Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
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Vorremmo ringraziare il Neuroscience Imaging Service della Stanford University School of Medicine per aver fornito attrezzature e spazio per questo progetto. Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento intramurale dello Stanford Cancer Institute e della Gynecologic Oncology Division Stanford, nonché da GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 dal National Research, Development and Innovation Office, Ungheria.

1. Costruzione plasmidica
<ol><li>Per generare la sonda di fusione eGFP-mCherry1, utilizzare un vettore di espressione cellulare di mammifero N1 (vedi Tabella dei materiali) con mCherry110 inserito utilizzando i siti di restrizione AgeI e BsrGI.</li>
	<li>Utilizzare i seguenti oligonucleotidi per amplificare eGFP11 senza codone di stop come frammento di SalI-BamHI : N-terminale primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC G...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Il protocollo presentato descrive in dettaglio l'uso della sonda di calibrazione della proteina fluorescente uno-a-uno geneticamente accoppiata per quantificare la FRET utilizzando la rilevazione dell'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per valutare le interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente in diversi compartimenti subcellulari. La risoluzione spaziale può essere ulteriormente miglio...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

L'analisi basata sulla microscopia del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) consente di valutare le interazioni tra proteine in cellule vive. Fornisce informazioni spaziali e temporali, comprese informazioni su dove nella cellula e in quale compartimento subcellulare avviene l'interazione e se questa interazione cambia nel tempo.
Theodor Förster pose le basi teoriche della FRET nel 19481. La FRET è un trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza delle molecole e dall'orientamento relativo dei loro dipoli di transizione, nonché dalla sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. La velocità di trasferimento di energia è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza donatore-accettore. Pertanto, FRET può essere utilizzato per misurare la prossimità molecolare nell'intervallo 1-10 nm.
La FRET compete con altri processi di deeccitazione della molecola donatrice e provoca il cosiddetto donor-quenching e l'emissione sensibilizzata dell'accettore. L'estinzione del donatore è una riduzione del numero di fotoni donatori emessi, mentre l'emissione sensibilizzata è un aumento dei fotoni accettori emessi. Molte analisi microscopiche FRET utilizzano misure di intensità di fluorescenza, tra cui il fotosbiancamento dell'accettore 2, il fotosbiancamento del donatore2 o il fotosbiancamento dell'accettore3 sensibilizzato al FRET.
Qui, un protocollo sperimentale passo-passo e un algoritmo matematico sono presentati per quantificare FRET utilizzando la tempra del donatore e l'emissione sensibilizzata all'accettore4,5, un metodo spesso indicato come FRET raziometrico. Sono stati pubblicati molti protocolli su come approssimare l'emissione sensibilizzata, pochi hanno quantificato l'efficienza assoluta FRET 6,7,8,9. La quantificazione delle efficienze FRET nella cellula vivente richiede la determinazione (i) della diafonia (spill-over spettrale o sanguinamento) delle proteine fluorescenti e, inoltre, (ii) dell'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Mentre la diafonia può essere valutata mediante imaging delle cellule che esprimono solo uno dei fluorofori, la valutazione dell'efficienza di rilevazione relativa della fluorescenza del donatore e dell'accettore è più complicata. Richiede la conoscenza almeno del rapporto tra il numero di molecole donatrici e accettori che danno origine ai segnali misurati. Il numero di fluorofori espressi nelle cellule vive varia, tuttavia, da cellula a cellula ed è sconosciuto. Il cosiddetto fattore α caratterizza le potenze del segnale relative da una singola molecola eccitata del donatore e dell'accettore. La conoscenza del fattore è un prerequisito per le misure quantitative raziometriche FRET in campioni con rapporti molecola accettore-donatore variabili come riscontrato durante l'imaging di cellule vive con proteine fluorescenti. L'utilizzo di una proteina di fusione donatore-accettore 1 a 1 come sonda di calibrazione consente la determinazione del fattore α e serve anche come controllo positivo. Questa sonda geneticamente accoppiata è espressa dalle cellule in quantità totali sconosciute ma in una quantità relativa fissa e nota di uno-a-uno. Il seguente protocollo spiega come costruire la sonda 1-to-1 e come utilizzarla per quantificare l'efficienza del FRET. Un foglio di calcolo che include tutte le formule può essere trovato nel supplemento e può essere utilizzato dai lettori per inserire le proprie misure nelle rispettive colonne come descritto di seguito.
Mentre il protocollo utilizza la coppia donatore/accettore GFP-Cherry, l'approccio presentato può essere eseguito con qualsiasi altra coppia FRET. Il file supplementare 1 fornisce dettagli sulle coppie ciano-giallo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è il trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza e dall'orientamento delle molecole, nonché dall'entità della sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. FRET permette di studiare l'interazione delle proteine nella cellula vivente nel tempo e in diversi compartimenti subcellulari. In letteratura sono stati descritti diversi algoritmi basati sull'intensità per misurare la FRET utilizzando la microscopia. Qui vengono forniti un protocollo e un algoritmo per quantificare l'efficienza FRET sulla base della misurazione sia dell'emissione sensibilizzata dell'accettore che della tempra della molecola donatrice. La quantificazione della FRET raziometrica nella cellula vivente richiede non solo la determinazione della diafonia (spill-over spettrale, o bleed-through) delle proteine fluorescenti, ma anche l'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Il protocollo fornito qui descrive come valutare questi parametri critici.

La Figura 1 mostra le immagini ottenute rispettivamente nel canale donatore, canale 1 (488, 505-530 nm), canale di trasferimento, canale 2 (488, >585 nm) e canale accettore, canale 3 (561, >585 nm). Immagini rappresentative di cellule che esprimono solo GFP, solo Cherry, che co-esprimono GFP e Cherry ed esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry. Le efficienze medie di FRET cellulare calcolate nelle cellule NRK che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Questo protocollo descrive un processo sperimentale passo-passo e un algoritmo matematico per quantificare la FRET utilizzando la tempra del donatore e l'emissione sensibilizzata all'accettore. La quantificazione delle efficienze FRET nella cellula vivente richiede la determinazione della diafonia delle proteine fluorescenti e delle relative efficienze di emissione e rilevazione dei fluorofori nella configurazione microscopica. La diafonia può essere valutata mediante imaging di cellule che esprimono un solo fluoroforo.La valutazione dell'efficienza di rilevazione di una molecola donatrice o accettore richiede la conoscenza del rapporto tra il numero di molecole donatrici e accettori che danno origine al segnale di misura. Il numero di fluorofori espressi nelle cellule vive varia da cellula a cellula ed è sconosciuto. La sonda di calibrazione utilizzata in questo metodo, una proteina di fusione donatore-accettore uno-a-uno, consente di determinare l'efficienza di rilevazione relativa delle molecole donatore e accettore.Per iniziare, utilizzare un vettore di espressione cellulare di mammifero N1 con mCherry 1 per generare la sonda di fusione EGFP mCherry 1. Progettare oligonucleotidi per amplificare EGFP senza un codone di stop come un frammento di cellula BAM h1. Il legame di cinque aminoacidi tra la proteina fluorescente verde e rossa dovrebbe produrre un deficit medio di FRET per la coppia donatore-accettore di ciliegie GFP da 0,25 a 0,3.Utilizzare qualsiasi linea cellulare e mezzo senza rosso fenolo per ridurre la fluorescenza di fondo. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, staccarle con un millilitro di 0,05% di tripsina EDTA e seminare circa 10.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a otto pozzetti aggiungendo tre gocce da una sospensione cellulare da cinque millilitri. 24 ore dopo la placcatura, trasfettare le cellule utilizzando un mezzo di trasfezione appropriato.Incubare le cellule per 20 ore prima dell'imaging delle cellule vive per consentire una corretta espressione, ripiegamento e maturazione delle proteine fluorescenti. Immagina le cellule in una camera ambientale umidificata e riscaldata a 37 gradi Celsius con un microscopio a scansione confocale. Per tamponare i mezzi cellulari a pH fisiologico, aggiungere 20 millimolari HEPES per rendere il mezzo cellulare indipendente dall'anidride carbonica.Quindi montare il vetrino sul microscopio. Utilizzare la linea a 488 nanometri del laser agli ioni di argon per eccitare la GFP e il laser a diodi a 561 nanometri per eccitare la ciliegia. Impostare il laser a 488 nanometri per l'eccitazione nel canale uno attraverso una banda di emissione da 505 a 530 nanometri e nel canale due con un filtro a passaggio lungo di oltre 585 nanometri.Utilizzare il laser a 561 nanometri per l'eccitazione nel canale tre con un filtro a passaggio lungo di oltre 585 nanometri. Eccitare i due laser in sequenza e impostare la modalità di imaging in modo che passi dopo ogni linea in modo che l'eccitazione dell'immagine da 512 x 512 pixel si alterni dopo ogni linea. Impostare una mini serie temporale di tre immagini per rilevare se si verifica un significativo photobleaching e ridurre la potenza del laser, se necessario.In primo luogo, le cellule dell'immagine che esprimono il costrutto di fusione delle ciliegie GFP. Impostare i parametri che definiscono l'intensità del laser integrata nel tempo per pixel in un'immagine confocale. Usa un obiettivo olio 63X e lo zoom impostato su 3X per visualizzare una cella nella sua interezza con ingrandimento e risoluzione sufficienti.Punta a una dimensione dei pixel da 70 a 80 nanometri. Impostare il tempo di permanenza dei pixel da due a quattro microsecondi e la trasmissione AOTF per il laser a 488 nanometri e 561 nanometri in modo tale che le immagini mostrino un buon rapporto segnale-rumore senza sbiancamento e senza pixel che indicano la saturazione dell'intensità della fluorescenza. Regolare la potenza laser di 488 e 561 in modo che i livelli di segnale nel canale uno e nel canale tre siano simili.Impostare il guadagno del moltiplicatore fotografico su 600-800. Immagine da 15 a 20 cellule che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP, cellule che esprimono GFP, ciliegia, GFP e ciliegia e cellule non transettate. Quindi le cellule di immagine co-esprimono le proteine di interesse accoppiate rispettivamente a GFP e ciliegia.Per calcolare FRET, misurare il segnale del donatore nel canale uno, il canale donatore con eccitazione a 488 nanometri e una banda di emissione da 505 a 530 nanometri. Quindi misurare il segnale accettore nel canale tre, il canale accettore con eccitazione a 561 nanometri ed emissione a oltre 585 nanometri. Infine, misurare il segnale FRET nel canale due, il canale di trasferimento con eccitazione a 488 nanometri ed emissione a oltre 585 nanometri.Il segnale nel canale due è una somma di quattro diverse componenti: lo spillover spettrale dal segnale del donatore spento nel canale di rilevamento over 585 con un fattore di diafonia S1, il segnale accettore dall'eccitazione diretta da luce a 488 nanometri con un fattore di diafonia S2, l'emissione sensibilizzata dell'accettore da parte di FRET dalla molecola donatrice eccitata, e il segnale di fondo. Le immagini sono state ottenute nel canale donatore, nel canale di trasferimento e nel canale accettore, sono mostrate le cellule che esprimono solo GFP, solo ciliegia, co-espressione GFP e ciliegia e la proteina di fusione della ciliegia GFP. Le efficienze medie di FRET cellulare calcolate nelle cellule NRK che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP e quelle che co-esprimono la ciliegia GFP sono tracciate rispetto al rapporto di intensità del rapporto accettore-donatore o al rapporto molecolare in ciascuna cellula.Qui sono mostrate immagini FRET normalizzate pixel per pixel di cellule che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP, che co-esprimono GFP e ciliegia come controllo negativo ed esprimono subunità recettoriali del recettore di Ashwell-Morell. RHL1 e 2 della lectina epatica del ratto sono stati marcati con GFP e ciliegia sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica. Le efficienze medie di FRET cellulare delle cellule che esprimono GFP RHL1 e ciliegia RHL2 e GFP RHL1 delta stock e ciliegia RHL2 sono tracciate rispetto al rapporto molecolare accettore-donatore.L'approccio FRET quantitativo presentato consente quanto segue. Rilevazione delle interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente. Cambiamenti nelle interazioni proteiche nel tempo.Differenze nelle interazioni nei compartimenti subcellulari fino al livello pixel per pixel di un'immagine confocale. E la dipendenza del segnale FRET rilevato dal rapporto accettore-donatore molecolare espresso in una cellula viva.

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Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...