Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Neuroscience Imaging Service ved Stanford University School of Medicine for å gi utstyr og plass til dette prosjektet. Denne forskningen ble støttet av intramural finansiering av Stanford Cancer Institute og Gynecologic Oncology Division Stanford, samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 fra National Research, Development and Innovation Office, Ungarn.

1. Plasmid konstruksjon
<ol><li>For å generere eGFP-mCherry1-fusjonssonden, bruk en N1 pattedyrcelleekspresjonsvektor (se materialfortegnelse) med mCherry110 satt inn ved hjelp av restriksjonsstedene AgeI og BsrGI.</li>
	<li>Bruk følgende oligonukleotider til å forsterke eGFP11 uten stoppkodon som SalI-BamHI fragment: N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' og C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Den presenterte protokollen beskriver bruken av den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonden for kvantifisering av FRET ved påvisning av sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet ved konfokalmikroskopi. Denne metoden kan brukes til å vurdere proteininteraksjoner i den levende cellens fysiologiske sammenheng i forskjellige subcellulære rom. Romlig oppløsning kan forbedres ytterligere ved å bruke den presenterte algoritmen til å beregne FRET-effektivitet i hver pikse...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Mikroskopibasert analyse av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) gjør det mulig å vurdere interaksjoner mellom proteiner i levende celler. Det gir romlig og tidsmessig informasjon, inkludert informasjon om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rom interaksjonen finner sted, og om denne interaksjonen endres over tid.
Theodor Förster la det teoretiske grunnlaget for FRET i 19481. FRET er en strålingsfri overføring av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av avstanden til molekylene og den relative orienteringen av deres overgangsdipoler, samt overlappingen mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. Hastigheten av energioverføring er omvendt proporsjonal med den sjette kraften i donor-akseptoravstanden. Dermed kan FRET brukes til å måle molekylær nærhet i området 1-10 nm.
FRET konkurrerer med andre de-eksitasjonsprosesser av donormolekylet og resulterer i såkalt donor-quenching og sensibilisert utslipp av akseptoren. Donor-quenching er en reduksjon av antall utstrålede donorfotoner, mens sensibilisert utslipp er en økning i utsendte akseptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruker fluorescensintensitetsmålinger, inkludert akseptorfotobleking 2, donorfotobleking2 eller FRET-sensibilisert fotobleking av akseptoren3.
Her presenteres en trinnvis eksperimentell protokoll og matematisk algoritme for å kvantifisere FRET ved hjelp av donorslukking og akseptorsensibilisert utslipp4,5, en metode som ofte refereres til som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om hvordan man tilnærmer seg sensibilisert utslipp har blitt publisert, få har kvantifisert den absolutte FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifiseringen av FRET-effektivitet i den levende cellen krever bestemmelse av (i) crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner og også (ii) deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Mens crosstalk kan vurderes ved å avbilde celler som uttrykker bare en av fluoroforene, er vurderingen av den relative deteksjonseffektiviteten til donoren og akseptorfluorescensen mer komplisert. Det krever kunnskap om minst forholdet mellom antall donor- og akseptormolekyler som gir opphav til de målte signalene. Antallet fluoroforer uttrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukjent. Den såkalte α-faktoren karakteriserer de relative signalstyrkene fra et enkelt eksitert donor- og akseptormolekyl. Kunnskap om faktoren er en forutsetning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable akseptor-til-donor-molekylforhold som påtruffet under levende celleavbildning med fluorescerende proteiner. Ved å bruke et 1-til-1 donor-akseptorfusjonsprotein som en kalibreringssonde kan bestemmelsen av den α faktoren og fungerer også som en positiv kontroll. Denne genetisk koblede sonden uttrykkes av celler i ukjente totale mengder, men i en fast og kjent relativ mengde en-til-en. Følgende protokoll beskriver hvordan man konstruerer 1-til-1-sonden og hvordan man bruker den til kvantifisering av FRET-effektivitet. Et regneark som inneholder alle formler finnes i tillegget og kan brukes av leserne til å legge inn sine egne målinger i de respektive kolonnene som beskrevet nedenfor.
Mens protokollen bruker GFP-Cherry donor / akseptorpar, kan den presenterte tilnærmingen utføres med et hvilket som helst annet FRET-par. Tilleggsfil 1 gir detaljer om cyangule par.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfrie overføringen av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av molekylets avstand og orientering, samt omfanget av overlapping mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. FRET tillater å studere samspillet mellom proteiner i levende celle over tid og i forskjellige subcellulære rom. Ulike intensitetsbaserte algoritmer for å måle FRET ved mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her er en protokoll og en algoritme gitt for å kvantifisere FRET-effektivitet basert på måling av både sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet. Kvantifiseringen av ratiometrisk FRET i den levende cellen krever ikke bare bestemmelse av crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner, men også deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Protokollen som er gitt her, beskriver hvordan man vurderer disse kritiske parametrene.

Figur 1 viser bildene tatt i henholdsvis donorkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), overføringskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) og akseptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Representative bilder av celler som kun uttrykker GFP, kun kirsebær, som uttrykker GFP og kirsebær, og uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet. De gjennomsnittlige cellulære FRET-effektivitetene beregnet i NRK-celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsprotein (positiv kontroll, figur 2A) og...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fluoroformolekyler kan brukes til å studere proteininteraksjoner i den levende cellen. Her er det gitt en protokoll for hvordan man måler FRET i levende celler ved å oppdage sensibilisert utslipp av akseptoren og slukke donormolekylet ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi.

Vurdering av proteininteraksjoner i levende celler med FRET-sensibilisert utslipp

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Denne protokollen beskriver en trinnvis eksperimentell prosess og matematisk algoritme for å kvantifisere FRET ved hjelp av donorslukking og akseptorsensibilisert utslipp. Kvantifiseringen av FRET-effektivitet i levende celle krever bestemmelse av krysssnakk av fluorescerende proteiner og den relative utslipps- og deteksjonseffektiviteten til fluoroforene i det mikroskopiske oppsettet. Crosstalk kan vurderes ved å avbilde celler som uttrykker bare en fluorofor.Vurdering av deteksjonseffektiviteten til en donor eller et akseptormolekyl krever kunnskap om forholdet mellom antall donor- og akseptermolekyler som gir opphav til målesignalet. Antall fluoroforer uttrykt i levende celler varierer fra celle til celle og er ukjent. Kalibreringssonden som brukes i denne metoden, et en-til-en donor-akseptorfusjonsprotein, gjør det mulig å bestemme den relative deteksjonseffektiviteten til donor- og akseptormolekyler.For å begynne, bruk en N1 pattedyrcelleuttrykksvektor med mCherry 1 for å generere EGFP mCherry 1-fusjonssonden. Design oligonukleotider for å amplifisere EGFP uten stoppkodon som et celle en BAM h1-fragment. De fem aminosyrelinkerne mellom det grønne og røde fluorescerende proteinet skal gi en gjennomsnittlig FRET-mangel for GFP-kirsebærdonor-akseptorparet på 0,25 til 0,3.Bruk hvilken som helst cellelinje og media uten fenolrød for å redusere bakgrunnsfluorescens. Når cellene er 80% konfluerende, løsner de med en milliliter 0,05% trypsin EDTA og frø ca. 10 000 celler i hver brønn på en åtte-brønnsplate ved å tilsette tre dråper fra en fem milliliter cellesuspensjon. 24 timer etter plating, transfekt cellene ved hjelp av et passende transfeksjonsmedium.Inkuber cellene i 20 timer før levende celleavbildning for å muliggjøre riktig fluorescerende proteinuttrykk, folding og modning. Bilde cellene i et fuktet og oppvarmet miljøkammer ved 37 grader Celsius med et konfokal skanningsmikroskop. For å bufre cellemediet ved fysiologisk pH, tilsett 20 millimolære HEPES for å gjøre cellemediet karbondioksid uavhengig.Monter deretter lysbildet på mikroskopet. Bruk 488 nanometerlinjen til argonionlaseren for å opphisse GFP og 561 nanometerdiodelaseren for å opphisse kirsebær. Sett opp 488 nanometer laser for eksitasjon i kanal en gjennom et utslippsbånd på 505 til 530 nanometer og i kanal to med et langpassfilter på over 585 nanometer.Bruk 561 nanometer laser for eksitering i kanal tre med et langpassfilter på over 585 nanometer. Eksiter de to laserne sekvensielt og still inn bildemodusen til å bytte etter hver linje, slik at eksiteringen av bildet på 512 x 512 piksler veksler etter hver linje. Sett opp en mini-tidsserie med tre bilder for å oppdage om det oppstår betydelig fotobleking og reduser lasereffekten om nødvendig.Først bildeceller som uttrykker GFP-kirsebærfusjonskonstruksjonen. Angi parameterne som definerer tidsintegrert laserintensitet per piksel i et konfokalt bilde. Bruk et 63X oljemål og zoom satt til 3X for å avbilde en celle i sin helhet med tilstrekkelig forstørrelse og oppløsning.Sikt etter en pikselstørrelse på 70 til 80 nanometer. Sett pikseloppholdstid til to til fire mikrosekunder og AOTF-overføring for 488 nanometer og 561 nanometer laser slik at bildene viser et godt signal-til-støy-forhold uten bleking og ingen piksler som indikerer fluorescensintensitetsmetning. Juster lasereffekten på 488 og 561 slik at signalnivåene i kanal én og kanal tre er like.Sett fotomultiplikatorforsterkningen til 600 til 800. Bilde 15 til 20 celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet, celler som uttrykker GFP, kirsebær, GFP og kirsebær, og ikke-transekterte celler. Deretter bildeceller som uttrykker proteinene av interesse koblet til henholdsvis GFP og kirsebær.For å beregne FRET, måle donorsignalet i kanal en, donorkanalen med 488 nanometer eksitasjon og et utslippsbånd på 505 til 530 nanometer. Mål deretter akseptorsignalet i kanal tre, akseptorkanalen med 561 nanometer eksitasjon og utslipp ved over 585 nanometer. Til slutt måler du FRET-signalet i kanal to, overføringskanalen med 488 nanometer eksitasjon og utslipp på over 585 nanometer.Signalet i kanal to er en sum av fire forskjellige komponenter: spektral spillover fra det slukkede donorsignalet til over 585-deteksjonskanalen med en crosstalk-faktor S1, akseptorsignalet fra direkte eksitasjon av 488 nanometer lys med en crosstalk-faktor S2, den sensibiliserte utslippet av akseptoren av FRET fra det eksiterte donormolekylet, og bakgrunnssignalet. Bilder ble oppnådd i donorkanalen, overføringskanalen og akseptorkanalen, celler som bare uttrykker GFP, kun kirsebær, som uttrykker GFP og kirsebær, og GFP-kirsebærfusjonsproteinet er vist. De gjennomsnittlige cellulære FRET-effektivitetene beregnet i NRK-celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsprotein og de som uttrykker GFP-kirsebær sammen, plottes mot akseptor-til-donor-ratio-intensitetsforholdet eller molekylforholdet i hver celle.Normaliserte piksel for piksel FRET-bilder av celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet, som samtidig uttrykker GFP og kirsebær som en negativ kontroll, og uttrykker reseptorunderenheter av Ashwell-Morell-reseptoren er vist her. RHL1 og 2 av leverlektin fra rotter ble merket med GFP og kirsebær på cytoplasmatisk side av plasmamembranen. Den gjennomsnittlige cellulære FRET-effektiviteten til celler som uttrykker GFP RHL1 og kirsebær RHL2 og GFP RHL1 deltabestand og kirsebær RHL2 er plottet mot akseptor-til-donor molekylært forhold.Den presenterte kvantitative FRET-tilnærmingen åpner for følgende. Påvisning av proteininteraksjoner i den levende cellens fysiologiske kontekst. Endringer i proteininteraksjoner over tid.Forskjeller i interaksjoner i subcellulære rom ned til piksel-for-pikselnivå i et konfokalt bilde. Og avhengigheten av det oppdagede FRET-signalet på det molekylære akseptor-til-donorforholdet uttrykt i en levende celle.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering Høy tetthet funksjonelt protein Mikromatriser å oppdage Protein-protein interaksjoner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...