Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

We willen de Neuroscience Imaging Service van Stanford University School of Medicine bedanken voor het leveren van apparatuur en ruimte voor dit project. Dit onderzoek werd ondersteund door intramurale financiering van het Stanford Cancer Institute en de Gynecologic Oncology Division Stanford, evenals GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 van het National Research, Development and Innovation Office, Hongarije.

1. Plasmide constructie
<ol><li>Gebruik voor het genereren van de eGFP-mCherry1-fusiesonde een N1-zoogdiercelexpressievector (zie materiaaltabel) met mCherry110 ingevoegd met behulp van de restrictiesites AgeI en BsrGI.</li>
	<li>Gebruik de volgende oligonucleotiden om eGFP11 te versterken zonder stopcodon als SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' en C-terminal primer 5'-AAT ...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van de genetisch gekoppelde één-op-één fluorescerende eiwitkalibratiesonde voor het kwantificeren van FRET met behulp van de detectie van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast om eiwitinteracties te beoordelen in de fysiologische context van de levende cel in verschillende subcellulaire compartimenten. De ruimtelijke resolutie kan verder worden verbeterd door het ge...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Microscopie-gebaseerde analyse van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) maakt het mogelijk om interacties tussen eiwitten in levende cellen te beoordelen. Het biedt ruimtelijke en temporele informatie, inclusief informatie over waar in de cel en in welk subcellulair compartiment de interactie plaatsvindt en of deze interactie in de loop van de tijd verandert.
Theodor Förster legde de theoretische basis van FRET in 19481. FRET is een stralingsloze overdracht van energie van een aangeslagen donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand van de moleculen en de relatieve oriëntatie van hun overgangsdipolen, evenals de overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. De snelheid van energieoverdracht is omgekeerd evenredig met de zesde macht van de donor-acceptor afstand. FRET kan dus worden gebruikt om moleculaire nabijheid te meten in het bereik van 1-10 nm.
FRET concurreert met andere de-excitatieprocessen van het donormolecuul en resulteert in de zogenaamde donor-quenching en sensibilized emissie van de acceptor. Donor-quenching is een vermindering van het aantal uitgezonden donorfotonen, terwijl gesensibiliseerde emissie een toename is van uitgezonden acceptorfotonen. Veel microscopische FRET-analyses maken gebruik van fluorescentie-intensiteitsmetingen, waaronder acceptorfotobleaching 2, donorfotobleaching2 of FRET-gesensibiliseerde fotobleaching van de acceptor3.
Hier worden een stap-voor-stap experimenteel protocol en wiskundig algoritme gepresenteerd om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptorsensibiliseerde emissie4,5, een methode die vaak ratiometrische FRET wordt genoemd. Er zijn veel protocollen gepubliceerd over het benaderen van gesensibiliseerde emissie, weinigen hebben de absolute FRET-efficiëntie 6,7,8,9 gekwantificeerd. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van (i) de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten en ook (ii) de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Terwijl overspraak kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één van de fluoroforen tot expressie brengen, is de beoordeling van de relatieve detectie-efficiëntie van de fluorescentie van donor en acceptor ingewikkelder. Het vereist de kennis van ten minste de verhouding van het aantal donor- en acceptormoleculen die aanleiding geven tot de gemeten signalen. Het aantal fluoroforen dat in levende cellen tot expressie komt, varieert echter van cel tot cel en is onbekend. De zogenaamde α-factor karakteriseert de relatieve signaalsterkten van een enkele aangeslagen donor- en acceptormolecuul. Kennis van de factor is een voorwaarde voor kwantitatieve ratiometrische FRET-metingen in monsters met variabele acceptor-donormolecuulverhoudingen zoals aangetroffen tijdens live-cell imaging met fluorescerende eiwitten. Het gebruik van een 1-op-1 donor-acceptor fusie-eiwit als kalibratiesonde maakt de bepaling van de α factor mogelijk en dient ook als een positieve controle. Deze genetisch gekoppelde sonde wordt door cellen uitgedrukt in onbekende totale hoeveelheden, maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid van één-op-één. Het volgende protocol legt uit hoe de 1-op-1-sonde moet worden geconstrueerd en hoe deze moet worden gebruikt voor de kwantificering van FRET-efficiëntie. Een spreadsheet die alle formules bevat, is te vinden in het supplement en kan door de lezers worden gebruikt om hun eigen metingen in de respectieve kolommen in te voeren, zoals hieronder beschreven.
Hoewel het protocol het GFP-Cherry-donor/ acceptorpaar gebruikt, kan de gepresenteerde aanpak worden uitgevoerd met elk ander FRET-paar. Het Aanvullend Dossier 1 geeft details over cyaan-gele paren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is de stralingsloze overdracht van energie van een geëxciteerde donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand en oriëntatie van de moleculen en de mate van overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. FRET maakt het mogelijk om de interactie van eiwitten in de levende cel in de loop van de tijd en in verschillende subcellulaire compartimenten te bestuderen. Verschillende op intensiteit gebaseerde algoritmen om FRET te meten met behulp van microscopie zijn beschreven in de literatuur. Hier worden een protocol en een algoritme verstrekt om de FRET-efficiëntie te kwantificeren op basis van het meten van zowel de gesensibiliseerde emissie van de acceptor als het blussen van het donormolecuul. De kwantificering van ratiometrische FRET in de levende cel vereist niet alleen de bepaling van de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten, maar ook de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Het protocol dat hier wordt verstrekt, beschrijft hoe deze kritieke parameters moeten worden beoordeeld.

Figuur 1 toont de beelden verkregen in respectievelijk het donorkanaal, kanaal 1 (488, 505-530 nm), het overdrachtskanaal, kanaal 2 (488, >585 nm) en het acceptorkanaal, kanaal 3 (561, >585 nm). Representatieve afbeeldingen van cellen die alleen GFP tot expressie brengen, alleen Cherry, co-expressie van GFP en Cherry, en tot expressie brengen van het GFP-Cherry fusie-eiwit. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties berekend in NRK-cellen die GFP-Cherry-fusi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Dit protocol beschrijft een stap-voor-stap experimenteel proces en wiskundig algoritme om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptor gesensibiliseerde emissie. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van de overspraak van de fluorescerende eiwitten en de relatieve emissie- en detectie-efficiëntie van de fluoroforen in de microscopische opstelling. Kruisverwijzing kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één fluorofoor tot expressie brengen.Beoordeling van de detectie-efficiëntie van een donor- of acceptormolecuul vereist kennis van de verhouding van het aantal donor- en acceptermoleculen dat aanleiding geeft tot het meetsignaal. Het aantal fluoroforen dat tot expressie komt in levende cellen varieert van cel tot cel en is onbekend. De kalibratiesonde die bij deze methode wordt gebruikt, een één-op-één donor-acceptor fusie-eiwit, maakt het mogelijk om de relatieve detectie-efficiëntie van donor- en acceptormoleculen te bepalen.Gebruik om te beginnen een N1-zoogdiercelexpressievector met mCherry 1 voor het genereren van de EGFP mCherry 1-fusiesonde. Ontwerp oligonucleotiden om EGFP te versterken zonder een stopcodon als een cel één BAM h1-fragment. De vijf aminozuurverbinding tussen het groene en rode fluorescerende eiwit zou een gemiddelde FRET-deficiëntie voor het GFP-kersendonor-acceptorpaar van 0,25 tot 0,3 moeten opleveren.Gebruik elke cellijn en media zonder fenolrood om achtergrondfluorescentie te verminderen. Zodra cellen 80% confluent zijn, maakt u ze los met één milliliter 0,05% trypsine EDTA en zaait u ongeveer 10.000 cellen in elke put van een achtputplaat door drie druppels uit een celsuspensie van vijf milliliter toe te voegen. 24 uur na het plateren, transfecteer de cellen met behulp van een geschikt transfectiemedium.Incubeer de cellen gedurende 20 uur voor live cell imaging om een goede fluorescerende eiwitexpressie, vouwing en rijping mogelijk te maken. Stel de cellen in een bevochtigde en verwarmde omgevingskamer bij 37 graden Celsius voor met een confocale scanmicroscoop. Om de celmedia bij fysiologische pH te bufferen, voegt u 20 millimolaire HEPES toe om de celmedia koolstofdioxide-onafhankelijk te maken.Monteer vervolgens de dia op de microscoop. Gebruik de 488 nanometer lijn van de argon ion laser om de GFP te prikkelen en de 561 nanometer diode laser om kers te prikkelen. Stel de 488 nanometer laser in voor excitatie in kanaal één door een emissieband van 505 tot 530 nanometer en in kanaal twee met een langdoorlaatfilter van meer dan 585 nanometer.Gebruik de 561 nanometer laser voor excitatie in kanaal drie met een langdoorlaatfilter van meer dan 585 nanometer. Prikkel de twee lasers achtereenvolgens en stel de beeldmodus in om na elke lijn te schakelen, zodat de excitatie van het beeld van 512 bij 512 pixels na elke lijn wordt afgewisseld. Stel een mini-tijdreeks van drie afbeeldingen in om te detecteren of er significante fotobleaching optreedt en verminder het laservermogen indien nodig.Ten eerste, beeldcellen die de GFP-kersenfusieconstructie uitdrukken. Stel de parameters in die de tijdgeïntegreerde laserintensiteit per pixel in een confocale afbeelding definiëren. Gebruik een olieobjectief van 63x en zoom in op 3x om een cel in zijn geheel weer te geven met voldoende vergroting en resolutie.Streef naar een pixelgrootte van 70 tot 80 nanometer. Stel de verblijftijd van de pixel in op twee tot vier microseconden en AOTF-transmissie voor de 488 nanometer en 561 nanometer laser, zodat beelden een goede signaal-ruisverhouding laten zien zonder bleken en geen pixels die wijzen op fluorescentie-intensiteitsverzadiging. Pas het laservermogen van 488 en 561 zodanig aan dat de signaalniveaus in kanaal één en kanaal drie vergelijkbaar zijn.Stel de versterking van de fotovermenigvuldigingsfactor in op 600 tot 800. Afbeelding 15 tot 20 cellen die het GFP-kersenfusie-eiwit tot expressie brengen, cellen die GFP, kers, GFP en kers tot expressie brengen, en niet-getransecteerde cellen. Vervolgens beeldcellen die samen de eiwitten van belang tot expressie brengen gekoppeld aan respectievelijk GFP en kers.Om FRET te berekenen, meet je het donorsignaal in kanaal één, het donorkanaal met 488 nanometer excitatie en een emissieband van 505 tot 530 nanometer. Meet vervolgens het acceptorsignaal in kanaal drie, het acceptorkanaal met 561 nanometer excitatie en emissie boven 585 nanometer. Meet ten slotte het FRET-signaal in kanaal twee, het overdrachtskanaal met 488 nanometer excitatie en emissie boven 585 nanometer.Het signaal in kanaal twee is een som van vier verschillende componenten: de spectrale spillover van het uitgebluste donorsignaal naar het meer dan 585 detectiekanaal met een overspraakfactor S1, het acceptorsignaal van directe excitatie door 488 nanometer licht met een overspraakfactor S2, de gesensibiliseerde emissie van de acceptor door FRET van het geëxciteerde donormolecuul, en het achtergrondsignaal. Beelden werden verkregen in het donorkanaal, het overdrachtskanaal en het acceptorkanaal, cellen die alleen GFP tot expressie brengen, alleen kersen, co-expressie van GFP en kers, en het GFP-kersenfusie-eiwit worden getoond. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties berekend in NRK-cellen die GFP-kersfusie-eiwit tot expressie brengen en die co-expressie GFP-kers worden uitgezet versus de intensiteitsratio tussen acceptor en donor of moleculaire verhouding in elke cel.Genormaliseerde pixel voor pixel FRET-afbeeldingen van cellen die het GFP-kersenfusie-eiwit tot expressie brengen, GFP en kers co-expressie als een negatieve controle en het tot expressie brengen van receptorsubeenheden van de Ashwell-Morell-receptor worden hier weergegeven. RHL1 en 2 van de hepatische lectine bij ratten werden gelabeld met GFP en kers op de cytoplasmatische kant van het plasmamembraan. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie van cellen die GFP RHL1 en cherry RHL2 tot expressie brengen en GFP RHL1 delta stock en cherry RHL2 worden uitgezet versus de acceptor-to-donor moleculaire ratio.De gepresenteerde kwantitatieve FRET-benadering maakt het volgende mogelijk. Detectie van eiwitinteracties in de fysiologische context van de levende cel. Veranderingen in eiwitinteracties in de loop van de tijd.Verschillen in interacties in subcellulaire compartimenten tot op pixelniveau van een confocale afbeelding. En de afhankelijkheid van het gedetecteerde FRET-signaal van de moleculaire acceptor-donorverhouding uitgedrukt in een levende cel.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...