Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
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この研究は、中国奨学金評議会(CSC、R.Xia)、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK、81X2600255からS.クラウス、81Z0600206からS.Kääb、81Z0600204からC.S.)、コロナ財団(S199/10079/2019からS.クラウス)、SFB 914(プロジェクトZ01からS.マスバーグ)、心血管疾患に関するERA-NET(ERA-CVD、01KL1910からS.クラウス)、およびハインリッヒアンドロッテミュールフェンツル財団(S.クラウス)。資金提供者は原稿の準備に何の役割も果たしていませんでした。

動物の世話とすべての実験手順は、ミュンヘン大学の動物の世話と倫理委員会のガイドラインに従って行われ、マウスで行われたすべての手順は、ドイツのミュンヘンにあるバイエルン州政府によって承認されました。C57BL6/Jマウスを商業的に入手した。
1. 事前準備
<ol><li>セルソーティングバッファー(表1)を調製し、4°Cで保存します。 注:実験手順全体?...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

この原稿では、SANおよびAVN領域から特異的に心臓常在マクロファージを高純度で濃縮するためのプロトコルについて説明します。
マクロファージは、解剖学的位置と機能的表現型に基づいて亜集団に分けられます。それらはまた、可変微小環境信号に応答して、ある機能的表現型から別の機能的表現型に切り替えることができる13。骨髄や肝臓などの他...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

洞房結節(SAN)は生理学的に電気インパルスを開始するため、心臓の主要なペースメーカーです。房室結節(AVN)は、心房から心室に電気インパルスを伝導し、補助ペースメーカーとしても機能します1。一般に、電気インパルスの生成と伝導は、SAN/AVN領域に常在するマクロファージを含むさまざまな要因2によって調節できる複雑なプロセスです。Hulsmansらによる最近の研究は、AVNに富み、安定した心拍を維持するための主要なプレーヤーとして機能する心臓常在マクロファージの特定の集団を示しています3。彼らは、マクロファージが心筋細胞と電気的に結合しており、結合した心筋細胞の電気的特性を変化させる可能性があることを発見しました。著者たちはまた、マクロファージとインターリーブするこのような伝導細胞が、SANなどの心臓伝導系の他の構成要素にも存在することも指摘している。
現在、常在する心臓マクロファージの表現型が心臓領域間で異なるかどうかは完全にはわかっていません。しかし、組織微小環境が組織マクロファージの転写および増殖再生に影響を及ぼし得ることが示されている4。さらに、心筋細胞の表現型は領域間で異なることが実証されているため、マクロファージの心筋細胞に対する機能的影響も、マクロファージ表現型自体が同じであっても、領域特異的であり得る。したがって、特定の心臓領域に関するさらなる研究が必要です。
最近の研究では、定常状態では、組織常在マクロファージが出生前に確立され、確定的な造血とは無関係に発生し、成人期まで持続することが示されています5。しかし、マクロファージ枯渇後または心臓炎症中に、Ly6chi単球は心臓マクロファージ集団6の補充に寄与する。遺伝的系統追跡、パラビオシス、運命マッピング、および細胞追跡を含む研究は、臓器や組織にさまざまな組織常在マクロファージ集団が共存していること、および個体発生に関連する可能性のあるマクロファージサブセットの異なる細胞挙動を示しました7,8,9。
常在する心臓マクロファージの特性評価は、磁気活性化細胞選別(MACS)および蛍光活性化細胞選別の使用から恩恵を受けています。これらの方法は、細胞表面マーカーで標識することにより、複数の組織画分から特定の細胞集団を単離するのに特に有用です。これにより、単離された免疫細胞型の純度が高くなるだけでなく、表現型分析も可能になります。ここでは、磁気ビーズでコーティングされた細胞とそれに続く、SANおよびAVN領域から特異的に分離された心臓常在マクロファージの濃縮のための蛍光活性化細胞ソーティングを含むプロトコルを紹介します。
伝導系における心臓常在マクロファージの特徴と、心臓伝導や不整脈形成に対するその機能を探索するためには、SANとAVNの正確な局在と解剖が重要です。SANおよびAVNの微小解剖のために、解剖学的ランドマークが領域識別10に使用される。簡単に言うと、SANは上大静脈と右心房の接合部に位置しています。AVNは、三尖弁の中隔リーフレットによって前方に隣接し、後方にトダロ11の腱によって囲まれているコッホの三角形内に位置しています。また、組織学および免疫蛍光染色によって確認されるマウスのSANおよびAVNの正確なマイクロ解剖手順を提供します。
単離された常在マクロファージは、RNAシーケンシングなどのさらなる実験に使用したり、回収して2週間以上培養したりして、さまざまなin vitro実験を行うことができます。したがって、私たちのプロトコルは、免疫リズム学者にとって非常に価値のある手順を説明しています。 表 1は、必要なすべてのソリューションの構成を示し、 図1 は、SANとAVNのマイクロダイセクションのランドマークを示しています。 図2は、SANとAVNのローカリゼーションの概略 図 です。 図3 は、SANおよびAVNの組織学的染色(マッソントリクロームおよび免疫蛍光染色)を示す。 図4 は、蛍光活性化細胞選別によって心臓常在マクロファージを単離するための段階的なゲーティング戦略を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

常在する心臓マクロファージは、心臓における電気伝導を促進することが実証されている。生理学的な心調律は、洞房結節(SAN)で生成された電気インパルスによって開始され、房室結節(AVN)を介して心室に伝導されます。心臓伝導系における常在マクロファージの役割をさらに研究するには、常在マクロファージをSANおよびAVNから適切に分離する必要がありますが、依然として困難です。ここでは、マウス心臓におけるSANとAVNの信頼性の高いマイクロダイセクションとそれに続く常在マクロファージの単離と培養のためのプロトコルを提供します。
クリスタターミナルと上大静脈の接合部に位置するSANと、コッホの三角形の頂点に位置するAVNの両方が同定され、マイクロディスセクションされます。正しい位置は、マッソンのトリクローム染色および抗HCN4で行われた組織の組織学的分析によって確認されます。
次に、マイクロ解剖組織を酵素的に消化して単一細胞懸濁液を取得し、続いて細胞型特異的表面マーカーに対する抗体の特異的パネルとインキュベートします。これにより、蛍光活性化細胞ソーティングによって異なる細胞集団を同定、カウント、または単離することができる。心臓に常在するマクロファージを心筋内の他の免疫細胞、特に動員された単球由来のマクロファージと区別するには、繊細なゲーティング戦略が必要です。まず、リンパ系譜細胞を検出し、さらなる分析から除外します。次に、骨髄系細胞は、CD45およびCD11bの両方の高発現、およびLy6Cの低発現によって決定される常在マクロファージと同定される。細胞選別により、単離された心臓マクロファージをin vitroで数日間培養し、さらなる調査を行うことができます。したがって、心臓伝導系内にある心臓常在マクロファージを単離するためのプロトコルについて説明します。SANとAVNのマイクロ解剖と消化の落とし穴について説明し、蛍光活性化細胞ソーティングによって心臓マクロファージを確実に識別、カウント、およびソートするためのゲーティング戦略を提供します。

心臓常在型マクロファージを特にSANおよびAVN領域から単離するための実用的な手順について説明します。正しい解剖を確認するために、マッソントリクローム染色と免疫蛍光HCN4染色が行われます(図3)12。このプロトコルでは、1つの心臓全体から約60,000のマクロファージを収集できました。図4は、心臓マクロファージを選別する?...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

ここで紹介するプロトコルは、マウス心臓の洞房結節(SAN)および房室結節(AVN)領域から心臓常在マクロファージを単離するための段階的なアプローチを提供します。

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

マウスの副鼻腔およびAV結節から特異的に蛍光活性化細胞選別することにより、心臓常在マイクロファージのマイクロダイセクションおよびその後の単離のためのプロトコルについて説明します。洞とVリンパ節の正確なマイクロダイセクションとそれに続く磁気活性化細胞ソーティングと蛍光活性化細胞ソーティングの組み合わせにより、副鼻腔とVノードから常在マクロファージを高純度で特異的に分離することができます。心臓の異なる領域からの心臓常在マクロファージの同定と単離により、それらの表現型と心臓電気生理学に対する領域特異的な影響をさらに研究することができます。心臓を単離した後、解剖顕微鏡下で氷冷した1回限りのPBSを備えた解剖皿でマイクロ解剖手順を実行します。大動脈、肺動脈、冠状動脈洞、左心室または右心室などの心臓解剖学的ランドマークを使用して、心臓の左右および前後を決定します。向きが決まったら、心臓を皿の底の前部に配置して、後部の大きな静脈を露出させます。心室と心房の間の溝に沿って切り取り、心室の大部分を取り除きます。心房部分を保管してください。LV自由壁の残りの部分とLAAにピンを挿入して、心臓を解剖皿に固定します。残りのRVフリーウォールを三尖弁と上大静脈を通して上向きに切り取ります。RAとRVを裏返し、RAAを固定して、RA腔の隆起間領域と心房中隔を露出させます。SANのマイクロダイセクションでは、クリスタ終末に平行な心房中隔に沿って心臓を切断し、雌間領域を分離してSANサンプルを取得します。サンプルを氷上の空の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。AVNの微小解離では、心房中隔と心室中隔に隣接する組織を通して心臓の残りの部分を固定し、心房中隔の右側を上に向けます。三尖弁の中隔リーフレットのヒンジラインによって前方に、そして後方にトダロの腱によって縁取られるコッホの三角形の心内膜表面の右心房を見てください。冠状静脈洞の開口部は基部で観察される。SAN組織とAVN組織をメスでミンチします。次に、500マイクロリットルの新たに調製した消化バッファーを各サンプルに加え、マイクロ遠心チューブの壁からすべてのミンチ組織を洗い流します。穏やかにピペットでサンプルを消化し、ボルテックスマシンで組織を均質化します。消化後、組織懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通して、新しい15ミリリットルの遠沈管に移します。さらに5ミリリットルのセルソーティングバッファーでセルストレーナーをすすぎ、消化を停止します。上清を取り除きます。細胞ペレットを90マイクロリットルのセルソーティングバッファーで再懸濁した後、15ミリリットルの遠沈管内の細胞懸濁液に、総細胞1,000万個あたり10マイクロリットルのCD45マイクロビーズを追加します。サンプルをよく混ぜます。細胞懸濁液をマイクロビーズおよび抗体混合物と共にインキュベートする時間の間に、磁気カラムを適切な磁気分離器に取り付け、次いで磁気カラムの下に収集チューブを置くことによって磁気分離セットを調製する。カラムの上部に500マイクロリットルのセルソーティングバッファーを加えてリンスし、バッファーを通過させて磁気カラムを調製します。細胞ソーティングバッファーが通過している間、気泡を避けて細胞懸濁液を直ちにカラムに塗布します。カラムを500マイクロリットルのセルソーティングバッファーで3回洗浄します。1ミリリットルのセルソーティングバッファーをカラムに加えます。磁気分離器からカラムを取り外し、新しい収集チューブに置きます。カラムに付属のプランジャーをしっかりと当てて直ちにカラムを洗い流し、磁気標識されたセルを含むフロースルーを得る。染色されていないサンプルと補正チューブを塗布した後、各チャンネルの電圧を調整して、正と負の両方のピークを軸の適切な位置に合わせます。DAPIを実行可能性マーカーとして使用して、テキスト原稿で説明されているようにゲーティング戦略を設定します。フローサイトメトリーチャートをチェックして、目的の細胞集団がチャートに正しく表示されていることを確認します。選別した細胞を培地またはバッファーに回収し、その後の実験の必要性に基づいて収集します。正しい解剖を確認するために、SANとAVNの同定は、免疫蛍光とマッソンのトリクローム染色を使用して行われました。SANおよびAVNにおけるHCN4陽性伝導系細胞の免疫蛍光染色、ならびにSANおよびAVNのマッソンのトリクローム染色をここに示します。常在する心臓マクロファージの細胞選別のためのゲーティング戦略は、y軸の前方散乱領域とx軸の前方散乱領域のダブレットを除外することにより、単核球を同定するのに役立ちました。死細胞はDAPIによって除外した。生細胞をCD45陽性白血球についてゲーティングし、次いでCD11b陽性骨髄系細胞についてゲーティングした。心臓マクロファージは、F4/80およびCD64の両方の発現によって同定され、次いでリンパ球抗原6発現によって層別化された。新たに選別した細胞を明視野顕微鏡下で観察した。細胞は、フルオロフォアPEチャネルの下で観察された場合、CD45に対して陽性であった。APCサイズ7チャンネルの蛍光色素下で観察した場合、選別された細胞の同じビューはCD11b陽性細胞を示した。蛍光色素PEサイズ7チャンネルを使用して、F4/80陽性表現型を同定しました。そして、このトリプルポジティブ細胞は、心臓常在型マクロファージとして同定された。培地中で最大6日間培養された単離された心臓マクロファージは白い矢印で示され、黒い矢印は死細胞を示します。選別されたマクロファージは、パッチクランプ実験などのさらなる機能研究や、RNAシーケンシングやプロテオミクス研究などの発現研究に使用できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

マウス心ペリサイトの単離と精製

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

成体マウスからの心房筋細胞の単離

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

ネズミ星状神経節の位置、解剖、分析

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...