Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
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Wir danken dem Neuroscience Imaging Service der Stanford University School of Medicine für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt. Diese Forschung wurde durch intramurale Mittel des Stanford Cancer Institute und der Abteilung für gynäkologische Onkologie Stanford sowie durch GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 des Nationalen Büros für Forschung, Entwicklung und Innovation, Ungarn, unterstützt.

1. Plasmid-Konstruktion
<ol><li>Verwenden Sie zur Erzeugung der eGFP-mCherry1-Fusionssonde einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor (siehe Materialtabelle) mit mCherry110, der unter Verwendung der Restriktionsstellen AgeI und BsrGI eingefügt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Oligonukleotide, um eGFP11 ohne Stoppcodon als SalI-BamHI-Fragment zu amplifizieren: N-terminaler Primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG G...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. 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G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der genetisch gekoppelten Eins-zu-Eins-Fluoreszenzprotein-Kalibrierungssonde zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung des Nachweises der sensibilisierten Emission des Akzeptors und des Quenchings des Donormoleküls durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode kann angewendet werden, um Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu bewerten. Die räumliche Auflösung kann weiter verbessert werden,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Die mikroskopische Analyse des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) ermöglicht die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in lebenden Zellen. Es liefert räumliche und zeitliche Informationen, einschließlich Informationen darüber, wo in der Zelle und in welchem subzellulären Kompartiment die Interaktion stattfindet und ob sich diese Interaktion im Laufe der Zeit ändert.
Theodor Förster legte 1948 die theoretischen Grundlagen der FRET1. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem angeregten Donor zu einem Akzeptormolekül und hängt vom Abstand der Moleküle und der relativen Orientierung ihrer Übergangsdipole sowie von der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. Die Energieübertragungsrate ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstands. Somit kann FRET verwendet werden, um die molekulare Nähe im Bereich von 1-10 nm zu messen.
FRET konkurriert mit anderen De-Anregungsprozessen des Donormoleküls und führt zur sogenannten Donor-Quenching und sensibilisierten Emission des Akzeptors. Donor-Quenching ist eine Verringerung der Anzahl der emittierten Donorphotonen, während sensibilisierte Emission eine Erhöhung der emittierten Akzeptorphotonen ist. Viele mikroskopische FRET-Analysen verwenden Fluoreszenzintensitätsmessungen, einschließlich Akzeptor-Photobleiche 2, Donor-Photobleiche2 oder FRET-sensibilisiertes Photobleichen des Akzeptors3.
Hier werden ein Schritt-für-Schritt-Versuchsprotokoll und ein mathematischer Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission4,5 vorgestellt, einer Methode, die oft als ratiometrische FRET bezeichnet wird. Es wurden viele Protokolle zur Annäherung an die sensibilisierte Emission veröffentlicht, nur wenige haben den absoluten FRET-Wirkungsgrad 6,7,8,9 quantifiziert. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung (i) des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine und (ii) der Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Während das Übersprechen durch die Bildgebung von Zellen beurteilt werden kann, die nur eines der Fluorophore exprimieren, ist die Beurteilung der relativen Detektionseffizienz der Donor- und Akzeptorfluoreszenz komplizierter. Es erfordert die Kenntnis mindestens des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die zu den gemessenen Signalen führen. Die Anzahl der in lebenden Zellen exprimierten Fluorophore variiert jedoch von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Der sogenannte α-Faktor charakterisiert die relativen Signalstärken eines einzelnen angeregten Donor- und Akzeptormoleküls. Die Kenntnis des Faktors ist eine Voraussetzung für quantitative ratiometrische FRET-Messungen in Proben mit variablen Akzeptor-zu-Donor-Molekül-Verhältnissen, wie sie bei der Bildgebung lebender Zellen mit fluoreszierenden Proteinen auftreten. Die Verwendung eines 1-zu-1-Donor-Akzeptor-Fusionsproteins als Kalibriersonde ermöglicht die Bestimmung des α Faktors und dient gleichzeitig als Positivkontrolle. Diese genetisch gekoppelte Sonde wird von Zellen in unbekannten Gesamtmengen, aber in einer festen und bekannten relativen Menge von eins zu eins exprimiert. Das folgende Protokoll beschreibt, wie die 1-zu-1-Sonde aufgebaut und zur Quantifizierung der FRET-Effizienz verwendet wird. Eine Tabelle, die alle Formeln enthält, finden Sie in der Beilage und kann von den Lesern verwendet werden, um ihre eigenen Maße in die jeweiligen Spalten einzugeben, wie unten beschrieben.
Während das Protokoll das GFP-Cherry-Donor/Akzeptor-Paar verwendet, kann der vorgestellte Ansatz mit jedem anderen FRET-Paar durchgeführt werden. Die Zusatzdatei 1 enthält Details zu cyan-gelben Paaren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.

Abbildung 1 zeigt die Bilder, die im Donorkanal, Kanal 1 (488, 505-530 nm), im Übertragungskanal Kanal 2 (488, >585 nm) bzw. im Akzeptorkanal, Kanal 3 (561, >585 nm), erhalten wurden. Repräsentative Bilder von Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche exprimieren, GFP und Kirsche co-exprimieren und das GFP-Kirsch-Fusionsprotein exprimieren. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Cherry-Fusionsprotein exp...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Dieses Protokoll beschreibt einen Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozess und einen mathematischen Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung des Übersprechens der fluoreszierenden Proteine und der relativen Emissions- und Detektionseffizienz der Fluorophore im mikroskopischen Aufbau. Crosstalk kann durch bildgebende Zellen beurteilt werden, die nur ein Fluorophor exprimieren.Die Beurteilung der Detektionseffizienz eines Donor- oder Akzeptormoleküls erfordert die Kenntnis des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die das Messsignal erzeugen. Die Anzahl der Fluorophore, die in lebenden Zellen exprimiert werden, variiert von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Die bei dieser Methode verwendete Kalibriersonde, ein Eins-zu-Eins-Donor-Akzeptor-Fusionsprotein, ermöglicht es, die relative Detektionseffizienz von Donor- und Akzeptormolekülen zu bestimmen.Verwenden Sie zunächst einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor mit mCherry 1 zur Erzeugung der EGFP mCherry 1-Fusionssonde. Entwerfen Sie Oligonukleotide zur Amplifikation von EGFP ohne Stoppcodon als Zelle eines BAM-h1-Fragments. Der Fünf-Aminosäure-Linker zwischen dem grün und rot fluoreszierenden Protein sollte einen mittleren FRET-Mangel für das GFP-Kirsch-Donor-Akzeptor-Paar von 0,25 bis 0,3 ergeben.Verwenden Sie jede Zelllinie und jedes Medium ohne Phenolrot, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, trennen Sie sie mit einem Milliliter 0,05 % Trypsin EDTA und säen Sie etwa 10.000 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit acht Vertiefungen, indem Sie drei Tropfen aus einer Fünf-Milliliter-Zellsuspension hinzufügen. Transfizieren Sie die Zellen 24 Stunden nach der Beschichtung mit einem geeigneten Transfektionsmedium.Inkubieren Sie die Zellen 20 Stunden lang, bevor Sie lebende Zellen bilden, um eine ordnungsgemäße Expression des fluoreszierenden Proteins, eine Faltung und Reifung zu ermöglichen. Stellen Sie die Zellen in einer befeuchteten und beheizten Klimakammer bei 37 Grad Celsius mit einem konfokalen Rastermikroskop dar. Um das Zellmedium bei physiologischem pH-Wert zu puffern, fügen Sie 20 millimolare HEPES hinzu, um das Zellmedium kohlendioxidunabhängig zu machen.Montieren Sie dann den Objektträger auf dem Mikroskop. Verwenden Sie die 488-Nanometer-Linie des Argon-Ionenlasers, um das GFP anzuregen, und den 561-Nanometer-Diodenlaser, um Kirsche anzuregen. Richten Sie den 488-Nanometer-Laser für die Anregung in Kanal eins durch ein Emissionsband von 505 bis 530 Nanometern und in Kanal zwei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern ein.Verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser zur Anregung in Kanal drei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern. Anregen Sie die beiden Laser nacheinander an und stellen Sie den Bildgebungsmodus so ein, dass nach jeder Zeile umgeschaltet wird, sodass sich die Anregung des 512 x 512 Pixel großen Bildes nach jeder Zeile abwechselt. Richten Sie eine Mini-Zeitreihe mit drei Bildern ein, um zu erkennen, ob ein signifikantes Photobleaching auftritt, und reduzieren Sie gegebenenfalls die Laserleistung.Erstens, Bildzellen, die das GFP-Kirschfusionskonstrukt exprimieren. Legen Sie die Parameter fest, die die zeitintegrierte Laserintensität pro Pixel in einem konfokalen Bild definieren. Verwenden Sie ein 63-faches Ölobjektiv und einen auf 3-fach eingestellten Zoom, um eine Zelle in ihrer Gesamtheit mit ausreichender Vergrößerung und Auflösung abzubilden.Streben Sie eine Pixelgröße von 70 bis 80 Nanometern an. Stellen Sie die Pixelverweilzeit auf zwei bis vier Mikrosekunden und die AOTF-Übertragung für den 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Laser ein, so dass die Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Bleichen und keine Pixel zeigen, die eine Sättigung der Fluoreszenzintensität anzeigen. Stellen Sie die Laserleistung von 488 und 561 so ein, dass die Signalpegel in Kanal eins und Kanal drei ähnlich sind.Stellen Sie die Verstärkung des Fotomultiplikators auf 600 bis 800 ein. Abbildung 15 bis 20 Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, Zellen, die GFP, Kirsche, GFP und Kirsche exprimieren, und nicht durchtrennte Zellen. Dann bilden Sie Zellen ab, die die interessierenden Proteine koexprimieren, die an GFP bzw. Kirsche gekoppelt sind.Um FRET zu berechnen, messen Sie das Donorsignal in Kanal eins, dem Donorkanal mit 488 Nanometern Anregung und einer Emissionsbande von 505 bis 530 Nanometern. Messen Sie dann das Akzeptorsignal in Kanal drei, dem Akzeptorkanal mit 561 Nanometer Anregung und Emission bei über 585 Nanometern. Messen Sie schließlich das FRET-Signal in Kanal zwei, dem Übertragungskanal mit 488 Nanometern Anregung und Emission bei über 585 Nanometern.Das Signal in Kanal zwei ist eine Summe aus vier verschiedenen Komponenten: dem spektralen Spillover vom gelöschten Donorsignal in den über 585 Detektionskanal mit einem Übersprechfaktor S1, dem Akzeptorsignal aus direkter Anregung durch 488 Nanometerlicht mit einem Übersprechfaktor S2, der sensibilisierten Emission des Akzeptors durch FRET aus dem angeregten Donormolekül, und das Hintergrundsignal. Es wurden Bilder im Spenderkanal, im Transferkanal und im Akzeptorkanal erhalten, wobei Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche, GFP und Kirsche co-exprimieren, und das GFP-Kirschfusionsprotein gezeigt werden. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, und solche, die GFP-Kirschen co-exprimieren, werden im Vergleich zum Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, dem Intensitätsverhältnis oder dem molekularen Verhältnis in jeder Zelle aufgetragen.Pixel-für-Pixel-FRET-Bilder von Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, GFP und Kirsche als Negativkontrolle co-exprimieren und Rezeptoruntereinheiten des Ashwell-Morell-Rezeptors exprimieren, sind hier zu sehen. RHL1 und 2 des Leberlektins der Ratte wurden mit GFP und Kirsche auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran markiert. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade von Zellen, die GFP RHL1 und Cherry RHL2 exprimieren, und GFP RHL1 Delta Stock und Cherry RHL2 werden im Vergleich zum Molekülverhältnis von Akzeptor zu Spender aufgetragen.Der vorgestellte quantitative FRET-Ansatz ermöglicht Folgendes. Nachweis von Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle. Veränderungen der Proteininteraktionen im Laufe der Zeit.Unterschiede in den Wechselwirkungen in subzellulären Kompartimenten bis hinunter zur Pixel-für-Pixel-Ebene eines konfokalen Bildes. Und die Abhängigkeit des detektierten FRET-Signals vom molekularen Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, das in einer lebenden Zelle exprimiert wird.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...