Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a S. Massberg), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania. Se obtuvieron comercialmente ratones C57BL6/J.
1. Preparativos
<ol><li>Preparar el tampón de clasificación celular (Tabla 1) y almacenar a 4 °C. NOTA: Durante todo el procedim...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

En este manuscrito, describimos un protocolo para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de las regiones SAN y AVN a alta pureza.
Los macrófagos se dividen en subpoblaciones en función de su ubicación anatómica y fenotipo funcional. También pueden cambiar de un fenotipo funcional a otro en respuesta a señales microambientales variables13. En comparación con otros órganos como la médula ósea y el hígado, el tejido cardíaco co...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

El nódulo sinoauricular (SAN) inicia fisiológicamente el impulso eléctrico y, por lo tanto, es el marcapasos primario del corazón. El nódulo auriculoventricular (AVN) conduce el impulso eléctrico desde las aurículas hasta los ventrículos y también actúa como un marcapasos subsidiario1. En general, la generación y conducción de impulsos eléctricos es un proceso complejo que puede ser modulado por varios factores2, incluyendo macrófagos residentes en regiones SAN/AVN. Un estudio reciente de Hulsmans et al. demuestra una población específica de macrófagos cardíacos residentes que se enriquecen en la AVN y funcionan como actores clave para mantener un latido cardíaco constante3. Encontraron que los macrófagos están acoplados eléctricamente a los cardiomiocitos y podrían cambiar las propiedades eléctricas de los cardiomiocitos acoplados. Los autores también señalan que tales células conductoras que se entrelazan con los macrófagos también están presentes en otros componentes del sistema de conducción cardíaca, como el SAN.
Actualmente, no se sabe completamente si el fenotipo de los macrófagos cardíacos residentes difiere entre las regiones cardíacas. Sin embargo, se ha demostrado que el microambiente tisular puede afectar la transcripción y renovación proliferativa de los macrófagos tisulares4. Además, dado que se ha demostrado que el fenotipo de los cardiomiocitos es diferente entre regiones, los efectos funcionales de los macrófagos sobre los cardiomiocitos también pueden ser específicos de la región, incluso si el fenotipo de macrófagos en sí puede ser el mismo. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre regiones cardíacas específicas.
Estudios recientes han demostrado que, en estado estacionario, los macrófagos residentes en el tejido se establecen prenatalmente, surgiendo independientemente de la hematopoyesis definitiva, y persisten en la edad adulta5. Sin embargo, después del agotamiento de macrófagos o durante la inflamación cardíaca, los monocitosLy6c hi contribuyen a reponer la población de macrófagos cardíacos6. Los estudios que involucran el rastreo genético del linaje, la parabiosis, el mapeo del destino y el seguimiento celular mostraron la coexistencia de una variedad de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos en órganos y tejidos, y, también, diferentes comportamientos celulares de subconjuntos de macrófagos que están potencialmente asociados con su ontogenia 7,8,9.
La caracterización de macrófagos cardíacos residentes se ha beneficiado del uso de la clasificación de células activadas magnéticas (MACS) y la clasificación de células activadas fluorescentes. Estos métodos son particularmente útiles para aislar poblaciones celulares específicas de múltiples fracciones de tejido al etiquetarlas con sus marcadores de superficie celular. Esto no solo conduce a una mayor pureza del tipo de célula inmune aislada, sino que también permite el análisis fenotípico. Aquí, presentamos un protocolo que incluye células recubiertas de perlas magnéticas seguidas de clasificación de células activadas fluorescentes para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente aislados de la región SAN y AVN.
Para explorar las características de los macrófagos residentes cardíacos en el sistema de conducción y su función para la conducción cardíaca y la arritmogénesis, la localización y disección precisas de SAN y AVN son críticas. Para la microdisección de SAN y AVN, se utilizan puntos de referencia anatómicos para la identificación de la región10. En resumen, SAN se encuentra en la unión de la vena cava superior y la aurícula derecha. AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch, que está bordeado anteriormente por la valva septal de la válvula tricúspide, y posteriormente por el tendón de Todaro11. También proporcionamos un procedimiento preciso de microdisección de SAN y AVN en ratones que se confirma mediante histología y tinción de inmunofluorescencia.
Los macrófagos residentes aislados podrían usarse para experimentos adicionales, como la secuenciación de ARN, o podrían recuperarse y cultivarse durante más de dos semanas, lo que permitiría varios experimentos in vitro. Por lo tanto, nuestro protocolo describe un procedimiento muy valioso para el inmunorritmo. La Tabla 1 muestra la composición de todas las soluciones necesarias, la Figura 1 muestra los puntos de referencia de microdisección para SAN y AVN. La Figura 2 es una ilustración esquemática de la localización de SAN y AVN. La Figura 3 muestra la tinción histológica de SAN y AVN (tinción tricrómica e inmunofluorescencia de Masson). La Figura 4 muestra una estrategia de activación paso a paso para aislar macrófagos residentes cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Se ha demostrado que los macrófagos cardíacos residentes facilitan la conducción eléctrica en el corazón. El ritmo cardíaco fisiológico se inicia por impulsos eléctricos generados en el nódulo sinoauricular (SAN) y luego se conducen a los ventrículos a través del nódulo auriculoventricular (AVN). Para estudiar más a fondo el papel de los macrófagos residentes en el sistema de conducción cardíaca, es necesario un aislamiento adecuado de los macrófagos residentes de SAN y AVN, pero sigue siendo un desafío. Aquí, proporcionamos un protocolo para la microdisección confiable de la RAS y AVN en corazones murinos seguido del aislamiento y cultivo de macrófagos residentes.
Tanto el SAN que se encuentra en la unión de la crista terminalis con la vena cava superior, como AVN, que se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, están identificados y microdisecados. La localización correcta se confirma mediante el análisis histológico del tejido realizado con tinción tricrómica de Masson y por anti-HCN4.
Los tejidos microdisecados se digieren enzimáticamente para obtener suspensiones de células individuales seguidas de la incubación con un panel específico de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos de tipo celular. Esto permite identificar, contar o aislar diferentes poblaciones celulares mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Para diferenciar los macrófagos residentes cardíacos de otras células inmunes en el miocardio, especialmente los macrófagos derivados de monocitos reclutados, se necesita una estrategia de activación delicada diseñada. Primero, las células de linaje linfoide se detectan y se excluyen de un análisis adicional. Luego, las células mieloides se identifican con macrófagos residentes que se determinan por la alta expresión de CD45 y CD11b, y la baja expresión de Ly6C. Con la clasificación celular, los macrófagos cardíacos aislados se pueden cultivar in vitro durante varios días para una mayor investigación. Por lo tanto, describimos un protocolo para aislar macrófagos residentes cardíacos ubicados dentro del sistema de conducción cardíaca. Discutimos las trampas en la microdisección y digestión de SAN y AVN, y proporcionamos una estrategia de compuerta para identificar, contar y clasificar de manera confiable los macrófagos cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Describimos un procedimiento práctico para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de la región SAN y AVN. Para confirmar una disección correcta, se realiza la tinción tricrómica de Masson y la tinción inmunofluorescente de HCN4 (Figura 3)12. Con este protocolo, podríamos recolectar aproximadamente 60,000 macrófagos de un corazón completo. La figura 4 muestra la estrategia de compuerta para clasificar...

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Describimos un protocolo para la microdisección y posterior aislamiento de microfagos residentes cardíacos mediante la clasificación celular activada por fluorescencia específicamente a partir de los senos paranasales y el nodo AV en el ratón. Con la microdisección precisa del seno y el nodo V, seguida de la combinación de clasificación celular magnética y activada por fluorescencia, podemos aislar específicamente los macrófagos residentes del seno y el nodo V con alta pureza. La identificación y el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de distintas regiones del corazón permite estudiar más a fondo su fenotipo y su impacto específico de la región en la electrofisiología cardíaca.Después de aislar el corazón, realice los procedimientos de microdisección en una placa de disección con PBS helado de una sola vez bajo un microscopio de disección. Use puntos de referencia anatómicos cardíacos como la aorta, la arteria pulmonar, el seno coronario y el ventrículo izquierdo o derecho para determinar la izquierda-derecha y la parte anterior-posterior del corazón. Después de determinar la orientación, coloque el corazón con la parte delantera en la parte inferior del plato para exponer las venas grandes posteriores.Corte a lo largo del surco entre los ventrículos y las aurículas para extirpar la mayoría de los ventrículos. Mantenga la parte auricular. Fije el corazón a la placa de disección insertando alfileres a través de la parte restante de la pared libre de LV y el LAA.Corte la pared libre de RV restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide y la vena cava superior. Voltee la AR y la RV y fije la RAA para exponer la región intercava de la cavidad de la AR y el tabique auricular. Para la microdisección de la RAS, corte el corazón a lo largo del tabique interauricular paralelo a la crista terminal para separar la región intercava y obtener la muestra SAN.Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 mililitros sobre hielo. Para la microdisección de AVN, fije las partes restantes del corazón a través del tejido adyacente al tabique interauricular y al tabique interventricular para mirar hacia el lado auricular derecho del tabique interauricular hacia arriba. Mire la aurícula derecha en la superficie endocárdica para el triángulo de Koch que estará bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide y posteriormente por el tendón de Todaro.El orificio del seno coronario se observa en la base. Picar el tejido SAN y AVN con bisturís. Luego agregue 500 microlitros de tampón de digestión recién preparado a cada muestra y lave todo el tejido picado de la pared del tubo de microcentrífuga.Pipetear suavemente para ayudar a digerir la muestra y homogeneizar el tejido en una máquina de vórtice. Después de la digestión, transfiera la suspensión de tejido a un tubo centrífugo fresco de 15 mililitros pasándolo a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Enjuague el colador celular con cinco mililitros adicionales de tampón de clasificación celular para detener la digestión.Retire el sobrenadante. Después de resuspender el pellet celular con 90 microlitros de tampón de clasificación celular, agregue 10 microlitros de microperlas CD45 por 10 millones de células totales a la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Mezclar bien las muestras.Durante el tiempo de incubación de la suspensión celular con microperlas y mezcla de anticuerpos, prepare el conjunto de separación magnética conectando la columna magnética a un separador magnético adecuado y luego colocando un tubo de recolección debajo de la columna magnética. Prepare las columnas magnéticas enjuagando con 500 microlitros de tampón de clasificación celular agregado en la parte superior de la columna y permitiendo que el tampón pase. Aplique la suspensión celular inmediatamente sobre la columna, evitando burbujas de aire, mientras pasa el tampón de clasificación celular.Lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de clasificación celular. Agregue un mililitro de búfer de clasificación celular a la columna. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección.Enjuague inmediatamente la columna aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna para obtener el flujo que contiene las celdas marcadas magnéticamente. Después de aplicar la muestra no teñida y los tubos de compensación, ajuste los voltajes de cada canal para alinear los picos positivos y negativos a la posición correcta del eje. Establezca la estrategia de acceso como se describe en el manuscrito de texto utilizando DAPI como marcador de viabilidad.Verifique los diagramas de citometría de flujo para confirmar que la población celular de interés se muestra correctamente en los gráficos. Recopile las células clasificadas en medio o tampón según la necesidad de experimentos posteriores. Para confirmar una disección correcta, la identificación de la RAS y AVN se realizó mediante inmunofluorescencia y tinción tricrómica de Masson.Aquí se muestra la tinción inmunofluorescente de las células del sistema de conducción positiva HCN4 en el SAN y AVN, así como la tinción tricrómica de Masson de SAN y AVN. La estrategia de compuerta para la clasificación celular de macrófagos cardíacos residentes ayudó a identificar células mononucleares mediante la exclusión de dobletes en el área de dispersión hacia adelante del eje y frente a la del eje x. Las células muertas fueron excluidas por DAPI.Las células vivas fueron cerradas para leucocitos CD45 positivos, luego para células mieloides CD11b positivas. Los macrófagos cardíacos se identificaron mediante la expresión de F4/80 y CD64, luego se estratificaron mediante la expresión del antígeno linfocítico seis. Se observaron células recién clasificadas bajo microscopía de campo claro.Las células fueron positivas para CD45 cuando se observaron bajo el canal de PE fluoróforo. Cuando se observó bajo el fluoróforo APC tamaño siete canales, la misma vista de las células clasificadas mostró células CD11b positivas. Se utilizó el fluoróforo PE tamaño siete canales para identificar el fenotipo positivo F4/80.Y las células triple positivas se identificaron como macrófagos residentes cardíacos. Los macrófagos cardíacos aislados cultivados en medio durante un máximo de seis días se indican con flechas blancas, mientras que las flechas negras indican células muertas. Los macrófagos ordenados se pueden utilizar para otros estudios funcionales, como experimentos de pinza de parche o estudios de expresión, como secuenciación de ARN o estudios proteómicos.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

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Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Investigación

Medicina

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