Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, para R. Xia), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 para S. Clauss, 81Z0600206 para S. Kääb, 81Z0600204 para CS), a Fundação Corona (S199/10079/2019 para S. Clauss), o SFB 914 (projeto Z01 para S. Massberg), o ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 para S. Clauss) e a Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (para S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.

O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com os Animais da Universidade de Munique e todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha. Camundongos C57BL6/J foram obtidos comercialmente.
1. Preparações
<ol><li>Preparar o buffer de classificação de células (Tabela 1) e armazenar a 4 °C. NOTA: Durante todo o proc...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente das regiões SAN e AVN em alta pureza.
Os macrófagos são divididos em subpopulações com base em sua localização anatômica e fenótipo funcional. Eles também podem mudar de um fenótipo funcional para outro em resposta a sinais microambientais variáveis13. Em comparação com outros órgãos, como medula óssea e fígado, o tecido cardíaco cont?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

O nó sinoatrial (SAN) inicia fisiologicamente o impulso elétrico e é, portanto, o principal marcapasso do coração. O nó atrioventricular (AVN) conduz o impulso elétrico dos átrios para os ventrículos e também atua como marcapasso subsidiário1. Em geral, a geração e condução de impulsos elétricos é um processo complexo que pode ser modulado por vários fatores2, incluindo macrófagos residentes em regiões SAN/AVN. Um estudo recente de Hulsmans et al. demonstra uma população específica de macrófagos residentes cardíacos que são enriquecidos na AVN e funcionam como atores-chave na manutenção de um batimento cardíaco constante3. Eles descobriram que os macrófagos são eletricamente acoplados aos cardiomiócitos e podem alterar as propriedades elétricas dos cardiomiócitos acoplados. Os autores também observam que essas células condutoras que se intercalam com macrófagos também estão presentes em outros componentes do sistema de condução cardíaca, como o SAN.
Atualmente, não se sabe ao máximo se o fenótipo dos macrófagos cardíacos residentes difere entre as regiões cardíacas. No entanto, tem sido demonstrado que o microambiente tecidual pode afetar a transcrição e a renovação proliferativa dos macrófagos teciduais4. Além disso, uma vez que o fenótipo dos cardiomiócitos demonstrou ser diferente entre as regiões, os efeitos funcionais dos macrófagos sobre os cardiomiócitos também podem ser específicos da região, mesmo que o próprio fenótipo dos macrófagos possa ser o mesmo. Portanto, mais estudos sobre regiões cardíacas específicas são necessários.
Estudos recentes têm demonstrado que, no estado estacionário, os macrófagos residentes no tecido são estabelecidos no pré-natal, surgindo independentemente da hematopoiese definitiva, e persistem até a idade adulta5. No entanto, após a depleção de macrófagos ou durante a inflamação cardíaca,os hi monócitos Ly6c contribuem para reabastecer a população de macrófagos cardíacos6. Estudos envolvendo rastreamento genético de linhagem, parabiose, mapeamento de destino e rastreamento celular mostraram a coexistência de uma variedade de populações de macrófagos residentes em tecidos em órgãos e tecidos e, também, diferentes comportamentos celulares de subconjuntos de macrófagos que estão potencialmente associados à sua ontogenia 7,8,9.
A caracterização de macrófagos cardíacos residentes tem se beneficiado do uso da classificação de células ativadas magnéticas (MACS) e da triagem de células ativadas fluorescentes. Esses métodos são particularmente úteis para isolar populações celulares específicas de múltiplas frações teciduais, rotulando-as com seus marcadores de superfície celular. Isso não só leva a uma maior pureza do tipo de célula imune isolada, mas também permite a análise fenotípica. Aqui, apresentamos um protocolo que inclui células revestidas de esferas magnéticas seguidas de triagem de células ativadas fluorescentes para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente isolados da região SAN e AVN.
Para explorar as características dos macrófagos residentes cardíacos no sistema de condução e sua função para condução cardíaca e arritmogênese, a localização precisa e a dissecção da SAN e da AVN são críticas. Para a microdissecção de SAN e AVN, são utilizados marcos anatômicos para a identificação da região10. Em resumo, a SAN está localizada na junção da veia cava superior e do átrio direito. A AVN está localizada dentro do triângulo de Koch, que é anteriormente delimitado pelo folheto septal da valva tricúspide e, posteriormente, pelo tendão de Todaro11. Também fornecemos um procedimento preciso de microdissecção de SAN e AVN em camundongos, que é confirmado por histologia e coloração por imunofluorescência.
Macrófagos residentes isolados poderiam ser usados para experimentos adicionais, como sequenciamento de RNA, ou poderiam ser recuperados e cultivados por mais de duas semanas, permitindo vários experimentos in vitro. Portanto, nosso protocolo descreve um procedimento altamente valioso para o imunorritmologista. A Tabela 1 mostra a composição de todas as soluções necessárias, a Figura 1 mostra os pontos de referência de microdissecção para SAN e AVN. A Figura 2 é uma ilustração esquemática da localização de SAN e AVN. A Figura 3 mostra a coloração histológica de SAN e AVN (coloração tricrômica e imunofluorescência de Masson). A Figura 4 mostra uma estratégia de bloqueio passo a passo para isolar macrófagos residentes cardíacos por meio da classificação celular ativada por fluorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Macrófagos cardíacos residentes demonstraram facilitar a condução elétrica no coração. O ritmo cardíaco fisiológico é iniciado por impulsos elétricos gerados no nó sinoatrial (SAN) e, em seguida, conduzidos aos ventrículos via nó atrioventricular (AVN). Para estudar melhor o papel dos macrófagos residentes no sistema de condução cardíaca, é necessário um isolamento adequado dos macrófagos residentes da SAN e da AVN, mas continua sendo um desafio. Aqui, fornecemos um protocolo para a microdissecção confiável da SAN e AVN em corações murinos seguida pelo isolamento e cultura de macrófagos residentes.
Tanto a SAN, que está localizada na junção da crista terminalis com a veia cava superior, quanto a AVN, que está localizada no ápice do triângulo de Koch, são identificadas e microdissecadas. A localização correta é confirmada pela análise histológica do tecido realizada com a coloração tricrômica de Masson e pelo anti-HCN4.
Os tecidos microdissecados são então digeridos enzimaticamente para obter suspensões unicelulares seguidas pela incubação com um painel específico de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície específicos do tipo celular. Isso permite identificar, contar ou isolar diferentes populações de células por classificação de células ativadas fluorescentes. Para diferenciar macrófagos residentes cardíacos de outras células imunes no miocárdio, especialmente macrófagos derivados de monócitos recrutados, é necessária uma estratégia de gating delicada elaborada. Primeiro, as células da linhagem linfoide são detectadas e excluídas de análises posteriores. Em seguida, as células mieloides são identificadas com macrófagos residentes sendo determinados pela alta expressão de CD45 e CD11b e baixa expressão de Ly6C. Com a classificação celular, macrófagos cardíacos isolados podem então ser cultivados in vitro durante vários dias para uma investigação mais aprofundada. Descrevemos, portanto, um protocolo para isolar macrófagos residentes cardíacos localizados dentro do sistema de condução cardíaca. Discutimos armadilhas na microdissecação e digestão de SAN e AVN, e fornecemos uma estratégia de bloqueio para identificar, contar e classificar de forma confiável os macrófagos cardíacos por triagem celular ativada por fluorescência.

Descrevemos um procedimento prático para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos especificamente da região SAN e AVN. Para confirmar uma dissecção correta, é realizada a coloração tricrômica de Masson e a coloração imunofluorescente de HCN4 (Figura 3)12. Com este protocolo, pudemos coletar aproximadamente 60.000 macrófagos de um coração inteiro. A Figura 4 mostra a estratégia de gating para triagem de macrófagos c...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

O protocolo aqui apresentado fornece uma abordagem passo-a-passo para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos da região do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) de corações de camundongos.

Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Descrevemos um protocolo para microdissecção e subsequente isolamento de micrófagos residentes cardíacos por triagem celular ativada por fluorescência especificamente do seio e do nó AV no camundongo. Com a microdissecção precisa do seio e do nó V, seguida pela combinação de classificação celular magnética e ativada por fluorescência, somos capazes de isolar especificamente macrófagos residentes do seio e do nó V em alta pureza. A identificação e o isolamento de macrófagos residentes cardíacos de regiões distintas do coração permitem estudar melhor seu fenótipo e seu impacto específico da região na eletrofisiologia cardíaca.Depois de isolar o coração, execute os procedimentos de microdissecção em um prato de dissecação com PBS gelado de uma só vez sob um microscópio de dissecação. Use marcos anatômicos cardíacos, como aorta, artéria pulmonar, seio coronariano e ventrículo esquerdo ou direito para determinar a esquerda-direita e anteroposterior do coração. Depois que a orientação for determinada, posicione o coração com a frente na parte inferior do prato para expor as veias grandes posteriores.Corte ao longo do sulco entre os ventrículos e os átrios para remover a maioria dos ventrículos. Mantenha a parte atrial. Fixe o coração ao prato de dissecação inserindo pinos através da parte restante da parede livre de VE e do LAA.Corte a parede livre do VD restante para cima através da valva tricúspide e da veia cava superior. Vire a AR e o VD para longe e fixe o ARA para expor a região intercaval da cavidade da AR e o septo atrial. Para a microdissecção de SAN, corte o coração ao longo do septo interatrial paralelo à crista terminal para separar a região intercaval para obter a amostra de SAN.Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mililitro no gelo. Para a microdissecção da AVN, fixe as partes restantes do coração através do tecido adjacente ao septo interatrial e ao septo interventricular para enfrentar o lado atrial direito do septo interatrial. Olhe para o átrio direito na superfície endocárdica para o triângulo de Koch, que será delimitado anteriormente pela linha da dobradiça do folheto septal da válvula tricúspide e posteriormente pelo tendão de Todaro.O orifício do seio coronário é observado na base. Pique o tecido SAN e AVN com bisturis. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de digestão recém-preparado a cada amostra e lave todo o tecido picado da parede do tubo de microcentrífuga.Pipeta suave para ajudar a digerir a amostra e homogeneizar o tecido em uma máquina de vórtice. Após a digestão, transfira a suspensão do tecido para um tubo de centrífuga fresco de 15 mililitros, passando-o através de um filtro de células de 40 micrômetros. Lave o filtro celular com mais cinco mililitros de tampão de classificação celular para parar a digestão.Remova o sobrenadante. Depois de ressuspender o pellet celular com 90 microlitros de tampão de classificação celular, adicione 10 microlitros de microesferas CD45 por 10 milhões de células totais à suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Misture bem as amostras.Durante o tempo de incubação da suspensão celular com microesferas e mistura de anticorpos, prepare o conjunto de separação magnética anexando a coluna magnética a um separador magnético adequado e, em seguida, colocando um tubo de coleta sob a coluna magnética. Prepare colunas magnéticas enxaguando com 500 microlitros de buffer de classificação celular adicionado na parte superior da coluna e permitindo que o buffer passe. Aplique a suspensão celular imediatamente sobre a coluna, evitando bolhas de ar, enquanto o buffer de classificação de células está passando.Lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de classificação celular. Adicione um mililitro de buffer de classificação de células à coluna. Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.Lavar imediatamente a coluna aplicando firmemente o êmbolo fornecido com a coluna para obter o fluxo que contém as células marcadas magneticamente. Depois de aplicar a amostra não corada e os tubos de compensação, ajuste as tensões de cada canal para alinhar os picos positivo e negativo à posição adequada do eixo. Defina a estratégia de gating conforme descrito no manuscrito do texto usando DAPI como um marcador de viabilidade.Verifique os gráficos de citometria de fluxo para confirmar que a população celular de interesse é mostrada corretamente nos gráficos. Colete as células classificadas em meio ou buffer com base na necessidade de experimentos subsequentes. Para confirmar a dissecção correta, a identificação da SAN e da AVN foi feita por meio da coloração imunofluorescente e tricrômica de Masson.A coloração imunofluorescente de células do sistema de condução HCN4 positivas na SAN e AVN, bem como a coloração tricrômica de SAN e AVN de Masson são mostradas aqui. A estratégia de gating para triagem celular de macrófagos cardíacos residentes ajudou a identificar células mononucleares pela exclusão de duplos na área de dispersão para frente do eixo y versus a do eixo x. As células mortas foram excluídas pelo DAPI.As células vivas foram dependentes de leucócitos CD45 positivos e, em seguida, de células mieloides CD11b positivas. Os macrófagos cardíacos foram identificados pela expressão de F4/80 e CD64, estratificados pela expressão do antígeno linfocitário seis. Células recém-classificadas foram observadas sob microscopia de campo brilhante.As células foram positivas para CD45 quando observadas sob o canal de fluoróforo PE. Quando observado sob fluoróforo APC tamanho sete canal, a mesma visão das células classificadas mostrou células CD11b positivas. O fluoróforo de PE tamanho sete canais foi utilizado para identificar o fenótipo F4/80 positivo.E as células triplas positivas foram identificadas como macrófagos residentes cardíacos. Macrófagos cardíacos isolados cultivados em meio por até seis dias são indicados com setas brancas, enquanto as setas pretas indicam células mortas. Os macrófagos classificados podem ser usados para estudos funcionais adicionais, como experimentos de patch clamp ou estudos de expressão, como sequenciamento de RNA ou estudos proteômicos.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Medicina

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolamento e purificação de Pericytes cardíacos murinos

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Localização, Dissecção e Análise do Gânglio Murine Stellate

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...