Name: multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq
Uploaded: 2021-03-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

Johns Hopkins Transkriptomik ve Derin Sıralama Çekirdeği'nden Linda Orzolek'e, üretilen kütüphanelerin sıralanmasına yardımcı olduğu için ve Lizhi Jiang'a ex vivo retinal eksplantları gerçekleştirdiği için teşekkür ederiz.

Bu çalışmalar için hayvanların kullanımı, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak, ARRIVE yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve ilgili kılavuz ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. ÇOKLU SEQ
<ol><li>Medya hazırlama
	<ol><li>Ovomukoid inhibitörü, 10 mg ovomukoid inhibitörü ve mL Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) başına 10 mg albümin hazırlayın ve dengeleyin, 13 kullan...

<ol>
	<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370, (2020).</li><li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Landscape+of+the+Yeast+Genome+Defined+by+RNA+Sequencing.">The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50, 96 (2018).</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 16, 619-626 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19, 224 (2018).</li><li>Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+method+for+single+cell+chromatin+accessibility+profiling.">A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling.</a> Nature Communications. 9, 5345 (2018).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. , 8598 (2020).</li><li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Analysis+of+Retinal+Development+Identifies+NFI+Factors+as+Regulating+Mitotic+Exit+and+Late-Born+Cell+Specification.">Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification.</a> Neuron. 102, 1111-1126 (2019).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+circulating+immune+cell+landscape+in+aging+and+COVID-19.">A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19.</a> Protein Cell. 11, 740-770 (2020).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion.">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).</li><li>Agilent. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qubit+dsDNA+HS+Assay+Kits.">Qubit dsDNA HS Assay Kits.</a> ThermoFisher Scientific. , (2015).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).</li><li>Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+retinal+neurogenesis+by+somatostatin+signaling.">Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14, 865-868 (2017).</li><li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics.">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10, 2907 (2019).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Potential+Identified+by+Shared+Single-Cell+Profiling+of+RNA+and+Chromatin.">Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. , (2020).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Single-Cell+Analysis+Maps+the+Continuous+Regulatory+Landscape+of+Human+Hematopoietic+Differentiation.">Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.</a> Cell. 173, 1535-1548 (2018).</li><li>Pliner, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cicero+Predicts+cis-Regulatory+DNA+Interactions+from+Single-Cell+Chromatin+Accessibility+Data.">Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data.</a> Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR:+An+integrative+and+scalable+software+package+for+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177, 1888-1902 (2019).</li><li>METABRIC Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+transcriptomic+architecture+of+2,000+breast+tumours+reveals+novel+subgroups.">The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.</a> Nature. 486, 346-352 (2012).</li><li>Izadi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Connectivity+in+Colorectal+Cancer+Gene+Expression+Network.">Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network.</a> Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).</li></ol>

MULTI-seq'in gücü, birden fazla deneysel koşuldan veya modelden gelen verilerin sorunsuz entegrasyonundan ve maliyet ve parti etkilerini sınırlama açısından muazzam faydadan kaynaklanmaktadır. MULTI-seq'in kullanılması, laboratuvara benzeri görülmemiş bir fenotipleme derinliği sunar. Hücre karması veya çekirdek karması gibi genetik olmayan çoklama yöntemleri, barkodlu antikorların kullanımı yoluyla çoklanmış örneklere kapı açtı 7,19,20</s...

Genlerin hücre kaderini nasıl etkileyebileceğini anlamak, hastalık ve embriyonik progresyon gibi süreçleri sorgulamada önemli bir rol oynar. Transkripsiyon faktörleri ve hedef genleri arasındaki karmaşık ilişkiler, gen düzenleyici ağlarda gruplandırılabilir. Artan kanıtlar, bu gen düzenleyici ağları, evrimsel soylar boyunca hem hastalığın hem de gelişimin merkezine yerleştirir1. qRT-PCR gibi önceki teknikler tek bir gen veya gen kümesine odaklanırken, yüksek verimli dizileme teknolojisinin uygulanması, tam hücresel transkriptomların profillenmesine izin verir.
RNA-seq, büyük ölçekli transkriptomik 2,3'e bir bakış sunar. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), araştırmacılara sadece transkriptomların profilini çıkarma değil, aynı zamanda spesifik hücre tiplerini gen ekspresyon profilleri ile bağlama yeteneği verir4. Bu, bilinen gen belirteçleri5 kullanılarak bireysel hücre profillerinin sıralama algoritmalarına beslenmesiyle biyoinformatik olarak elde edilir. Lipid etiketli indeks dizilimi (MULTI-seq) kullanılarak çoklama, toplanabilen scRNA-Seq profillerinin sayısında benzeri görülmemiş bir çeşitlilik sunar6. Bu lipit bazlı teknik, plazma membran entegrasyonu7 yerine yüzey antijenlerinin ve yüksek afiniteli antikorların varlığına dayanan hücre karması gibi diğer numune indeksleme tekniklerinden farklıdır. Artık sadece gen ekspresyon profillerini hücre tiplerine profillemek mümkün değil, aynı zamanda farklı deneyler tek bir dizileme kütüphanesinde birleştirilebilir ve bu da bireysel bir scRNA-seq deneyinin maliyetini önemli ölçüde düşürür6. ScRNA-seq'in maliyeti, birçok farklı genotipin, durumun veya hasta örneğinin analiz edildiği fenotipleme deneylerinde kullanım için yasaklayıcı görünebilir, ancak çoklama, tek bir kütüphanede 96'ya kadar numunenin kombinasyonuna izin verir6.
ScRNA-seq yoluyla gen ekspresyonunun profillenmesi, moleküler mekanizmaların hücre kaderini nasıl belirlediğine dair mevcut anlayışta devrim yaratan tek yüksek verimli dizileme tabanlı teknik olmamıştır. Bir hücrede hangi gen transkriptlerinin bulunduğunu anlamak, hücre tipinin tanımlanmasını sağlarken, aynı derecede önemli olan, genomik organizasyonun gelişimi ve hastalığın ilerlemesini nasıl düzenlediğini anlamaktır. Erken çalışmalar, histonlara bağlı olmayan dizilerin DNaz aracılı bölünmesini tespit etmeye, ardından açık kromatin bölgelerini tanımlamak için ortaya çıkan DNA fragmanlarının dizilenmesine dayanıyordu. Buna karşılık, transpozon erişilebilir kromatin dizilimi (scATAC-seq) için tek hücreli tahlil, araştırmacıların tek nükleotid seviyesi8'de açık kromatinin profilini kolayca çıkarmak için evcilleştirilmiş bir transpozon ile DNA'yı araştırmalarını sağlar. Bu, scRNA-seq'e benzer bir ölçeklemeden geçti ve şimdi araştırmacılar binlerce bireysel genomda bireysel hücre tiplerini tanımlayabilir ve fenotiplerin profilini çıkarabilir8.
ScRNA-seq ve scATAC-seq eşleşmesi, araştırmacıların hastalık modellerinde ve gelişimsel süreçlerde hücre popülasyonlarını, genomik organizasyonu ve gen düzenleyici ağları belirlemek için binlerce hücrenin profilini çıkarma yeteneğini sağlamıştır 9,10,11,12. Burada yazarlar, sayısız hayvan modelinin fenotiplemesini yoğunlaştırmak için ilk önce MULTI-seq'in nasıl kullanılacağını ve bu hayvan modellerindeki kromatin manzarasını ve düzenleyici ağları daha iyi anlamak için eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq'i nasıl kullanacaklarını özetlemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M Barcode Solution</td>
			<td>Request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium controller &#38; Accessory Kit</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-120263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>P886-229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m FlowMi Cell Strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Co-Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5200 Fragment Analyzer system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>M5310AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um FlowMi cell strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BK392302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip H</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVA Foam Ice Pan</td>
			<td>Tequipment</td>
			<td>04393-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 12-Capillary Array Short, 33 cm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>A2300-1250-3355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-20Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 50% Aqueous solution</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq or NovaSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Hifi Hotstart ReadyMix</td>
			<td>HiFi</td>
			<td>7958927001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-324-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 200 &#181;L tubes</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>NC1469069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTI-seq Primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPI primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit N, Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit T Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution 5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Disposable Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5 primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq

Güçlü yeni nesil dizileme teknikleri, retinal gen düzenleyici ağların gelişim sırasında ve hastalık durumlarında nasıl çalıştığını araştırmak için sağlam ve kapsamlı analizler sunar. Tek hücreli RNA dizilimi, retina gelişiminde ve hastalığında gözlenen gen ekspresyon değişikliklerini hücresel düzeyde kapsamlı bir şekilde profillememize izin verirken, tek hücreli ATAC-Seq, kromatin erişilebilirliğinin ve transkripsiyon faktörü bağlanmasının analizinin benzer çözünürlükte profillenmesini sağlar. Burada, bu tekniklerin gelişmekte olan retinada kullanımı tanımlanmıştır ve bireysel örneklerin modifiye edilmiş bir oligonükleotid-lipit kompleksi ile etiketlendiği ve araştırmacıların hem bireysel deneylerin kapsamını artırmalarını hem de maliyetleri önemli ölçüde azaltmalarını sağlayan MULTI-Seq gösterilmiştir.

Bu iş akışı, tek hücre dizilimini kullanarak gelişimsel fenotiplerin ve düzenleyici süreçlerin araştırılması için bir strateji ortaya koymaktadır. MULTI-seq numune çoklaması, başlangıçta düşük maliyetli bir fenotipleme testine olanak tanırken, scRNA-seq ve scATAC-seq için numunelerin eşleştirilmiş toplanması ve sabitlenmesi daha derinlemesine araştırmaya olanak tanır (Şekil 1).
MULTI-seq barkodlaması, birden fazla numunenin birle?...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Burada, yazarlar fenotipleme için MULTI-seq'in ve daha sonra retinadaki transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik profillerini karakterize etmede eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq'in faydasını göstermektedir.

scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Bu protokol, ilk fenotipleme için tek hücreli RNA-seq kullanımını sağlayacaktır. Ve tek hücreli ATAC-seq ile eşleştirildiğinde, gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılması. MULTI-seq kullanımı, ilk araştırma için maliyetleri düşük tutar ve tek hücreli RNA-seq ve tek hücreli ATAC-seq için eşleştirilmiş numunelerin sabitlenmesi, gen düzenleyici ağların zaman akışı analizine izin verir.Araştırmacılar, gelişimi ve hastalığın ilerlemesini kontrol eden genetik ağları anlamak için bu protokolü kullanabilirler. Başlamak için, her numuneye 20 mikrolitre ankraj barkod çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipet uygulayın. Beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Daha sonra her numuneye 20 mikrolitre ko-ankraj çözeltisi ekleyin ve beş dakika daha buz üzerinde inkübe edin. Her numuneye bir mililitre buz gibi soğuk% 1 BSA ve PBS ekleyin ve hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.Daha sonra 400 mikrolitre buz soğuk% 1 BSA ve PBS ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Bir hemositometre kullanarak her numune için hücre konsantrasyonunu belirleyin ve Emülsiyonda Jel Boncuk veya GEM için gereken toplam hücre sayısını ve hacmini hesaplayın.Her numuneden hesaplanan hacimleri yeni bir steril 1,5 mililitrelik tüpte birleştirin ve kombine numunelerin nihai hücre konsantrasyonunu belirleyin. GEM üretimi ve barkodlamasından sonra, boyut seçimini kullanarak gen ekspresyonu cDNA temizliği gerçekleştirin ve süpernatantı numune barkodunu içeren ilk seçim turundan atmadığınızdan emin olun. Süpernatantı yeni steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.Paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifini vorteksleyin ve süpernatana 260 mikrolitre reaktif ve 180 mikrolitre% 100 İzopropanol ekleyin. Karışımı 10 kez pipetleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin.Çözüm netleştiğinde, süpernatanı çıkarın ve atın. Boncuklara 30 saniye boyunca 500 mikrolitre% 80 etanol ekleyin, ardından süpernatanı atın. Bunu toplam iki yıkama için tekrarlayın.Boncukları kısaca santrifüj edin ve manyetik rafa geri koyun. Zamanlayıcıyı iki dakikaya ayarlayın. Ardından artık etanolün bir P10 pipetle çıkarılmasını sağlayın ve kalan iki dakika boyunca manyetik raftaki boncukları havayla kurulayın.Boncukları manyetik raftan çıkarın ve 100 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden askıya alın. Pipetleri iyice bastırın ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından boncukları manyetik rafa geri koyun ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin. Süpernatantı taze bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Elüsyon arabelleğinin hacminin yarısını kullanarak temizleme işlemini gösterildiği gibi tekrarlayın. ScATAC dizisine yönelik numuneler için, bir P200 pipet kullanarak mikrosantrifüj tüpünden herhangi bir sıvıyı çıkarın ve numuneleri etanol kuru buzda flaşla dondurun. ScRNA dizilimi için hedeflenen örneklerdeki hücreleri ayrıştırmak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi papain kullanarak ayrışma adımlarını gerçekleştirin.Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. Bir mililitre soğutulmuş PBS ekleyin ve 10 kez veya hücreler tamamen askıya alınana kadar karıştırın. Yine, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve PBS ile yıkamayı iki kez tekrarlayın.Tüpü en düşük hız ayarında vortekslemeye başlayın ve hücrelerin kümelenmesini önlemek için tüpü yavaşça vortekse etmeye devam ederken, damla damla 900 mikrolitre soğutulmuş metanol ekleyin. Buz üzerindeki hücreleri 15 dakika boyunca inkübe edin. Bir hemositometre kullanarak sabit hücrelerin konsantrasyonunu belirleyin ve tripan mavisi kullanarak fiksasyon adımının etkinliğini değerlendirin.Dondurulmuş dokuyu ve sabit hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. MULTI dizi barkodlaması, birden fazla numunenin birleşik dizilenmesini ve ardından hesaplamalı dekonvolüsyonunu sağlar. Menşe örneği, barkod ifadelerine göre her hücre için belirlenebilir.Bu birleştirilmiş örnekler, hücre kümelemesi ve hücre tipi tanımlaması amacıyla tek bir veri kümesi olarak analiz edilebilir. Her hücre GEM oluşturmadan önce barkodlandığından, hücre çiftlerinin birden fazla MULTI dizi barkodu için ifade gösterme olasılığı yüksek olacaktır ve bu nedenle çiftlerin çoğunluğu kümeleme ve hücre tipi tanımlamadan önce tanımlanabilir ve kaldırılabilir. Tek hücreli ATAC dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi ile bulunanlarla eşleşecek hücre tiplerine sahip bir veri kümesi oluşturmak için kullanılabilir.Tek hücreli RNA dizileme gen ekspresyonu ve tek hücreli ATAC dizileme DNA erişilebilirlik bilgisinin eşleştirilmesi, gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılmasını sağlar. Protokolü denerken, etnol buharlaşmasının iki dakikalık zamanlamasının, sonraki elüsyon adımlarında dizi alımı için çok önemli olduğunu unutmayın. Eşleştirilmiş tek hücreli RNA-seq ve tek hücreli ATAC-seq kullanarak gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılması, gen aşırı ekspresyonu ve nakavt çalışmaları için hedefler üretir.MULTI-seq bu aşamada hücre tipine özgü etkileri tanımlamak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Nörobilim

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...