.
I macrofagi sono divisi in sottopopolazioni in base alla loro posizione anatomica e al fenotipo funzionale. Possono anche passare da un fenotipo funzionale all'altro in risposta a segnali microambientali variabili13. Rispetto ad altri organi come il midollo osseo e il fegato, il tessuto cardiaco contiene una percent...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Il nodo senoatriale (SAN) avvia fisiologicamente l'impulso elettrico ed è, quindi, il pacemaker primario del cuore. Il nodo atrioventricolare (AVN) conduce l'impulso elettrico dagli atri ai ventricoli e funge anche da pacemaker sussidiario1. In generale, la generazione e la conduzione di impulsi elettrici è un processo complesso che può essere modulato da vari fattori2, inclusi i macrofagi residenti nelle regioni SAN / AVN. Un recente studio di Hulsmans et al. dimostra una popolazione specifica di macrofagi residenti cardiaci che sono arricchiti nell'AVN e funzionano come attori chiave nel mantenere un battito cardiaco costante3. Hanno scoperto che i macrofagi sono accoppiati elettricamente ai cardiomiociti e potrebbero cambiare le proprietà elettriche dei cardiomiociti accoppiati. Gli autori osservano inoltre che tali cellule conduttrici che si intercedono con i macrofagi sono presenti anche in altri componenti del sistema di conduzione cardiaca, come il SAN.
Attualmente, non è completamente noto se il fenotipo dei macrofagi cardiaci residenti differisca tra le regioni cardiache. Tuttavia, è stato dimostrato che il microambiente tissutale può influenzare la trascrizione e il rinnovamento proliferativo dei macrofagi tissutali4. Inoltre, poiché è stato dimostrato che il fenotipo dei cardiomiociti è diverso tra le regioni, gli effetti funzionali dei macrofagi sui cardiomiociti possono anche essere specifici per regione, anche se il fenotipo macrofagico stesso può essere lo stesso. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su specifiche regioni cardiache.
Studi recenti hanno dimostrato che, allo stato stazionario, i macrofagi residenti nei tessuti si stabiliscono prenatale, insorgono indipendentemente dall'ematopoiesi definitiva e persistono nell'età adulta5. Tuttavia, dopo deplezione dei macrofagi o durante l'infiammazione cardiaca, glihimonociti Ly6c contribuiscono a ricostituire la popolazione di macrofagi cardiaci6. Gli studi che coinvolgono il tracciamento del lignaggio genetico, la parabiosi, la mappatura del destino e il tracciamento cellulare hanno mostrato la coesistenza di una varietà di popolazioni di macrofagi residenti nei tessuti in organi e tessuti e, inoltre, un diverso comportamento cellulare dei sottogruppi di macrofagi che sono potenzialmente associati alla loro ontogenesi 7,8,9.
La caratterizzazione dei macrofagi cardiaci residenti ha beneficiato dell'uso della selezione delle cellule attivate magnetiche (MACS) e della selezione delle cellule attivate fluorescenti. Questi metodi sono particolarmente utili per isolare specifiche popolazioni cellulari da più frazioni di tessuto etichettandole con i loro marcatori di superficie cellulare. Ciò non solo porta ad una maggiore purezza del tipo di cellula immunitaria isolata, ma consente anche l'analisi fenotipica. Qui, presentiamo un protocollo che include cellule rivestite di perline magnetiche seguite da selezione cellulare attivata fluorescente per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente isolati dalla regione SAN e AVN.
Per esplorare le caratteristiche dei macrofagi residenti cardiaci nel sistema di conduzione e la loro funzione per la conduzione cardiaca e l'aritmogenesi, la localizzazione e la dissezione precise di SAN e AVN sono fondamentali. Per la microdissezione di SAN e AVN, vengono utilizzati punti di riferimento anatomici per l'identificazione della regione10. In breve, SAN si trova all'incrocio della vena cava superiore e dell'atrio destro. AVN si trova all'interno del triangolo di Koch, che è delimitato anteriormente dal foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro11. Forniamo anche un'accurata procedura di microdissezione di SAN e AVN nei topi che è confermata dall'istologia e dalla colorazione con immunofluorescenza.
I macrofagi residenti isolati potrebbero essere utilizzati per ulteriori esperimenti come il sequenziamento dell'RNA o potrebbero essere recuperati e coltivati per più di due settimane consentendo vari esperimenti in vitro. Pertanto, il nostro protocollo descrive una procedura di grande valore per l'immuno-ritmologo. La Tabella 1 mostra la composizione di tutte le soluzioni necessarie, la Figura 1 mostra i punti di riferimento della microdissezione per SAN e AVN. La Figura 2 illustra schematicamente la localizzazione di SAN e AVN. La Figura 3 mostra la colorazione istologica di SAN e AVN (colorazione tricromatica e immunofluorescenza di Masson). La Figura 4 mostra una strategia di gating passo-passo per isolare i macrofagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

È stato dimostrato che i macrofagi cardiaci residenti facilitano la conduzione elettrica nel cuore. Il ritmo cardiaco fisiologico è iniziato da impulsi elettrici generati nel nodo senoatriale (SAN) e quindi condotto ai ventricoli tramite nodo atrioventricolare (AVN). Per studiare ulteriormente il ruolo dei macrofagi residenti nel sistema di conduzione cardiaca, è necessario un adeguato isolamento dei macrofagi residenti da SAN e AVN, ma rimane impegnativo. Qui, forniamo un protocollo per la microdissezione affidabile di SAN e AVN nei cuori murini seguita dall'isolamento e dalla coltura dei macrofagi residenti.
Entrambi, SAN che si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore, e AVN che si trova all'apice del triangolo di Koch, sono identificati e microsezionati. La corretta localizzazione è confermata dall'analisi istologica del tessuto eseguita con la colorazione tricromica di Masson e dall'anti-HCN4.
I tessuti microdissezionati vengono quindi digeriti enzimaticamente per ottenere sospensioni monocellulari seguite dall'incubazione con uno specifico pannello di anticorpi diretti contro marcatori di superficie specifici del tipo cellulare. Ciò consente di identificare, contare o isolare diverse popolazioni cellulari mediante selezione cellulare attivata fluorescente. Per differenziare i macrofagi residenti cardiaci da altre cellule immunitarie nel miocardio, in particolare i macrofagi derivati dai monociti reclutati, è necessaria una delicata strategia di gating ideata. In primo luogo, le cellule della linea linfoide vengono rilevate ed escluse da ulteriori analisi. Quindi, le cellule mieloidi sono identificate con macrofagi residenti determinati dall'alta espressione di CD45 e CD11b e dalla bassa espressione di Ly6C. Con la selezione cellulare, i macrofagi cardiaci isolati possono quindi essere coltivati in vitro per diversi giorni per ulteriori indagini. Descriviamo quindi un protocollo per isolare i macrofagi residenti cardiaci situati all'interno del sistema di conduzione cardiaca. Discutiamo le insidie nella microdissezione e nella digestione di SAN e AVN e forniamo una strategia di gating per identificare, contare e ordinare in modo affidabile i macrofagi cardiaci mediante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Descriviamo una procedura pratica per l'isolamento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalla regione SAN e AVN. Per confermare una corretta dissezione, viene eseguita la colorazione Trichrome di Masson e la colorazione immunofluorescente HCN4 (Figura 3)12. Con questo protocollo, potremmo raccogliere circa 60.000 macrofagi da un cuore intero. La Figura 4 mostra la strategia di gating per l'ordinamento dei macrofagi cardiaci. I m...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Il protocollo qui presentato fornisce un approccio passo-passo per l'isolamento dei macrofagi residenti cardiaci dalla regione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) dei cuori di topo.

Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Descriviamo un protocollo per la microdissezione e il successivo isolamento dei microfagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza specificamente dal seno e dal nodo AV nel topo. Con la precisa microdissezione del seno e del nodo V, seguita dalla combinazione di selezione cellulare magnetica e attivata dalla fluorescenza, siamo in grado di isolare specificamente i macrofagi residenti dal seno e dal nodo V ad alta purezza. L'identificazione e l'isolamento di macrofagi residenti cardiaci da regioni distinte del cuore consente di studiare ulteriormente il loro fenotipo e il loro impatto specifico sulla regione sull'elettrofisiologia cardiaca.Dopo aver isolato il cuore, eseguire le procedure di microdissezione in un piatto di dissezione con PBS ghiacciato una tantum al microscopio da dissezione. Utilizzare punti di riferimento anatomici cardiaci come l'aorta, l'arteria polmonare, il seno coronarico e il ventricolo sinistro o destro per determinare il sinistro-destro e anteriore-posteriore del cuore. Dopo aver determinato l'orientamento, posizionare il cuore con la parte anteriore nella parte inferiore del piatto per esporre le grandi vene posteriori.Tagliare lungo il solco tra i ventricoli e gli atri per rimuovere la maggior parte dei ventricoli. Mantenere la parte atriale. Fissare il cuore al piatto di dissezione inserendo perni attraverso la parte rimanente della parete libera LV e il LAA.Tagliare la parete libera RV rimanente verso l'alto attraverso la valvola tricuspide e la vena cava superiore. Capovolgere RA e RV e fissare il RAA per esporre la regione intercale della cavità RA e il setto atriale. Per la microdissezione di SAN, tagliare il cuore lungo il setto interatriale parallelo alla crista terminalis per separare la regione intercavale per ottenere il campione SAN.Mettere il campione in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 millilitri su ghiaccio. Per la microdissezione di AVN, fissare le parti rimanenti del cuore attraverso il tessuto adiacente al setto interatriale e al setto interventricolare per affrontare il lato atriale destro del setto interatriale verso l'alto. Guarda l'atrio destro sulla superficie endocardica per il triangolo di Koch che sarà delimitato anteriormente dalla linea della cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro.L'orifizio del seno coronarico è osservato alla base. Tritare il tessuto SAN e AVN con bisturi. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di digestione appena preparato a ciascun campione e lavare tutto il tessuto tritato dalla parete del tubo della microcentrifuga.Pipettare delicatamente per aiutare a digerire il campione e omogeneizzare il tessuto su una macchina a vortice. Dopo la digestione, trasferire la sospensione di tessuto in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri facendola passare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Risciacquare il filtro cellulare con altri cinque millilitri di tampone di selezione cellulare per fermare la digestione.Rimuovere il surnatante. Dopo aver risospeso il pellet cellulare con 90 microlitri di tampone di selezione cellulare, aggiungere 10 microlitri di microsfere CD45 per 10 milioni di cellule totali alla sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Mescolare bene i campioni.Durante il periodo di incubazione della sospensione cellulare con microsfere e miscela di anticorpi, preparare il set di separazione magnetica collegando la colonna magnetica a un separatore magnetico adatto e quindi posizionando un tubo di raccolta sotto la colonna magnetica. Preparare le colonne magnetiche risciacquando con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare aggiunto nella parte superiore della colonna e consentendo il passaggio del tampone. Applicare immediatamente la sospensione cellulare sulla colonna, evitando bolle d'aria, mentre il buffer di selezione delle celle sta passando.Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare. Aggiungere un millilitro di buffer di ordinamento delle celle nella colonna. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta.Lavare immediatamente la colonna applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna per ottenere il flusso continuo contenente le celle marcate magneticamente. Dopo aver applicato il campione non colorato e i tubi di compensazione, regolare le tensioni di ciascun canale per allineare sia i picchi positivi che quelli negativi alla posizione corretta dell'asse. Impostare la strategia di gating come descritto nel manoscritto di testo utilizzando DAPI come indicatore di fattibilità.Controllare i grafici di citometria a flusso per confermare che la popolazione cellulare di interesse sia correttamente mostrata sui grafici. Raccogliere le celle ordinate in mezzo o buffer in base alla necessità di esperimenti successivi. Per confermare una corretta dissezione, l'identificazione della SAN e dell'AVN è stata effettuata utilizzando immunofluorescenti e colorazione tricromatica di Masson.La colorazione immunofluorescente delle cellule del sistema di conduzione positiva HCN4 in SAN e AVN, così come la colorazione tricromatica di Masson di SAN e AVN è mostrata qui. La strategia di gating per la selezione cellulare dei macrofagi cardiaci residenti ha aiutato a identificare le cellule mononucleate escludendo i doppietti nell'area di dispersione in avanti dell'asse y rispetto a quella dell'asse x. Le cellule morte sono state escluse dal DAPI.Le cellule vive sono state impiegate per i leucociti CD45 positivi, quindi per le cellule mieloidi CD11b positive. I macrofagi cardiaci sono stati identificati dall'espressione sia di F4/80 che di CD64, quindi stratificati dall'espressione dell'antigene sei dei linfociti. Le cellule appena selezionate sono state osservate al microscopio a campo chiaro.Le cellule erano positive per CD45 quando osservate sotto il canale PE del fluoroforo. Quando osservata sotto fluoroforo APC dimensione sette canali, la stessa vista delle cellule ordinate ha mostrato cellule CD11b positive. Il fluoroforo PE a sette canali è stato utilizzato per identificare il fenotipo F4/80 positivo.E le cellule triple positive sono state identificate come macrofagi residenti cardiaci. I macrofagi cardiaci isolati coltivati in terreno per un massimo di sei giorni sono indicati con frecce bianche, mentre le frecce nere indicano cellule morte. I macrofagi ordinati possono essere utilizzati per ulteriori studi funzionali come esperimenti di patch clamp o studi di espressione come il sequenziamento dell'RNA o studi proteomici.

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