Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Detta arbete stöddes av China Scholarship Council (CSC, till R. Xia), det tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss, 81Z0600206 till S. Kääb, 81Z0600204 till CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 till S. Massberg), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss) och Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptförberedelserna.

Djurvård och alla experimentella förfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna från djurvårds- och etikkommittén vid universitetet i München och alla förfaranden som genomfördes på möss godkändes av regeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J-möss erhölls kommersiellt.
1. Förberedelser
<ol><li>Förbered cellsorteringsbufferten (tabell 1) och förvara vid 4 °C. OBS: Under hela experimentproceduren bör cellsorteringsbufferten alltid vara på is....

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

I detta manuskript beskriver vi ett protokoll för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt från SAN- och AVN-regionerna vid hög renhet.
Makrofager är indelade i delpopulationer baserat på deras anatomiska läge och funktionella fenotyp. De kan också växla från en funktionell fenotyp till en annan som svar på variabla mikromiljösignaler13. Jämfört med andra organ som benmärg och lever innehåller hjärtvävnad en lägre andel immunceller och lägre abs...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Den sinoatriella noden (SAN) initierar fysiologiskt den elektriska impulsen och är därför hjärtats primära pacemaker. Den atrioventrikulära noden (AVN) leder den elektriska impulsen från förmaken till ventriklarna och fungerar också som en underordnad pacemaker1. I allmänhet är generering och ledning av elektriska impulser en komplex process som kan moduleras av olika faktorer2, inklusive bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. visar en specifik population av hjärtboende makrofager som är berikade i AVN och fungerar som nyckelspelare för att hålla en stadig hjärtslag3. De fann att makrofager är elektriskt kopplade till kardiomyocyterna och kan förändra de elektriska egenskaperna hos kopplade kardiomyocyter. Författarna noterar också att sådana ledande celler som interfolierar med makrofager också finns i andra komponenter i hjärtledningssystemet, såsom SAN.
För närvarande är det inte helt känt om fenotypen hos bosatta hjärtmakrofager skiljer sig mellan hjärtregionerna. Det har emellertid visats att vävnadsmikromiljön kan påverka transkription och proliferativ förnyelse av vävnadsmakrofager4. Eftersom kardiomyocytfenotypen har visat sig vara olika mellan regioner kan makrofagernas funktionella effekter på kardiomyocyter också vara regionspecifika, även om makrofagfenotypen i sig kan vara densamma. Därför behövs ytterligare studier om specifika hjärtregioner.
Nya studier har visat att vid steady state etableras de vävnadsboende makrofagerna prenatalt, uppstår oberoende av definitiv hematopoiesis och kvarstår i vuxen ålder5. Men efter makrofagutarmning eller under hjärtinflammation bidrar Ly6chi-monocyter till att fylla på hjärtmakrofagpopulationen6. Studier som involverade genetisk härstamningsspårning, parabios, ödekartläggning och cellspårning visade samexistensen av en mängd olika vävnadsboende makrofagpopulationer i organ och vävnader, och även olika cellulära beteenden hos makrofagundergrupper som potentiellt är associerade med deras ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatta hjärtmakrofager har gynnats av användningen av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) och fluorescerande aktiverad cellsortering. Dessa metoder är särskilt användbara för att isolera specifika cellpopulationer från flera vävnadsfraktioner genom att märka dem med sina cellytmarkörer. Detta leder inte bara till en högre renhet av den isolerade immuncelltypen, utan möjliggör också fenotypisk analys. Här presenterar vi ett protokoll inklusive magnetiska pärlor-belagda celler följt av fluorescerande aktiverad cellsortering för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt isolerade från SAN- och AVN-regionen.
För att utforska egenskaperna hos hjärtboende makrofager i ledningssystemet och deras funktion för hjärtledning och arytmogenes är exakt lokalisering och dissektion av SAN och AVN avgörande. För mikrodissektion av SAN och AVN används anatomiska landmärken för regionidentifiering10. I korthet ligger SAN vid korsningen av den överlägsna vena cava och högra atriumet. AVN ligger inom triangeln i Koch, som är främre gränsad av tricuspidventilens septalbroschyr och bakre av senan i Todaro11. Vi tillhandahåller också en exakt mikrodissektionsprocedur av SAN och AVN hos möss som bekräftas av histologi och immunofluorescensfärgning.
Isolerade bosatta makrofager kan användas för ytterligare experiment som RNA-sekvensering eller kan återvinnas och odlas i mer än två veckor vilket möjliggör olika in vitro-experiment. Därför beskriver vårt protokoll ett mycket värdefullt förfarande för immunrytmologen. Tabell 1 visar sammansättningen av alla lösningar som behövs, figur 1 visar mikrodissektionsmärkena för SAN och AVN. Figur 2 är schematisk illustration av SAN- och AVN-lokalisering. Figur 3 visar den histologiska färgningen av SAN och AVN (Massons trikrom- och immunofluorescensfärgning). Figur 4 visar en steg-för-steg-grindstrategi för att isolera hjärtboende makrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Bosatta hjärtmakrofager har visat sig underlätta den elektriska ledningen i hjärtat. Den fysiologiska hjärtrytmen initieras av elektriska impulser som genereras i sinoatriell nod (SAN) och leds sedan till ventriklar via atrioventrikulär nod (AVN). För att ytterligare studera rollen som bosatta makrofager i hjärtledningssystemet är en korrekt isolering av bosatta makrofager från SAN och AVN nödvändig, men det är fortfarande utmanande. Här tillhandahåller vi ett protokoll för tillförlitlig mikrodissektion av SAN och AVN i murina hjärtan följt av isolering och kultur av bosatta makrofager.
Båda, SAN som ligger vid korsningen av crista terminalis med den överlägsna vena cava, och AVN som ligger vid toppen av triangeln i Koch, identifieras och mikrodissekeras. Korrekt placering bekräftas genom histologisk analys av vävnaden utförd med Massons trikromfläck och av anti-HCN4.
Mikrodissekerade vävnader smälts sedan enzymatiskt för att erhålla encellssuspensioner följt av inkubation med en specifik panel av antikroppar riktade mot celltypspecifika ytmarkörer. Detta gör det möjligt att identifiera, räkna eller isolera olika cellpopulationer genom fluorescerande aktiverad cellsortering. För att skilja hjärtboende makrofager från andra immunceller i myokardiet, särskilt rekryterade monocyt-härledda makrofager, behövs en delikat utformad gatingstrategi. Först detekteras lymfoida härstamningsceller och utesluts från vidare analys. Därefter identifieras myeloida celler med bosatta makrofager som bestäms av högt uttryck av både CD45 och CD11b och lågt uttryck av Ly6C. Med cellsortering kan isolerade hjärtmakrofager sedan odlas in vitro under flera dagar för vidare undersökning. Vi beskriver därför ett protokoll för att isolera hjärtboende makrofager som finns i hjärtledningssystemet. Vi diskuterar fallgropar vid mikrodissekering och smältning av SAN och AVN, och tillhandahåller en grindstrategi för att på ett tillförlitligt sätt identifiera, räkna och sortera hjärtmakrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.

Vi beskriver ett praktiskt förfarande för isolering av hjärtboende makrofager specifikt från SAN- och AVN-regionen. För att bekräfta en korrekt dissektion utförs Massons trikromfärgning och immunofluorescerande HCN4-färgning (figur 3)12. Med detta protokoll kunde vi samla cirka 60 000 makrofager från ett helt hjärta. Figur 4 visar grindstrategin för sortering av hjärtmakrofager. Levande bosatta hjärtmakrofager identifierades...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Protokollet som presenteras här ger en steg-för-steg-metod för isolering av hjärtboende makrofager från sinoatriell nod (SAN) och atrioventrikulär nod (AVN) region av mushjärtan.

Isolering och kultur av bosatta hjärtmakrofager från murin sinoatriell och atrioventrikulär nod

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Vi beskriver ett protokoll för mikrodissektion och efterföljande isolering av hjärtboende mikrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering specifikt från sinus och AV-nod i musen. Med den exakta mikrodissektion av sinus och V-noden, följt av kombinationen av magnetisk och fluorescensaktiverad cellsortering, kan vi specifikt isolera bosatta makrofager från sinus och V-noden vid hög renhet. Identifiering och isolering av hjärtboende makrofager från distinkta regioner i hjärtat gör det möjligt att ytterligare studera deras fenotyp och deras regionspecifika inverkan på hjärtelektrofysiologi.Efter att ha isolerat hjärtat, utför mikrodissektionsprocedurerna i en dissektionsskål med iskall engångs-PBS under ett dissekerande mikroskop. Använd hjärtanatomiska landmärken som aorta, lungartär, koronar sinus och vänster eller höger kammare för att bestämma vänster-höger och främre-bakre delen av hjärtat. När orienteringen är bestämd, placera hjärtat med framsidan längst ner på skålen för att exponera de bakre stora venerna.Skär längs spåret mellan ventriklarna och förmaken för att ta bort majoriteten av ventriklarna. Behåll förmaksdelen. Fäst hjärtat på dissektionsskålen genom att sätta in stift genom den återstående delen av LV-fri vägg och LAA.Skär den återstående husbilsfria väggen uppåt genom tricuspidventilen och överlägsen vena cava. Vänd bort RA och RV och fäst RAA för att exponera RA-kavitetens interkavalregion och förmaksseptum. För mikrodissektion av SAN, skär hjärtat längs det interatriella septumet parallellt med crista terminalis för att separera intercavalregionen för att erhålla SAN-provet.Lägg provet i ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is. För mikrodissektion av AVN, stift de återstående delarna av hjärtat genom vävnaden intill interatrial septum och interventrikulär septum för att möta den högra förmakssidan av interatrial septum uppåt. Titta på det högra atriumet på endokardialytan för triangeln av Koch som kommer att gränsas främre av gångjärnslinjen i septalbladet på tricuspidventilen och bakre av todaros sena.Öppningen av koronar sinus observeras vid basen. Hacka SAN- och AVN-vävnaden med skalpeller. Tillsätt sedan 500 mikroliter nyberedd matsmältningsbuffert till varje prov och tvätta all malet vävnad från mikrocentrifugrörets vägg.Pipettera försiktigt för att hjälpa till att smälta provet och homogenisera vävnaden på en virvelmaskin. Efter matsmältningen, överför vävnadssuspensionen till ett nytt 15 ml centrifugrör genom att leda det genom en 40 mikrometer cellsil. Skölj cellsilen med ytterligare fem milliliter cellsorteringsbuffert för att stoppa matsmältningen.Ta bort supernatanten. Efter att ha återsuspenderat cellpelleten med 90 mikroliter cellsorteringsbuffert, tillsätt 10 mikroliter CD45-mikrober per 10 miljoner totala celler till cellsuspensionen i ett 15 ml centrifugrör. Blanda proverna väl.Under tiden för inkubation av cellsuspensionen med mikropärlor och antikroppsblandning, förbered den magnetiska separationsuppsättningen genom att fästa magnetkolonnen på en lämplig magnetisk separator och sedan placera ett uppsamlingsrör under magnetkolonnen. Förbered magnetiska kolumner genom att skölja med 500 mikroliter cellsorteringsbuffert tillsatt högst upp i kolonnen och låta bufferten passera igenom. Applicera cellsuspensionen omedelbart på kolonnen och undvik luftbubblor medan cellsorteringsbufferten passerar igenom.Tvätta kolonnen tre gånger med 500 mikroliter cellsorteringsbuffert. Lägg till en milliliter cellsorteringsbuffert i kolumnen. Ta bort kolonnen från magnetavskiljaren och placera den på ett nytt uppsamlingsrör.Spola omedelbart kolonnen genom att applicera kolven som medföljer kolonnen ordentligt för att erhålla genomströmningen som innehåller de magnetiskt märkta cellerna. Efter applicering av de ofärgade prov- och kompensationsrören, justera spänningarna för varje kanal för att justera både de positiva och negativa topparna till rätt position för axeln. Ställ in grindstrategin enligt beskrivningen i textmanuskriptet med DAPI som en viabilitetsmarkör.Kontrollera flödescytometridiagrammen för att bekräfta att cellpopulationen av intresse visas korrekt på diagrammen. Samla de sorterade cellerna i medium eller buffertbaserat på behovet av efterföljande experiment. För att bekräfta en korrekt dissektion gjordes identifiering av SAN och AVN med hjälp av immunofluorescerande och Massons trikromfärgning.Immunofluorescerande färgning av HCN4-positiva ledningssystemceller i SAN och AVN, liksom Massons trikromfärgning av SAN och AVN visas här. Gating-strategin för cellsortering av bosatta hjärtmakrofager hjälpte till att identifiera mononukleära celler genom uteslutning av dubbletter i y-axelns främre spridningsområde kontra x-axelns. Döda celler uteslöts av DAPI.Levande celler gated för CD45-positiva leukocyter, sedan för CD11b-positiva myeloida celler. Hjärtmakrofager identifierades genom uttrycket av både F4/80 och CD64 och stratifierades sedan av lymfocytantigen sexuttryck. Nysorterade celler observerades under ljusfältsmikroskopi.Cellerna var positiva för CD45 när de observerades under fluoroforen PE-kanalen. När den observerades under fluorophore APC-storlek sju kanal, visade samma vy av de sorterade cellerna CD11b-positiva celler. Fluoroforen PE storlek sju kanal användes för att identifiera F4/80 positiva fenotypen.Och de trippelpositiva cellerna identifierades som hjärtboende makrofager. Isolerade hjärtmakrofager odlade i medium i upp till sex dagar indikeras med vita pilar, medan de svarta pilarna indikerar döda celler. Sorterade makrofager kan användas för ytterligare funktionella studier såsom patch clamp-experiment eller uttrycksstudier som RNA-sekvensering eller proteomiska studier.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisering av<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Inom Cardiac små sår och efterföljande hjärt ombyggnad

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolering och förökning av cirkulerande tumörceller från en mus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering och rening av murina hjärt pericyter

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av Förmaksmyocyter från vuxna möss

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Single Myofiber isolering och kultur från en Murine modell av Emery-Dreifuss muskeldystrofi i tidig postnatal utveckling

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Plats, dissekering och analys av Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...