Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
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Nous tenons à remercier le service d’imagerie en neurosciences de la faculté de médecine de l’Université de Stanford pour avoir fourni l’équipement et l’espace nécessaires à ce projet. Cette recherche a été financée par le financement intra-muros du Stanford Cancer Institute et de la Gynecologic Oncology Division Stanford, ainsi que par GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 du Bureau national de recherche, de développement et d’innovation, Hongrie.

1. Construction plasmidique
<ol><li>Pour générer la sonde de fusion eGFP-mCherry1, utiliser un vecteur d’expression cellulaire de mammifère N1 (voir le tableau des matériaux) avec mCherry110 inséré à l’aide des sites de restriction AgeI et BsrGI.</li>
	<li>Utiliser les oligonucléotides suivants pour amplifier eGFP11 sans codon stop comme fragment SalI-BamHI : amorce N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG ...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Le protocole présenté détaille l’utilisation de la sonde d’étalonnage de protéines fluorescentes un à un génétiquement couplé pour quantifier FRET en utilisant la détection de l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer les interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante dans différents compartiments subcellulaires. La résolution spatiale peut être encore amé...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

L’analyse par microscopie du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) permet d’évaluer les interactions entre les protéines dans les cellules vivantes. Il fournit des informations spatiales et temporelles, y compris des informations sur l’endroit de la cellule et dans quel compartiment subcellulaire l’interaction a lieu et si cette interaction change au fil du temps.
Theodor Förster a posé les bases théoriques du FRET en 19481. FRET est un transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance des molécules et de l’orientation relative de leurs dipôles de transition ainsi que du chevauchement entre les spectres d’émission donneuse et d’absorption accepteur. Le taux de transfert d’énergie est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance donneur-accepteur. Ainsi, FRET peut être utilisé pour mesurer la proximité moléculaire dans la gamme de 1-10 nm.
FRET entre en compétition avec d’autres processus de désexcitation de la molécule donneuse et entraîne l’émission dite de trempe du donneur et sensibilisée de l’accepteur. La trempe du donneur est une réduction du nombre de photons donneurs émis, tandis que l’émission sensibilisée est une augmentation des photons accepteurs émis. De nombreuses analyses microscopiques FRET utilisent des mesures d’intensité de fluorescence, y compris le photoblanchiment accepteur 2, le photoblanchiment donneur2 ou le photoblanchiment sensible au FRET de l’accepteur3.
Ici, un protocole expérimental étape par étape et un algorithme mathématique sont présentés pour quantifier FRET en utilisant la trempe du donneur et l’émission sensibilisée par accepteur4,5, une méthode souvent appelée FRET ratiométrique. De nombreux protocoles sur la façon d’approximer les émissions sensibilisées ont été publiés, peu ont quantifié l’efficacité absoluedu FRET 6,7,8,9. La quantification des rendements FRET dans la cellule vivante nécessite de déterminer (i) la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes et, également (ii) l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Alors que la diaphonie peut être évaluée en imageant des cellules exprimant un seul des fluorophores, l’évaluation de l’efficacité relative de détection de la fluorescence donneuse et acceptrice est plus compliquée. Elle nécessite de connaître au moins le rapport entre le nombre de molécules donneuses et acceptrices donnant lieu aux signaux mesurés. Le nombre de fluorophores exprimés dans les cellules vivantes varie cependant d’une cellule à l’autre et est inconnu. Le facteur dit α caractérise les forces relatives du signal d’une seule molécule donneuse et acceptrice excitée. La connaissance du facteur est une condition préalable aux mesures quantitatives ratiométriques FRET dans des échantillons présentant des rapports de molécules accepteur/donneur variables, comme lors de l’imagerie de cellules vivantes avec des protéines fluorescentes. L’utilisation d’une protéine de fusion donneur-accepteur 1 pour 1 comme sonde d’étalonnage permet de déterminer le facteur α et sert également de contrôle positif. Cette sonde génétiquement couplée est exprimée par des cellules en quantités totales inconnues, mais dans une quantité relative fixe et connue de un à un. Le protocole suivant explique comment construire la sonde 1-to-1 et comment l’utiliser pour quantifier l’efficacité FRET. Une feuille de calcul qui comprend toutes les formules peut être trouvée dans le supplément et peut être utilisée par les lecteurs pour entrer leurs propres mesures dans les colonnes respectives comme indiqué ci-dessous.
Bien que le protocole utilise la paire donneur / accepteur GFP-Cherry, l’approche présentée peut être réalisée avec n’importe quelle autre paire FRET. Le dossier supplémentaire 1 fournit des détails sur les paires cyan-jaune.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est le transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance et de l’orientation des molécules ainsi que de l’étendue du chevauchement entre les spectres d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur. FRET permet d’étudier l’interaction des protéines dans la cellule vivante au fil du temps et dans différents compartiments subcellulaires. Différents algorithmes basés sur l’intensité pour mesurer FRET à l’aide de la microscopie ont été décrits dans la littérature. Ici, un protocole et un algorithme sont fournis pour quantifier l’efficacité FRET basée sur la mesure à la fois de l’émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe de la molécule donneuse. La quantification du FRET ratiométrique dans la cellule vivante nécessite non seulement la détermination de la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes, mais aussi l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Le protocole fourni ici détaille comment évaluer ces paramètres critiques.

La figure 1 montre les images obtenues respectivement dans le canal donneur, canal 1 (488, 505-530 nm), le canal de transfert, canal 2 (488, >585 nm) et le canal accepteur, canal 3 (561, >585 nm). Images représentatives de cellules exprimant uniquement la GFP, la cerise uniquement, co-exprimant la GFP et la cerise, et exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry. Les efficacités cellulaires moyennes du FRET calculées dans les cellules NRK exprimant la prot?...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) entre deux molécules de fluorophore peut être utilisé pour étudier les interactions protéiques dans la cellule vivante. Ici, un protocole est fourni sur la façon de mesurer FRET dans les cellules vivantes en détectant l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Ce protocole décrit un processus expérimental étape par étape et un algorithme mathématique pour quantifier FRET en utilisant la trempe du donneur et l’émission sensibilisée par accepteur. La quantification de l’efficacité FRET dans la cellule vivante nécessite de déterminer la diaphonie des protéines fluorescentes et les efficacités relatives d’émission et de détection des fluorophores dans la configuration microscopique. La diaphonie peut être évaluée en imageant des cellules exprimant un seul fluorophore.L’évaluation de l’efficacité de détection d’une molécule donneuse ou acceptrice nécessite une connaissance du rapport entre le nombre de molécules donneuses et acceptrices donnant lieu au signal de mesure. Le nombre de fluorophores exprimés dans les cellules vivantes varie d’une cellule à l’autre et est inconnu. La sonde d’étalonnage utilisée dans cette méthode, une protéine de fusion donneur-accepteur un-à-un, permet de déterminer l’efficacité relative de détection des molécules donneuses et acceptrices.Pour commencer, utilisez un vecteur d’expression cellulaire de mammifère N1 avec mCherry 1 pour générer la sonde de fusion EGFP mCherry 1. Concevoir des oligonucléotides pour amplifier l’EGFP sans codon stop en tant que fragment BAM h1 de la cellule. Le liant à cinq acides aminés entre la protéine fluorescente verte et rouge devrait donner un déficit moyen en FRET pour la paire donneur-accepteur de cerises GFP de 0,25 à 0,3.Utilisez n’importe quelle lignée cellulaire et média sans rouge de phénol pour réduire la fluorescence de fond. Une fois que les cellules sont confluentes à 80%, détachez-les avec un millilitre d’EDTA à 0,05% de trypsine et ensemencez environ 10 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de huit puits en ajoutant trois gouttes d’une suspension cellulaire de cinq millilitres. 24 heures après le placage, transfecter les cellules à l’aide d’un milieu de transfection approprié.Incuber les cellules pendant 20 heures avant l’imagerie des cellules vivantes pour permettre l’expression, le repliement et la maturation appropriés des protéines fluorescentes. Imagez les cellules dans une chambre environnementale humidifiée et chauffée à 37 degrés Celsius avec un microscope à balayage confocale. Pour tamponner le milieu cellulaire au pH physiologique, ajoutez 20 HEPES millimolaires pour rendre le milieu cellulaire indépendant du dioxyde de carbone.Montez ensuite la lame sur le microscope. Utilisez la raie de 488 nanomètres du laser argon ionique pour exciter le GFP et le laser à diode 561 nanomètres pour exciter la cerise. Configurez le laser de 488 nanomètres pour l’excitation dans le canal un à travers une bande d’émission de 505 à 530 nanomètres et dans le canal deux avec un filtre passe-long de plus de 585 nanomètres.Utilisez le laser 561 nanomètres pour l’excitation dans le canal trois avec un filtre passe-long de plus de 585 nanomètres. Excitez les deux lasers séquentiellement et réglez le mode d’imagerie pour qu’il bascule après chaque ligne afin que l’excitation de l’image de 512 x 512 pixels alterne après chaque ligne. Configurez une mini-série chronologique de trois images pour détecter si un photoblanchiment important se produit et réduire la puissance laser si nécessaire.Tout d’abord, les cellules d’image exprimant la construction de fusion de cerises GFP. Définissez les paramètres qui définissent l’intensité laser intégrée dans le temps par pixel dans une image confocale. Utilisez un objectif d’huile 63X et un zoom réglé sur 3X pour imager une cellule dans son intégralité avec un grossissement et une résolution suffisants.Visez une taille de pixel de 70 à 80 nanomètres. Réglez le temps de séjour des pixels sur deux à quatre microsecondes et la transmission AOTF pour le laser 488 nanomètres et 561 nanomètres de sorte que les images montrent un bon rapport signal sur bruit sans blanchissement et sans pixels indiquant une saturation de l’intensité de fluorescence. Ajustez la puissance laser de 488 et 561 de sorte que les niveaux de signal dans les canaux un et trois soient similaires.Réglez le gain du multiplicateur photo sur 600 à 800. Image 15 à 20 cellules exprimant la protéine de fusion GFP cerise, cellules exprimant GFP, cerise, GFP et cerise, et cellules non transectées. Puis les cellules d’image co-exprimant les protéines d’intérêt couplées à la GFP et à la cerise respectivement.Pour calculer FRET, mesurez le signal du donneur dans le canal un, le canal donneur avec une excitation de 488 nanomètres et une bande d’émission de 505 à 530 nanomètres. Ensuite, mesurez le signal accepteur dans le canal trois, le canal accepteur avec une excitation et une émission de 561 nanomètres au-dessus de 585 nanomètres. Enfin, mesurez le signal FRET dans le canal deux, le canal de transfert avec une excitation et une émission de 488 nanomètres au-dessus de 585 nanomètres.Le signal dans le canal deux est une somme de quatre composantes différentes: le débordement spectral du signal donneur éteint dans le canal de détection plus de 585 avec un facteur de diaphonie S1, le signal accepteur de l’excitation directe par une lumière de 488 nanomètres avec un facteur de diaphonie S2, l’émission sensibilisée de l’accepteur par FRET à partir de la molécule donneuse excitée, et le signal de fond. Les images ont été obtenues dans le canal donneur, le canal de transfert et le canal accepteur, les cellules exprimant uniquement la GFP, la cerise seulement, la GFP co-exprimant et la cerise, et la protéine de fusion de la cerise GFP sont montrées. Les efficacités cellulaires moyennes de FRET calculées dans les cellules NRK exprimant la protéine de fusion GFP de la cerise et celles co-exprimant la GFP sont tracées en fonction du rapport accepteur-donneur d’intensité ou du rapport moléculaire dans chaque cellule.Des images FRET pixel par pixel normalisées de cellules exprimant la protéine de fusion de la cerise GFP, co-exprimant la GFP et la cerise en tant que contrôle négatif et exprimant les sous-unités du récepteur Ashwell-Morell sont montrées ici. Les RHL1 et 2 de la lectine hépatique du rat ont été marquées avec de la GFP et de la cerise du côté cytoplasmique de la membrane plasmique. Les efficacités cellulaires moyennes FRET des cellules exprimant la GFP RHL1 et la cerise RHL2 et le stock delta GFP RHL1 et la RHL2 cerise sont tracées en fonction du rapport moléculaire accepteur-donneur.L’approche FRET quantitative présentée permet ce qui suit. Détection des interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante. Changements dans les interactions protéiques au fil du temps.Différences dans les interactions dans les compartiments subcellulaires jusqu’au niveau pixel par pixel d’une image confocale. Et la dépendance du signal FRET détecté sur le rapport accepteur-donneur moléculaire exprimé dans une cellule vivante.

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Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - transcriptome à l&#39;échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...