Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

이 연구는 중국 장학위원회 (CSC, R. Xia), 독일 심혈관 연구 센터 (DZHK; 81X2600255에서 S. Clauss로, 81Z0600206에서 S. Kääb로, 81Z0600204에서 CS), 코로나 재단 (S199/10079/2019에서 S. Clauss까지), SFB 914 (프로젝트 Z01에서 S. Massberg까지), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910에서 S. Clauss까지) 및 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게). 기금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨의 바이에른 정부의 승인을 받았습니다. C57BL6/J 마우스를 상업적으로 입수하였다.
1. 준비
<ol><li>세포 분류 완충액(표 1)을 준비하고 4°C에서 보관한다. 참고: 전체 실험 절차 동안 세포 분류 버퍼는 항상 얼음 위에 있어야 합?...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

이 원고에서, 우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 고순도로 심장 상주 대 식세포를 농축하기위한 프로토콜을 기술한다.
대 식세포는 해부학 적 위치와 기능적 표현형에 따라 하위 집단으로 나뉩니다. 그들은 또한 가변 미세 환경 신호에 반응하여 하나의 기능적 표현형에서 다른 기능적 표현형으로 전환 할 수 있습니다13. 골수 및 간과 같은 다른 기관과 비교?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

동방 결절 (SAN)은 생리 학적으로 전기 충격을 시작하므로 심장의 주요 맥박 조정기입니다. 방실 결절 (AVN)은 심방에서 심실로 전기 충격을 전달하고 보조 심박 조율기1로도 작용합니다. 일반적으로, 전기 충격의 생성 및 전도는 SAN/AVN 영역의 상주 대식세포를 포함하는 다양한 인자2에 의해 조절될 수 있는 복잡한 과정이다. Hulsmans et al.의 최근 연구는 AVN이 풍부하고 꾸준한 심장 박동을 유지하는 데 핵심 역할을 하는 심장 상주 대식세포의 특정 집단을보여줍니다3. 그들은 대 식세포가 심근 세포에 전기적으로 결합되어 결합 된 심근 세포의 전기적 특성을 변화시킬 수 있음을 발견했습니다. 저자들은 또한 대식세포와 인터리빙하는 이러한 전도성 세포가 SAN과 같은 심장 전도 시스템의 다른 구성 요소에도 존재한다는 점에 주목합니다.
현재, 상주 심장 대 식세포의 표현형이 심장 영역마다 다른지 여부는 완전히 알려져 있지 않습니다. 그러나, 조직 미세 환경이 조직 대 식세포의 전사 및 증식 재생에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다4. 또한, 심근세포 표현형이 영역마다 상이한 것으로 입증되었기 때문에, 심근세포에 대한 대식세포의 기능적 효과는 대식세포 표현형 자체가 동일할 수 있다 하더라도 또한 영역-특이적일 수 있다. 따라서 특정 심장 부위에 대한 추가 연구가 필요합니다.
최근 연구에 따르면 정상 상태에서 조직 상주 대식세포는 태아기에 확립되어 최종 조혈과 독립적으로 발생하며 성인기까지지속됩니다5. 그러나, 대식세포 고갈 후 또는 심장 염증 동안, Ly6chi 단핵구는 심장 대식세포 집단을 보충하는데 기여한다6. 유전적 계통 추적, parabiosis, 운명 매핑 및 세포 추적과 관련된 연구는 장기 및 조직에 다양한 조직 상주 대식세포 집단의 공존, 그리고 또한 잠재적으로 그들의 개체 발생과 관련된 대식세포 하위 세트의 상이한 세포 행동을 보여주었다 7,8,9.
상주 심장 대식세포의 특성화는 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류의 사용으로부터 이익을 얻었습니다. 이러한 방법은 세포 표면 마커로 표지하여 여러 조직 분획으로부터 특정 세포 집단을 분리하는 데 특히 유용합니다. 이는 분리된 면역 세포 유형의 순도를 높일 뿐만 아니라 표현형 분석도 가능하게 합니다. 여기에서는 SAN 및 AVN 영역으로부터 특이적으로 분리된 심장 상주 대식세포의 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류와 함께 자성 비드 코팅 세포를 포함하는 프로토콜을 제시합니다.
전도 시스템에서 심장 상주 대식세포의 특성과 심장 전도 및 부정맥 발생에 대한 기능을 탐구하려면 SAN 및 AVN의 정확한 위치 파악 및 해부가 중요합니다. SAN 및 AVN의 미세 해부를 위해, 해부학적 랜드마크가 영역 식별(10)에 사용된다. 간단히 말해서, SAN은 상대 정맥과 우심방의 교차점에 위치합니다. AVN은 Koch의 삼각형 내에 위치하고 있으며, 앞쪽으로는 삼첨판 막의 중격 전단지와 접해 있고 뒤쪽으로는 Todaro11의 힘줄에 의해 접해 있습니다. 우리는 또한 조직학 및 면역 형광 염색으로 확인 된 마우스에서 SAN 및 AVN의 정확한 미세 해부 절차를 제공합니다.
분리된 상주 대식세포는 RNA 시퀀싱과 같은 추가 실험에 사용되거나 다양한 시험관 내 실험을 허용할 수 있도록 2주 이상 회수 및 배양될 수 있습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 면역 리듬 학자에게 매우 가치있는 절차를 설명합니다. 표 1은 필요한 모든 용액의 조성을 보여주고, 도 1 은 SAN 및 AVN에 대한 미세해부 랜드마크를 나타낸다. 도 2 는 SAN 및 AVN 국소화의 개략도이다. 도 3 은 SAN 및 AVN의 조직학적 염색(Masson's trichrome 및 면역형광 염색)을 나타낸다. 도 4 는 형광-활성화 세포 분류에 의해 심장 상주 대식세포를 분리하기 위한 단계별 게이팅 전략을 나타낸다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

상주 심장 대 식세포는 심장에서 전기 전도를 촉진하는 것으로 입증되었습니다. 생리적 심장 리듬은 동방 결절 (SAN)에서 생성 된 전기 충격에 의해 시작된 다음 방실 결절 (AVN)을 통해 심실로 전달됩니다. 심장 전도 시스템에서 상주 대식세포의 역할을 더 연구하려면 SAN 및 AVN에서 상주 대식세포를 적절하게 분리해야 하지만 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 쥐 심장에서 SAN 및 AVN의 신뢰할 수 있는 미세 해부를 위한 프로토콜을 제공하고 상주 대식세포의 분리 및 배양을 제공합니다.
크리스타 터미널과 상대 정맥의 교차점에 위치한 SAN과 Koch의 삼각형 정점에 위치한 AVN이 모두 식별되고 미세 해부됩니다. 정확한 위치는 Masson의 삼색 염색 및 항 -HCN4로 수행 된 조직의 조직 학적 분석에 의해 확인됩니다.
그런 다음 미세 해부 조직을 효소적으로 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포 유형 특정 표면 마커에 대해 지시된 특정 항체 패널과 함께 배양합니다. 이를 통해 형광 활성화 세포 분류를 통해 서로 다른 세포 집단을 식별, 계수 또는 분리할 수 있습니다. 심장 상주 대식세포를 심근의 다른 면역 세포, 특히 모집된 단핵구 유래 대식세포와 구별하기 위해서는 섬세하게 고안된 게이팅 전략이 필요합니다. 첫째, 림프 계통 세포를 검출하고 추가 분석에서 제외합니다. 이어서, 골수성 세포는 CD45 및 CD11b 둘 다의 높은 발현 및 Ly6C의 낮은 발현에 의해 결정되는 상주 대식세포로 확인된다. 세포 분류를 통해 분리된 심장 대식세포를 추가 조사를 위해 며칠 동안 시험관내에서 배양할 수 있습니다. 따라서 우리는 심장 전도 시스템 내에 위치한 심장 상주 대 식세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SAN 및 AVN의 미세 해부 및 소화의 함정에 대해 논의하고 형광 활성화 세포 분류를 통해 심장 대 식세포를 안정적으로 식별, 계수 및 분류하는 게이팅 전략을 제공합니다.

우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 실용적인 절차를 설명합니다. 정확한 해부를 확인하기 위해 Masson의 Trichrome 염색 및 면역 형광 HCN4 염색이 수행됩니다 (그림 3)12. 이 프로토콜을 사용하면 하나의 전체 심장에서 약 60,000 개의 대 식세포를 수집 할 수 있습니다. 도 4는 심장 대식세포를 분류하기 ?...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

우리는 특히 마우스의 부비동 및 AV 노드에서 형광 활성화 세포 분류에 의한 심장 상주 미세 파지의 미세 해부 및 후속 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 부비동과 V 노드의 정확한 미세 해부와 자기 및 형광 활성화 세포 분류의 조합을 통해 부비동과 V 노드에서 상주하는 대식세포를 고순도로 특이적으로 분리할 수 있습니다. 심장의 별개의 영역에서 심장 상주 대 식세포를 식별하고 분리하면 표현형과 심장 전기 생리학에 대한 영역 별 영향을 추가로 연구 할 수 있습니다.심장을 분리 한 후 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 일회성 PBS로 해부 접시에서 미세 해부 절차를 수행하십시오. 대동맥, 폐동맥, 관상 동맥, 좌심실 또는 우심실과 같은 심장 해부학적 랜드마크를 사용하여 심장의 좌우 및 전후방을 결정합니다. 방향이 결정된 후, 접시의 바닥에 앞쪽으로 심장을 위치시켜 뒤쪽의 큰 정맥을 노출시킵니다.심실과 심방 사이의 홈을 따라 잘라 심실의 대부분을 제거하십시오. 심방 부분을 유지하십시오. LV 프리 벽과 LAA의 나머지 부분을 통해 핀을 삽입하여 해부 접시에 심장을 고정합니다.나머지 RV 자유 벽을 삼첨판 막과 상대 정맥을 통해 위쪽으로 자릅니다. RA와 RV를 뒤집고 RAA를 고정하여 RA 캐비티 인터카발 영역과 심방 중격을 노출시킵니다. SAN의 미세 해부의 경우, 크리스타 말단과 평행 한 심방 중격을 따라 심장을 절단하여 CAVAL 영역을 분리하여 SAN 샘플을 얻습니다.얼음 위의 빈 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 샘플을 넣으십시오. AVN의 미세 해부의 경우, 심방 중격 및 심실 중격에 인접한 조직을 통해 심장의 나머지 부분을 고정하여 심방 중격의 우심방을 향하게합니다. 삼첨판 막의 중격 전단지의 힌지 라인에 의해 앞쪽으로, Todaro의 힘줄에 의해 뒤쪽으로 경계가 될 Koch의 삼각형에 대한 심내막 표면의 우심방을보십시오.관상 동맥의 구멍이 기저부에서 관찰됩니다. 메스로 SAN 및 AVN 조직을 다진다. 그런 다음 새로 준비된 500 마이크로 리터의 소화 완충액을 각 샘플에 추가하고 마이크로 원심 분리 튜브의 벽에서 다진 모든 조직을 씻습니다.부드럽게 피펫팅하여 샘플을 소화하고 와류 기계에서 조직을 균질화합니다. 소화 후 조직 현탁액을 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시켜 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 여과기를 추가로 5밀리리터의 세포 분류 완충액으로 헹구어 소화를 중지합니다.상청액을 제거하십시오. 90 마이크로리터의 세포 분류 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨 후, 총 세포 1,000만 개당 10 마이크로리터의 CD45 마이크로비드를 15 밀리리터 원심분리 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다. 샘플을 잘 섞는다.세포 현탁액을 마이크로비드 및 항체 혼합물과 함께 인큐베이션하는 시간 동안, 자성 컬럼을 적합한 자기 분리기에 부착한 다음 자성 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치하여 자기 분리 세트를 준비합니다. 컬럼 상단에 추가된 500마이크로리터의 세포 분류 버퍼로 헹구고 버퍼가 통과하도록 하여 마그네틱 컬럼을 준비합니다. 세포 분류 버퍼가 통과하는 동안 기포를 피하면서 세포 현탁액을 컬럼에 즉시 적용합니다.컬럼을 500 마이크로리터의 세포 분류 완충액으로 3회 세척한다. 1밀리리터의 셀 분류 버퍼를 컬럼에 추가합니다. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 놓습니다.컬럼과 함께 제공된 플런저를 단단히 적용하여 컬럼을 즉시 플러시하여 자기적으로 표지된 세포를 포함하는 플로우 스루를 얻었다. 염색되지 않은 샘플과 보정 튜브를 적용한 후 각 채널의 전압을 조정하여 양극 및 음극 피크를 축의 적절한 위치에 정렬합니다. DAPI를 실행 가능성 마커로 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 게이팅 전략을 설정합니다.유세포 분석 차트를 확인하여 관심 있는 세포 집단이 차트에 제대로 표시되는지 확인합니다. 분류된 세포를 배지 또는 완충액으로 수집하여 후속 실험의 필요성에 기초한다. 정확한 해부를 확인하기 위해 SAN 및 AVN의 식별은 면역 형광 및 Masson의 삼색 염색을 사용하여 수행되었습니다.SAN 및 AVN에서 HCN4 양성 전도 시스템 세포의 면역형광 염색과 SAN 및 AVN의 Masson's 트리크롬 염색이 여기에 표시됩니다. 상주 심장 대 식세포의 세포 분류를위한 게이팅 전략은 y 축의 전방 산란 영역과 x 축의 전방 산란 영역에서 이중선을 배제하여 단핵 세포를 식별하는 데 도움이되었습니다. 죽은 세포는 DAPI에 의해 제외되었습니다.살아있는 세포는 CD45 양성 백혈구에 대해 게이팅되었고, 이어서 CD11b 양성 골수성 세포에 대해 게이트되었습니다. 심장 대식세포는 F4/80 및 CD64 둘 다의 발현에 의해 확인되었고, 이어서 림프구 항원 6 발현에 의해 계층화되었다. 갓 분류된 세포를 명시야 현미경 하에서 관찰하였다.세포는 형광단 PE 채널 하에서 관찰되었을 때 CD45에 대해 양성이었다. APC 크기 7채널 형광단하에서 관찰하였을 때, 정렬된 세포의 동일한 보기는 CD11b 양성 세포를 나타내었다. 형광단 PE 크기 7 채널을 F4/80 양성 표현형을 확인하기 위해 사용하였다.그리고 삼중 양성 세포는 심장 상주 대식세포로 확인되었다. 최대 6 일 동안 배지에서 배양 된 분리 된 심장 대 식세포는 흰색 화살표로 표시되고 검은 색 화살표는 죽은 세포를 나타냅니다. 분류된 대식세포는 패치 클램프 실험과 같은 추가 기능 연구 또는 RNA 시퀀싱 또는 단백질체학 연구와 같은 발현 연구에 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

연구

의학

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

뮤린 스텔레이트 갠리온의 위치, 해부 및 분석

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...