Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia'ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss'a, 81Z0600206'dan S. Kääb'a, 81Z0600204'ten C.S.'ye), Corona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), SFB 914 (Z01'den S. Massberg'e), Kardiyovasküler Hastalıklar Üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss'a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır. C57BL6/J fareler ticari olarak elde edildi.
1. Hazırlıklar
<ol><li>Hücre sıralama arabelleğini hazırlayın (Tablo 1) ve 4 °C'de saklayın. NOT: Tüm deneysel prosedür boyunca, hücre sıralama tamponu her ...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

Bu yazıda, kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgelerinden yüksek saflıkta zenginleştirilmesi için bir protokol anlatılmaktadır.
Makrofajlar anatomik konumlarına ve fonksiyonel fenotiplerine göre alt popülasyonlara ayrılırlar. Ayrıca, değişken mikroçevresel sinyallere yanıt olarak bir fonksiyonel fenotipten diğerine geçebilirler13. Kemik iliği ve karaciğer gibi diğer organlarla karşılaştırıldığında, kalp dokusu daha d...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Sinoatriyal düğüm (SAN) fizyolojik olarak elektriksel dürtüyü başlatır ve bu nedenle kalbin birincil kalp pilidir. Atriyoventriküler düğüm (AVN), elektriksel impulsu atriyumdan ventriküllere iletir ve ayrıca yardımcı bir kalp pili1 görevi görür. Genel olarak, elektriksel impulsların üretimi ve iletimi, SAN / AVN bölgelerindeki yerleşik makrofaj da dahil olmak üzere çeşitli faktörler2 tarafından modüle edilebilen karmaşık bir süreçtir. Hulsmans ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışma, AVN'de zenginleştirilmiş ve sabit bir kalp atışı3'ü tutmada kilit oyuncular olarak işlev gören belirli bir kardiyak yerleşik makrofajlar popülasyonunu göstermektedir. Makrofajların elektriksel olarak kardiyomiyositlere bağlandığını ve kuplajlı kardiyomiyositlerin elektriksel özelliklerini değiştirebileceğini bulmuşlardır. Yazarlar ayrıca, makrofajlarla iç içe geçen bu tür iletken hücrelerin, SAN gibi kardiyak iletim sisteminin diğer bileşenlerinde de bulunduğunu belirtmektedir.
Şu anda, yerleşik kardiyak makrofajların fenotipinin kardiyak bölgeler arasında farklılık gösterip göstermediği tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte, doku mikroçevresinin doku makrofajlarının transkripsiyonunu ve proliferatif yenilenmesini etkileyebileceği gösterilmiştir4. Ayrıca, kardiyomiyosit fenotipinin bölgeler arasında farklı olduğu gösterildiğinden, makrofajların kardiyomiyositler üzerindeki fonksiyonel etkileri, makrofaj fenotipinin kendisi aynı olsa bile, bölgeye özgü olabilir. Bu nedenle, belirli kardiyak bölgeler üzerinde daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kararlı durumda, dokuda yerleşik makrofajların prenatal olarak kurulduğunu, kesin hematopoezden bağımsız olarak ortaya çıktığını ve yetişkinliğe kadar devam ettiğini göstermiştir5. Bununla birlikte, makrofaj tükenmesinden sonra veya kardiyak inflamasyon sırasında, Ly6chi monositleri kardiyak makrofaj popülasyonunun yenilenmesine katkıda bulunur6. Genetik soy izleme, parabiyoz, kader haritalama ve hücre izlemeyi içeren çalışmalar, organ ve dokularda çeşitli doku yerleşik makrofaj popülasyonlarının bir arada bulunduğunu ve ayrıca ontojeni 7,8,9 ile potansiyel olarak ilişkili makrofaj alt kümelerinin farklı hücresel davranışlarını göstermiştir.
Yerleşik kardiyak makrofajların karakterizasyonu, manyetik aktif hücre sıralama (MACS) ve floresan aktif hücre sıralama kullanımından yararlanmıştır. Bu yöntemler, spesifik hücre popülasyonlarını, hücre yüzey belirteçleriyle etiketleyerek çoklu doku fraksiyonlarından izole etmek için özellikle yararlıdır. Bu sadece izole edilmiş bağışıklık hücresi tipinin daha yüksek saflığına yol açmakla kalmaz, aynı zamanda fenotipik analize de izin verir. Burada, manyetik boncuk kaplı hücreleri içeren bir protokol ve ardından SAN ve AVN bölgesinden özel olarak izole edilen kardiyak yerleşik makrofajların zenginleştirilmesi için floresan aktif hücre ayıklama ile birlikte sunulmaktadır.
İletim sistemindeki kardiyak yerleşik makrofajların özelliklerini ve kardiyak iletim ve aritmiyogenez fonksiyonlarını araştırmak için, SAN ve AVN'nin kesin lokalizasyonu ve diseksiyonu kritik öneme sahiptir. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu için, bölge tanımlaması için anatomik işaretler kullanılır10. Kısacası SAN, superior vena kava ile sağ atriyumun birleştiği noktada yer almaktadır. AVN, triküspid kapağın septal broşürü ve arkadan Todaro11'in tendonu ile ön sınırlanan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Ayrıca farelerde SAN ve AVN'nin histoloji ve immünofloresan boyama ile doğrulanan doğru bir mikrodiseksiyon prosedürünü de sağlıyoruz.
İzole edilmiş yerleşik makrofajlar, RNA dizilimi gibi daha ileri deneyler için kullanılabilir veya çeşitli in vitro deneylere izin vererek iki haftadan fazla bir süre boyunca geri kazanılabilir ve yetiştirilebilir. Bu nedenle, protokolümüz immüno-ritmolog için oldukça değerli bir prosedürü tanımlamaktadır. Tablo 1, ihtiyaç duyulan tüm çözümlerin bileşimini gösterir, Şekil 1 , SAN ve AVN için mikrodiseksiyon işaretlerini gösterir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin histolojik boyanmasını göstermektedir (Masson'un trikrom ve immünofloresan boyaması). Şekil 4 , floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için adım adım bir geçit stratejisi göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

Yerleşik kardiyak makrofajların kalpteki elektriksel iletimi kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Fizyolojik kalp ritmi, sinoatriyal düğümde (SAN) üretilen elektriksel uyarılarla başlatılır ve daha sonra atriyoventriküler düğüm (AVN) yoluyla ventriküllere iletilir. Yerleşik makrofajların kardiyak iletim sistemindeki rolünü daha fazla incelemek için, yerleşik makrofajların SAN ve AVN'den uygun bir şekilde izole edilmesi gereklidir, ancak bu zor olmaya devam etmektedir. Burada, murin kalplerde SAN ve AVN'nin güvenilir mikrodiseksiyonu ve ardından yerleşik makrofajların izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz.
Hem crista terminalis'in superior vena kava ile kesiştiği noktada bulunan SAN hem de Koch üçgeninin tepesinde bulunan AVN tanımlanarak mikrodiseke edilir. Doğru yer, Masson trikrom boyası ve anti-HCN4 ile yapılan dokunun histolojik analizi ile doğrulanır.
Mikrodisseke edilmiş dokular daha sonra tek hücre süspansiyonları elde etmek için enzimatik olarak sindirilir ve ardından hücre tipi spesifik yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş spesifik bir antikor paneli ile inkübasyon yapılır. Bu, floresan aktif hücre sıralama ile farklı hücre popülasyonlarını tanımlamaya, saymaya veya izole etmeye izin verir. Kardiyak yerleşik makrofajları miyokarddaki diğer bağışıklık hücrelerinden, özellikle de işe alınan monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt etmek için, hassas bir şekilde tasarlanmış bir geçit stratejisine ihtiyaç vardır. İlk olarak, lenfoid soy hücreleri tespit edilir ve daha ileri analizlerden çıkarılır. Daha sonra, miyeloid hücreler, hem CD45 hem de CD11b'nin yüksek ekspresyonu ve Ly6C'nin düşük ekspresyonu ile belirlenen yerleşik makrofajlarla tanımlanır. Hücre sıralama ile, izole kardiyak makrofajlar daha sonra daha fazla araştırma için birkaç gün içinde in vitro olarak yetiştirilebilir. Bu nedenle, kardiyak iletim sistemi içinde bulunan kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için bir protokol tanımlıyoruz. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu ve sindirimindeki tuzakları tartışıyoruz ve floresan ile aktive olmuş hücre sıralama ile kardiyak makrofajları güvenilir bir şekilde tanımlamak, saymak ve sıralamak için bir geçit stratejisi sunuyoruz.

Kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgesinden izolasyonu için pratik bir prosedür tanımladık. Doğru diseksiyonu doğrulamak için, Masson Trikrom boyama ve immünofloresan HCN4-boyama yapılır (Şekil 3)12. Bu protokolle, bütün bir kalpten yaklaşık 60.000 makrofaj toplayabiliriz. Şekil 4, kardiyak makrofajları sıralamak için geçit stratejisini göstermektedir. Canlı yerleşimli kardiyak makrofajlar C...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Burada sunulan protokol, kardiyak yerleşik makrofajların fare kalplerinin sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyoventriküler düğüm (AVN) bölgesinden izolasyonu için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Mikrodiseksiyon ve daha sonra kardiyak yerleşik mikrofajların izolasyonu için, özellikle sinüs ve AV düğümünden floresan aktive edilmiş hücre ayıklaması ile bir protokol tanımladık. Sinüs ve V düğümünün hassas mikrodiseksiyonu, ardından manyetik ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama kombinasyonu ile, yerleşik makrofajları sinüs ve V düğümünden yüksek saflıkta spesifik olarak izole edebiliyoruz. Kardiyak yerleşik makrofajların kalpteki farklı bölgelerden tanımlanması ve izolasyonu, fenotiplerinin ve bölgeye özgü etkilerinin kardiyak elektrofizyoloji üzerindeki etkilerinin daha fazla incelenmesini sağlar.Kalbi izole ettikten sonra, mikrodiseksiyon prosedürlerini diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk bir kerelik PBS ile bir diseksiyon kabında gerçekleştirin. Kalbin sol-sağ ve anterior-posteriorunu belirlemek için aort, pulmoner arter, koroner sinüs ve sol veya sağ ventrikül gibi kardiyak anatomik işaretleri kullanın. Oryantasyon belirlendikten sonra, arka büyük damarları ortaya çıkarmak için kalbi çanağın altındaki ön kısımla konumlandırın.Ventriküllerin çoğunu çıkarmak için ventriküller ve atriyum arasındaki oluk boyunca kesin. Atriyal kısmı saklayın. AG serbest duvarının ve LAA'nın kalan kısmından pimler yerleştirerek kalbi diseksiyon kabına sabitleyin.Kalan RV serbest duvarını triküspid valf ve superior vena kava boyunca yukarı doğru kesin. RA ve RV'yi çevirin ve RA boşluğu aralık bölgesini ve atriyal septumu açığa çıkarmak için RAA'yı sabitleyin. SAN'ın mikrodiseksiyonu için, SAN örneğini elde etmek üzere aralık bölgesini ayırmak için kalbi crista terminalis'e paralel olarak interatriyal septum boyunca kesin.Numuneyi buz üzerinde boş bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe koyun. AVN'nin mikrodiseksiyonu için, interatriyal septuma bitişik dokudan kalbin kalan kısımlarını ve interventriküler septumu, interatriyal septumun sağ atriyal tarafına bakacak şekilde sabitleyin. Koch üçgeni için endokardiyal yüzeydeki sağ atriyuma bakın, bu da triküspid kapağın septal broşürünün menteşe çizgisi ve arkadan Todaro tendonu ile ön tarafta sınırlanacaktır.Koroner sinüsün deliği tabanda gözlenir. SAN ve AVN dokusunu neşterle kıyın. Daha sonra her numuneye 500 mikrolitre taze hazırlanmış sindirim tamponu ekleyin ve tüm kıyılmış dokuları mikrosantrifüj tüpünün duvarından yıkayın.Numunenin sindirilmesine yardımcı olmak için nazikçe pipet alın ve bir vorteks makinesinde dokuyu homojenize edin. Sindirimden sonra, doku süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek taze bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi durdurmak için hücre süzgecini ek beş mililitre hücre sıralama tamponu ile durulayın.Süper natantı çıkarın. Hücre peletini 90 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile yeniden askıya aldıktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde hücre süspansiyonuna 10 milyon toplam hücre başına 10 mikrolitre CD45 mikroboncuk ekleyin. Örnekleri iyice karıştırın.Hücre süspansiyonunun mikroboncuklar ve antikor karışımı ile inkübe edilmesi sırasında, manyetik sütunu uygun bir manyetik ayırıcıya bağlayarak ve ardından manyetik sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirerek manyetik ayırma setini hazırlayın. Kolonun üstüne eklenen 500 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile durulayarak ve tamponun geçmesine izin vererek manyetik kolonlar hazırlayın. Hücre ayırma tamponu geçerken hava kabarcıklarından kaçınarak hücre süspansiyonunu hemen kolona uygulayın.Kolonu 500 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile üç kez yıkayın. Sütuna bir mililitre hücre sıralama arabelleği ekleyin. Kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri içeren akışı elde etmek için sütunla birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak kolonu hemen yıkayın. Lekesiz numuneyi ve kompanzasyon tüplerini uyguladıktan sonra, hem pozitif hem de negatif pikleri eksenin uygun konumuna hizalamak için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Geçit stratejisini, uygulanabilirlik işaretçisi olarak DAPI kullanarak metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın.İlgilenilen hücre popülasyonunun grafiklerde düzgün bir şekilde gösterildiğini onaylamak için akış sitometrisi grafiklerini kontrol edin. Sıralanmış hücreleri, sonraki deneylerin ihtiyacına göre orta veya tampon halinde toplayın. Doğru bir diseksiyonu doğrulamak için, SAN ve AVN'nin tanımlanması immünofloresan ve Masson'un trikrom boyaması kullanılarak yapıldı.SAN ve AVN'deki HCN4 pozitif iletim sistemi hücrelerinin immünofloresan boyanması ve Masson'un SAN ve AVN'nin trikrom boyaması burada gösterilmiştir. Yerleşik kardiyak makrofajların hücre sıralaması için geçit stratejisi, y ekseninin ileri saçılma alanındaki çiftlerin x eksenine karşı dışlanmasıyla mononükleer hücrelerin tanımlanmasına yardımcı oldu. Ölü hücreler DAPI tarafından dışlandı.Canlı hücreler CD45 pozitif lökositler, daha sonra CD11b pozitif miyeloid hücreler için kapatıldı. Kardiyak makrofajlar hem F4/80 hem de CD64 ekspresyonu ile tanımlandı, daha sonra lenfosit antijeni altı ekspresyonu ile tabakalaştırıldı. Taze sıralanmış hücreler brightfield mikroskopisi altında gözlendi.Florofor PE kanalı altında gözlendiğinde hücreler CD45 için pozitifti. Florofor APC boyutu yedi kanal altında gözlendiğinde, sıralanmış hücrelerin aynı görünümü CD11b pozitif hücreleri gösterdi. Florofor PE boyutu yedi kanal, F4/80 pozitif fenotipini tanımlamak için kullanıldı.Üçlü pozitif hücreler kardiyak yerleşimci makrofajlar olarak tanımlandı. Altı güne kadar ortamda kültürlenen izole kardiyak makrofajlar beyaz oklarla belirtilirken, siyah oklar ölü hücreleri gösterir. Sıralanmış makrofajlar, yama kelepçesi deneyleri gibi daha ileri fonksiyonel çalışmalar veya RNA dizilimi veya proteomik çalışmalar gibi ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Görselleştirme<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Kalp Microlesions ve sonraki Kardiyak Tadilat içinde

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Murine Stellate Ganglion'un Yeri, Diseksiyonu ve Analizi

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...