Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i utarbeidelsen av manuskriptet.

Dyrepleie og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care and Ethics committee ved Universitetet i München, og alle prosedyrene som ble utført på mus ble godkjent av regjeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J-mus ble kommersielt oppnådd.
1. Forberedelser
<ol><li>Klargjør cellesorteringsbuffer (tabell 1) og oppbevar ved 4 °C. MERK: Under hele eksperimentprosedyren skal cellesorteringsbufferen alltid være på is.</...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for anrikning av hjertebeboermakrofager spesifikt fra SAN- og AVN-regionene med høy renhet.
Makrofager er delt inn i underpopulasjoner basert på deres anatomiske plassering og funksjonelle fenotype. De kan også bytte fra en funksjonell fenotype til en annen som svar på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer som benmarg og lever, inneholder hjertevev en lavere prosentandel av immunceller og lavere...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Den sinoatriale knuten (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impulsen og er derfor den primære pacemakeren i hjertet. Den atrioventrikulære knuten (AVN) utfører den elektriske impulsen fra atriene til ventriklene og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning av elektriske impulser en kompleks prosess som kan moduleres av ulike faktorer2, inkludert bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig studie av Hulsmans og medarbeidere demonstrerer en spesifikk populasjon av hjertebeboermakrofager som er beriket i AVN og fungerer som nøkkelspillere for å holde et jevnt hjerteslag3. De fant at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytter og kan endre de elektriske egenskapene til koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemerker også at slike ledende celler som går sammen med makrofager, også er tilstede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, som SAN.
Foreløpig er det ikke fullt kjent om fenotypen av bosatte hjertemakrofager varierer mellom hjerteregionene. Det er imidlertid vist at vevsmikromiljøet kan påvirke transkripsjon og proliferativ fornyelse av vevsmakrofager4. Videre, siden kardiomyocyttfenotypen har vist seg å være forskjellig mellom regioner, kan de funksjonelle effektene av makrofager på kardiomyocytter også være regionspesifikke, selv om makrofagfenotypen i seg selv kan være den samme. Derfor er det behov for ytterligere studier på spesifikke hjerteregioner.
Nylige studier har vist at ved steady state etableres vevsbeboermakrofagene prenatalt, som oppstår uavhengig av definitiv hematopoiesis, og vedvarer inn i voksen alder5. Etter uttømming av makrofag eller under hjertebetennelse bidrar imidlertid Ly6c hi-monocytter til å fylle opp hjertemakrofagpopulasjonen6. Studier som involverte genetisk avstamningssporing, parabiose, skjebnekartlegging og cellesporing viste sameksistensen av en rekke populasjoner av vevsboende makrofager i organer og vev, og også forskjellig cellulær oppførsel av makrofagundergrupper som potensielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatte hjertemakrofager har hatt nytte av bruk av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) og fluorescerende aktivert cellesortering. Disse metodene er spesielt nyttige for å isolere spesifikke cellepopulasjoner fra flere vevsfraksjoner ved å merke dem med deres celleoverflatemarkører. Dette fører ikke bare til en høyere renhet av den isolerte immuncelletypen, men tillater også fenotypisk analyse. Her presenterer vi en protokoll som inkluderer magnetiske perlebelagte celler etterfulgt av fluorescerende aktivert cellesortering for anrikning av hjerteboende makrofager spesielt isolert fra SAN- og AVN-regionen.
For å utforske egenskapene til hjertebeboermakrofager i ledningssystemet og deres funksjon for hjerteledning og arytmogenese, er presis lokalisering og disseksjon av SAN og AVN kritisk. For mikrodisseksjon av SAN og AVN brukes anatomiske landemerker for regionidentifikasjon10. Kort sagt, SAN ligger i krysset mellom den overlegne vena cava og høyre atrium. AVN ligger innenfor trekanten Koch, som er fremre avgrenset av septalbrosjyren til tricuspidventilen, og bakre av senen til Todaro11. Vi tilbyr også en nøyaktig mikrodisseksjonsprosedyre for SAN og AVN hos mus som bekreftes av histologi og immunfluorescensfarging.
Isolerte bosatt makrofager kan brukes til videre eksperimenter som RNA-sekvensering eller kan gjenopprettes og dyrkes i mer enn to uker slik at ulike in vitro-eksperimenter kan gjenopprettes. Derfor beskriver vår protokoll en svært verdifull prosedyre for immuno-rytologen. Tabell 1 viser sammensetningen av alle løsningene som trengs, figur 1 viser mikrodisseksjonslandemerkene for SAN og AVN. Figur 2 er skjematisk illustrasjon av SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser histologisk farging av SAN og AVN (Massons trikrom- og immunfluorescensfarging). Figur 4 viser en trinnvis gatingstrategi for å isolere hjertebeboermakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Resident hjerte makrofager har vist seg å lette den elektriske ledningen i hjertet. Den fysiologiske hjerterytmen initieres av elektriske impulser generert i sinoatrialnoden (SAN) og ledes deretter til ventrikler via atrioventrikulær node (AVN). For å studere rollen som bosatt makrofager i hjerteledningssystemet, er det nødvendig med en skikkelig isolasjon av bosatte makrofager fra SAN og AVN, men det er fortsatt utfordrende. Her gir vi en protokoll for pålitelig mikrodisseksjon av SAN og AVN i murine hjerter etterfulgt av isolasjon og kultur av bosatt makrofager.
Både SAN som ligger i krysset mellom crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN som ligger på toppen av trekanten Koch, er identifisert og mikrodissekert. Korrekt plassering bekreftes ved histologisk analyse av vevet utført med Massons trikrome flekk og ved anti-HCN4.
Mikrodissected vev blir deretter enzymatisk fordøyd for å oppnå enkeltcellesuspensjoner etterfulgt av inkubasjon med et spesifikt panel av antistoffer rettet mot celle-type spesifikke overflatemarkører. Dette gjør det mulig å identifisere, telle eller isolere forskjellige cellepopulasjoner ved fluorescerende aktivert cellesortering. For å skille hjertebeboermakrofager fra andre immunceller i myokardiet, spesielt rekrutterte monocyttavledede makrofager, er det nødvendig med en delikat utviklet gatingstrategi. For det første oppdages lymfoide avstamningsceller og utelukkes fra videre analyse. Deretter identifiseres myeloide celler med bosatte makrofager som bestemmes ved høyt uttrykk av både CD45 og CD11b, og lavt uttrykk for Ly6C. Med cellesortering kan isolerte hjertemakrofager deretter dyrkes in vitro over flere dager for videre undersøkelse. Vi beskriver derfor en protokoll for å isolere hjertebeboermakrofager lokalisert i hjertets ledningssystem. Vi diskuterer fallgruver i mikrodissekering og fordøyelse av SAN og AVN, og gir en gating-strategi for pålitelig å identifisere, telle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.

Vi beskriver en praktisk prosedyre for isolering av hjertebeboermakrofager spesifikt fra SAN- og AVN-regionen. For å bekrefte korrekt disseksjon utføres Massons Trichrome-farging og immunfluorescerende HCN4-farging (figur 3)12. Med denne protokollen kunne vi samle omtrent 60 000 makrofager fra ett helt hjerte. Figur 4 viser gatingstrategien for sortering av hjertemakrofager. Hjertemakrofager med levende alder ble identifisert som CD45+C...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Protokollen som presenteres her gir en trinnvis tilnærming for isolering av hjertebeboermakrofager fra sinoatrialnoden (SAN) og atrioventrikulære node (AVN) -regionen av musehjerter.

Isolering og kultur av residente hjertemakrofager fra Murine Sinoatrial og Atrioventrikulær node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Vi beskriver en protokoll for mikrodisseksjon og påfølgende isolering av hjertebeboermikrofager ved fluorescensaktivert cellesortering spesifikt fra sinus og AV-knute i musa. Med den nøyaktige mikrodisseksjonen av sinus og V-knuten, etterfulgt av kombinasjonen av magnetisk og fluorescensaktivert cellesortering, kan vi spesifikt isolere bosatte makrofager fra sinus og V-noden ved høy renhet. Identifisering og isolering av hjertebeboermakrofager fra forskjellige regioner i hjertet gjør det mulig å studere deres fenotype og deres regionspesifikke innvirkning på hjerteelektrofysiologi.Etter å ha isolert hjertet, utfør mikrodisseksjonsprosedyrene i en disseksjonsskål med iskald engangs PBS under et dissekeringsmikroskop. Bruk hjerteanatomiske landemerker som aorta, lungearterie, koronar sinus og venstre eller høyre ventrikel for å bestemme venstre høyre og fremre bakre del av hjertet. Etter at orienteringen er bestemt, plasser hjertet med forsiden på bunnen av parabolen for å eksponere de bakre store venene.Klipp langs sporet mellom ventriklene og atriene for å fjerne flertallet av ventriklene. Behold den atrielle delen. Fest hjertet til disseksjonsskålen ved å sette pinner gjennom den gjenværende delen av LV-fri vegg og LAA.Skjær den gjenværende bobilfrie veggen oppover gjennom trikuspidalklaffen og vena cava superior. Vend RA og RV bort og fest RAA for å eksponere RA hulrom interkaval region og atrieseptum. For mikrodisseksjon av SAN, kutt hjertet langs det interatriale septumet parallelt med crista terminalis for å skille interkavalområdet for å oppnå SAN-prøven.Sett prøven i et tomt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør på is. For mikrodisseksjon av AVN, fest de resterende delene av hjertet gjennom vevet ved siden av interatrial septum og interventrikulær septum for å møte høyre atrieside av interatrial septum opp. Se på høyre atrium på endokardialoverflaten for trekanten Koch som vil bli avgrenset fremre av hengsellinjen i septalbrosjyren til tricuspidventilen og bakre av senen til Todaro.Åpningen av koronar sinus observeres ved basen. Hakk SAN- og AVN-vevet med skalpeller. Tilsett deretter 500 mikroliter nylaget fordøyelsesbuffer til hver prøve og vask alt hakket vev fra veggen av mikrosentrifugerøret.Forsiktig pipette for å fordøye prøven og homogenisere vevet på en virvelmaskin. Etter fordøyelsen, overfør vevssuspensjonen til et nytt 15 milliliter sentrifugerør ved å føre det gjennom en 40 mikrometer cellesil. Skyll cellesilen med ytterligere fem milliliter cellesorteringsbuffer for å stoppe fordøyelsen.Fjern supernatanten. Etter å ha resuspendert cellepelleten med 90 mikroliter cellesorteringsbuffer, tilsett 10 mikroliter CD45-mikroperler per 10 millioner totale celler til cellesuspensjonen i et 15 milliliter sentrifugerør. Bland prøvene godt.I løpet av tiden for inkubering av cellesuspensjonen med mikroperler og antistoffblanding, må du forberede det magnetiske separasjonssettet ved å feste magnetsøylen til en egnet magnetisk separator og deretter plassere et oppsamlingsrør under magnetkolonnen. Forbered magnetiske kolonner ved å skylle med 500 mikroliter cellesorteringsbuffer tilsatt øverst i kolonnen og la bufferen passere gjennom. Påfør cellesuspensjonen umiddelbart på kolonnen, unngå luftbobler, mens cellesorteringsbufferen passerer gjennom.Vask kolonnen tre ganger med 500 mikroliter cellesorteringsbuffer. Legg til en milliliter cellesorteringsbuffer i kolonnen. Fjern kolonnen fra magnetseparatoren og legg den på et nytt oppsamlingsrør.Skyll kolonnen umiddelbart ved å påføre stempelet som følger med kolonnen for å oppnå gjennomstrømningen som inneholder de magnetisk merkede cellene. Etter påføring av de ufargede prøve- og kompensasjonsrørene, juster spenningene til hver kanal for å justere både de positive og negative toppene til riktig posisjon av aksen. Sett gating-strategien som beskrevet i tekstmanuskriptet ved å bruke DAPI som en levedyktighetsmarkør.Kontroller flowcytometridiagrammene for å bekrefte at cellepopulasjonen av interesse er riktig vist på diagrammene. Samle de sorterte cellene i medium eller bufferbasert på behovet for påfølgende eksperimenter. For å bekrefte en korrekt disseksjon ble identifisering av SAN og AVN gjort ved bruk av immunfluorescerende og Massons trikromfarging.Immunfluorescerende farging av HCN4-positive ledningssystemceller i SAN og AVN, samt Massons trikromfarging av SAN og AVN er vist her. Gating-strategien for cellesortering av bosatte hjertemakrofager bidro til å identifisere mononukleære celler ved utelukkelse av dubletter i det fremre spredningsområdet av y-aksen versus x-aksen. Døde celler ble ekskludert av DAPI.Levende celler ble inngjerdet for CD45-positive leukocytter, deretter for CD11b-positive myeloide celler. Kardiale makrofager ble identifisert ved ekspresjon av både F4/80 og CD64, deretter stratifisert ved lymfocyttantigen seks uttrykk. Nysorterte celler ble observert under lysfeltmikroskopi.Cellene var positive for CD45 når de ble observert under fluoroforens PE-kanal. Når det ble observert under fluorofor APC-størrelse syv kanal, viste samme visning av de sorterte cellene CD11b-positive celler. Fluoroforen PE størrelse syv kanal ble brukt til å identifisere F4/80 positiv fenotype.Og de trippelpositive cellene ble identifisert som hjertebeboermakrofager. Isolerte hjertemakrofager dyrket i medium i opptil seks dager er indikert med hvite piler, mens de svarte pilene indikerer døde celler. Sorterte makrofager kan brukes til videre funksjonelle studier som patchklemmeeksperimenter eller ekspresjonsstudier som RNA-sekvensering eller proteomiske studier.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisering av<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innen Hjerte Microlesions og Følgende Cardiac Remo

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolasjon og forplantning av sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering og rensing av murine CARDIAC Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av atrieflimmer myocytter fra voksen mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Single Myofiber isolasjon og kultur fra en murin modell av Emery-Dreifuss muskeldystrofi i tidlig post-natal utvikling

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Plassering, disseksjon og analyse av Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...