Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb, 81Z0600204 для C.S.), Фондом Corona (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для S. Massberg), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, и все процедуры, предпринятые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия. Мыши C57BL6/J были ком?...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

В этой рукописи мы описываем протокол обогащения сердечных резидентных макрофагов конкретно из областей SAN и AVN с высокой чистотой.
Макрофаги делятся на субпопуляции в зависимости от их анатомического расположения и функционального фенотипа. Они также могут переключат?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Синоатриальный узел (SAN) физиологически инициирует электрический импульс и, следовательно, является основным кардиостимулятором сердца. Атриовентрикулярный узел (AVN) проводит электрический импульс от предсердий к желудочкам, а также действует как вспомогательный кардиостимулятор1. В целом, генерация и проведение электрических импульсов является сложным процессом, который может модулироваться различными факторами2, включая резидентный макрофаг в областях SAN/AVN. Недавнее исследование Hulsmans et al. демонстрирует специфическую популяцию сердечных резидентных макрофагов, которые обогащены AVN и функционируют как ключевые игроки в поддержании устойчивого сердцебиения3. Они обнаружили, что макрофаги электрически связаны с кардиомиоцитами и могут изменять электрические свойства связанных кардиомиоцитов. Авторы также отмечают, что такие проводящие клетки, чередующиеся с макрофагами, присутствуют и в других компонентах системы сердечной проводимости, таких как SAN.
В настоящее время до конца не известно, отличается ли фенотип резидентных сердечных макрофагов между сердечными областями. Однако было показано, что микроокружение тканей может влиять на транскрипцию и пролиферативное обновление тканевых макрофагов4. Кроме того, поскольку было продемонстрировано, что фенотип кардиомиоцитов различается между областями, функциональное воздействие макрофагов на кардиомиоциты также может быть специфичным для региона, даже если сам фенотип макрофага может быть одинаковым. Поэтому необходимы дальнейшие исследования конкретных сердечных областей.
Недавние исследования показали, что в устойчивом состоянии тканевые резидентные макрофаги устанавливаются пренатально, возникая независимо от окончательного кроветворения, и сохраняются во взрослом возрасте5. Однако после истощения макрофагов или во время воспаления сердца моноциты Ly6chi способствуют пополнению популяции макрофагов сердца6. Исследования, включающие отслеживание генетической линии, парабиоз, картирование судьбы и отслеживание клеток, показали сосуществование различных популяций макрофагов-резидентов тканей в органах и тканях, а также различное клеточное поведение подмножеств макрофагов, которые потенциально связаны с их онтогенезом 7,8,9.
Характеристика резидентных сердечных макрофагов выиграла от использования магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) и флуоресцентной активированной сортировки клеток. Эти методы особенно полезны для выделения специфических клеточных популяций из нескольких тканевых фракций путем маркировки их маркерами клеточной поверхности. Это не только приводит к более высокой чистоте изолированного типа иммунных клеток, но и позволяет проводить фенотипический анализ. Здесь мы представляем протокол, включающий магнитные клетки, покрытые шариками, с последующей флуоресцентной активированной сортировкой клеток для обогащения сердечных резидентных макрофагов, специально выделенных из области SAN и AVN.
Для изучения характеристик сердечных резидентных макрофагов в проводящей системе и их функции для сердечной проводимости и аритмогенеза решающее значение имеют точная локализация и рассечение SAN и AVN. Для микродиссекции SAN и AVN для идентификации региона10 используются анатомические ориентиры. Короче говоря, SAN расположен на стыке верхней полой вены и правого предсердия. AVN расположен в треугольнике Коха, который спереди граничит с перегородочным листком трикуспидального клапана, а сзади сухожилием Тодаро11. Мы также предоставляем точную процедуру микродиссекции SAN и AVN у мышей, что подтверждается гистологическим и иммунофлуоресцентным окрашиванием.
Изолированные резидентные макрофаги могут быть использованы для дальнейших экспериментов, таких как секвенирование РНК, или могут быть восстановлены и культивированы в течение более двух недель, что позволяет проводить различные эксперименты in vitro. Поэтому наш протокол описывает очень ценную процедуру для иммуноритмолога. В таблице 1 показан состав всех необходимых решений, на рисунке 1 показаны ориентиры микродиссекции для SAN и AVN. На рисунке 2 приведена схематическая иллюстрация локализации SAN и AVN. На рисунке 3 показано гистологическое окрашивание SAN и AVN (трихромное и иммунофлуоресцентное окрашивание Массона). На рисунке 4 показана пошаговая стратегия гатинга для изоляции сердечных резидентных макрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Было продемонстрировано, что резидентные сердечные макрофаги облегчают электрическую проводимость в сердце. Физиологический сердечный ритм инициируется электрическими импульсами, генерируемыми в синоатриальном узле (SAN), а затем проводится к желудочкам через атриовентрикулярный узел (AVN). Для дальнейшего изучения роли резидентных макрофагов в системе сердечной проводимости необходима правильная изоляция резидентных макрофагов от SAN и AVN, но это остается сложной задачей. Здесь мы предоставляем протокол для надежной микродиссекции SAN и AVN в сердцах мышей с последующей изоляцией и культивированием резидентных макрофагов.
Как SAN, который расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, так и AVN, который расположен на вершине треугольника Коха, идентифицируются и микрорассекаются. Правильное расположение подтверждается гистологическим анализом ткани, выполненным с помощью трихромного пятна Массона и анти-HCN4.
Затем микродиссеченные ткани ферментативно перевариваются с получением одноклеточных суспензий с последующей инкубацией со специфической панелью антител, направленных против специфических поверхностных маркеров клеточного типа. Это позволяет идентифицировать, подсчитывать или изолировать различные клеточные популяции с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток. Чтобы дифференцировать сердечные резидентные макрофаги от других иммунных клеток в миокарде, особенно от макрофагов, полученных из моноцитов, необходима деликатная разработанная стратегия гатирования. Во-первых, клетки лимфоидной линии обнаруживаются и исключаются из дальнейшего анализа. Затем миелоидные клетки идентифицируются с резидентными макрофагами, определяемыми высокой экспрессией как CD45, так и CD11b, и низкой экспрессией Ly6C. При сортировке клеток изолированные сердечные макрофаги затем могут культивироваться in vitro в течение нескольких дней для дальнейшего исследования. Поэтому мы описываем протокол выделения сердечных резидентных макрофагов, расположенных в системе сердечной проводимости. Мы обсуждаем подводные камни в микрорассекании и переваривании SAN и AVN, а также предоставляем стратегию захвата для надежной идентификации, подсчета и сортировки сердечных макрофагов с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток.

Описана практическая процедура выделения сердечных резидентных макрофагов конкретно из области SAN и AVN. Для подтверждения правильного рассечения проводится трихромное окрашивание Массона и иммунофлуоресцентное окрашивание HCN4 (рисунок 3)12. С помощью этого...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Протокол, представленный здесь, обеспечивает пошаговый подход к выделению сердечных резидентных макрофагов из области синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) мышечных сердец.

Выделение и культивирование резидентных сердечных макрофагов из мышиного синоатриального и атриовентрикулярного узла

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Описан протокол микродиссекции и последующей изоляции сердечных резидентных микрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток конкретно из синуса и AV-узла у мыши. С помощью точной микродиссекции синуса и V-узла с последующей комбинацией магнитной и флуоресцентно-активированной сортировки клеток мы можем специфически изолировать резидентные макрофаги из синуса и V узла с высокой чистотой. Выявление и выделение сердечных резидентных макрофагов из отдельных областей сердца позволяет дополнительно изучить их фенотип и регионально-специфическое влияние на электрофизиологию сердца.После изоляции сердца выполните процедуры микродиссекции в рассеченной посуде с ледяным холодным одноразовым PBS под рассекающим микроскопом. Используйте анатомические ориентиры сердца, такие как аорта, легочная артерия, коронарный синус, а также левый или правый желудочек, чтобы определить лево-правый и передне-задний отдел сердца. После того, как ориентация определена, расположите сердце спереди на дне тарелки, чтобы обнажить задние крупные вены.Обрежьте вдоль канавки между желудочками и предсердиями, чтобы удалить большинство желудочков. Сохраните предсердную часть. Закрепите сердце на тарелке для рассечения, вставив штифты через оставшуюся часть свободной стенки LV и LAA.Отрежьте оставшуюся свободную стенку RV вверх через трикуспидальный клапан и верхнюю полую вену. Отверните РА и RV в сторону и закрепите РАА, чтобы обнажить межковую область полости РА и межпредсердную перегородку. Для микродиссекции SAN отрежьте сердце вдоль межпредсердной перегородки параллельно crista terminalis, чтобы отделить межковую область для получения образца SAN.Поместите образец в пустую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду. Для микродиссекции AVN закрепите оставшиеся части сердца через ткань, прилегающую к межпредсердной перегородке и межжелудочковой перегородке, чтобы повернуться лицом к правой предсердной стороне межпредсердной перегородки вверх. Посмотрите на правое предсердие на поверхности эндокарда для треугольника Коха, который будет окаймлен спереди шарнирной линией перегородчатого листа трикуспидального клапана и сзади сухожилием Тодаро.Отверстие коронарного синуса наблюдается у основания. Измельчите ткань SAN и AVN скальпелями. Затем добавьте 500 микролитров свежеприготовленного буфера пищеварения к каждому образцу и смойте всю измельченную ткань со стенки трубки микроцентрифуги.Аккуратно пипетку, чтобы помочь переварить образец и гомогенизировать ткань на вихревой машине. После пищеварения перенесите тканевую суспензию в свежую 15-миллилитровую центрифужную трубку, проведя ее через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. Промыть клеточный ситечко дополнительными пятью миллилитрами буфера сортировки клеток, чтобы остановить пищеварение.Удалите супернатант. После повторного использования клеточной гранулы с 90 микролитрами клеточного сортировочного буфера добавьте 10 микролитров микрогранул CD45 на 10 миллионов клеток в клеточную суспензию в 15-миллилитровой центрифужной трубке. Хорошо перемешайте образцы.В течение времени для инкубации клеточной суспензии со смесью микрошариков и антител подготовьте набор магнитного разделения, присоединив магнитную колонну к подходящему магнитному сепаратору и затем поместив под магнитную колонну коллекторную трубку. Подготовьте магнитные колонны, промыв 500 микролитров буфера сортировки ячеек, добавленного в верхней части колонны и позволяющего буферу пройти. Нанесите суспензию ячейки непосредственно на колонку, избегая пузырьков воздуха, в то время как буфер сортировки ячеек проходит.Трижды промыть колонну 500 микролитрами буфера сортировки ячеек. Добавьте в столбец один миллилитр буфера сортировки ячеек. Извлеките колонну из магнитного сепаратора и поместите ее на новую коллекторную трубку.Немедленно промыть колонну, плотно применив плунжер, поставляемый с колонной, чтобы получить сквозной поток, содержащий магнитно меченые ячейки. После применения незапятнанного образца и компенсационных ламп отрегулируйте напряжение каждого канала, чтобы выровнять положительные и отрицательные пики в правильном положении оси. Установите стратегию гатинга, как описано в текстовой рукописи, используя DAPI в качестве маркера жизнеспособности.Проверьте диаграммы проточной цитометрии, чтобы убедиться, что интересующая популяция клеток правильно показана на диаграммах. Соберите отсортированные ячейки в среду или буфер на основе необходимости последующих экспериментов. Чтобы подтвердить правильное рассечение, идентификация SAN и AVN была сделана с использованием иммунофлуоресцентного и трихромного окрашивания Массона.Здесь показано иммунофлуоресцентное окрашивание клеток системы положительной проводимости HCN4 в SAN и AVN, а также трихромное окрашивание МАССОНОМ SAN и AVN. Стратегия сортировки клеток резидентных сердечных макрофагов помогла идентифицировать мононуклеарные клетки путем исключения дублетов в области прямого рассеяния оси Y по сравнению с областью x-оси. Мертвые клетки были исключены DAPI.Живые клетки были закрыты для CD45 положительных лейкоцитов, а затем для CD11b-положительных миелоидных клеток. Сердечные макрофаги были идентифицированы экспрессией как F4/80, так и CD64, а затем стратифицированы экспрессией антигена лимфоцитов шесть. Свежеотсортированные клетки наблюдались при микроскопии яркого поля.Клетки были положительными для CD45 при наблюдении под флуорофорным ПЭ-каналом. При наблюдении под флуорофором APC размером семь каналов, тот же вид отсортированных клеток показал CD11b положительные клетки. Флуорофор размером с семь каналов был использован для идентификации положительного фенотипа F4/80.А тройные положительные клетки были идентифицированы как сердечные резидентные макрофаги. Изолированные сердечные макрофаги, культивируемые в среде до шести дней, обозначены белыми стрелками, в то время как черные стрелки указывают на мертвые клетки. Отсортированные макрофаги могут быть использованы для дальнейших функциональных исследований, таких как эксперименты с зажимом пластыря или исследования экспрессии, такие как секвенирование РНК или протеомные исследования.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133<sup&gt; +</sup&gt; Предполагаемые раковых стволовых клеток от меланомы

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Изоляция, криоконсервации и культура клеток человека Амнион Эпителиальные для клинического применения

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Визуализация<em&gt; Пневмококк</em&gt; В сердечной микроповреждениям и последующих ремоделирования сердца

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Изоляция и очищение моринских кардиологических перицитов

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Изоляция предсердий миоцитов от взрослых мышей

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Одноместный Myofiber изоляции и культуры от Мюрин Модель Эмери-Дрейфус мышечной дистрофии в начале послеродового развития

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Расположение, рассечение и анализ мышиного звездчатого ганглия

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...