Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Serviço de Imagem de Neurociência da Escola de Medicina da Universidade de Stanford por fornecer equipamentos e espaço para este projeto. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento intramural do Stanford Cancer Institute e da Gynecologic Oncology Division Stanford, bem como pelo GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 do Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, Hungria.

1. Construção do plasmídeo
<ol><li>Para gerar a sonda de fusão eGFP-mCherry1, use um vetor de expressão de células de mamíferos N1 (ver Tabela de Materiais) com mCherry110 inserido usando os locais de restrição AgeI e BsrGI.</li>
	<li>Utilizar os seguintes oligonucleótidos para amplificar a eGFP11 sem um códon de paragem como fragmento de SalI-BamHI : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G ...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

O protocolo apresentado detalha o uso da sonda de calibração de proteínas fluorescentes um-para-um acoplada geneticamente para quantificação do FRET utilizando a detecção de emissão sensibilizada do aceptor e têmpera da molécula doadora por microscopia confocal. Este método pode ser aplicado para avaliar as interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva em diferentes compartimentos subcelulares. A resolução espacial pode ser melhorada ainda mais aplicando o algoritmo apresentado para calcula...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

A análise baseada em microscopia da Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET) permite a avaliação das interações entre proteínas em células vivas. Ele fornece informações espaciais e temporais, incluindo informações sobre onde na célula e em qual compartimento subcelular a interação ocorre e se essa interação muda ao longo do tempo.
Theodor Förster lançou as bases teóricas do FRET em 19481. FRET é uma transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância das moléculas e da orientação relativa de seus dipolos de transição, bem como da sobreposição entre os espectros de emissão e absorção do doador e do aceitador. A taxa de transferência de energia é inversamente proporcional à sexta potência da distância doador-aceitador. Assim, o FRET pode ser usado para medir a proximidade molecular na faixa de 1-10 nm.
O FRET compete com outros processos de desexcitação da molécula doadora e resulta na chamada extinção do doador e na emissão sensibilizada do aceitador. A têmpera de doadores é uma redução do número de fótons de doadores emitidos, enquanto a emissão sensibilizada é um aumento nos fótons aceptores emitidos. Muitas análises microscópicas de FRET usam medidas de intensidade de fluorescência, incluindo fotobranqueamento do aceitador 2, fotobranqueamento do doador2 ou fotobranqueamento sensibilizado pelo FRET do aceitador3.
Aqui, um protocolo experimental passo-a-passo e um algoritmo matemático são apresentados para quantificar o FRET usando a têmpera do doador e a emissão sensibilizada pelo aceitador4,5, um método muitas vezes referido como FRET ratiométrico. Muitos protocolos sobre como aproximar a emissão sensibilizada têm sido publicados, poucos quantificaram a eficiência absoluta do FRET 6,7,8,9. A quantificação das eficiências de FRET na célula viva requer a determinação (i) do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes e, também (ii) da eficiência de detecção da configuração microscópica. Embora o crosstalk possa ser avaliado por células de imagem que expressam apenas um dos fluoróforos, a avaliação da eficiência relativa de detecção da fluorescência do doador e do aceitador é mais complicada. Requer o conhecimento de, pelo menos, a razão entre o número de moléculas doadoras e aceitadoras que dão origem aos sinais medidos. O número de fluoróforos expressos em células vivas varia, no entanto, de célula para célula e é desconhecido. O chamado fator de α caracteriza as forças relativas do sinal de uma única molécula excitado doador e aceitador. O conhecimento do fator é um pré-requisito para medições quantitativas de FRET ratiométrico em amostras com proporções variáveis de moléculas aceitador-doador, conforme encontrado durante imagens de células vivas com proteínas fluorescentes. O uso de uma proteína de fusão doador-aceptor 1 para 1 como sonda de calibração permite a determinação do fator α e também serve como um controle positivo. Esta sonda geneticamente acoplada é expressa por células em quantidades totais desconhecidas, mas em uma quantidade relativa fixa e conhecida de um-para-um. O protocolo a seguir estabelece como construir a sonda 1 para 1 e como usá-la para quantificação da eficiência do FET. Uma planilha que inclui todas as fórmulas pode ser encontrada no suplemento e pode ser usada pelos leitores para inserir suas próprias medidas nas respectivas colunas, conforme descrito abaixo.
Embora o protocolo utilize o par doador/aceitador GFP-Cherry, a abordagem apresentada pode ser realizada com qualquer outro par FET. O Arquivo Suplementar 1 fornece detalhes sobre pares ciano-amarelo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) é a transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância e orientação das moléculas, bem como da extensão da sobreposição entre os espectros de emissão do doador e absorção do aceitador. FRET permite estudar a interação de proteínas na célula viva ao longo do tempo e em diferentes compartimentos subcelulares. Diferentes algoritmos baseados em intensidade para medir FRET usando microscopia têm sido descritos na literatura. Aqui, um protocolo e um algoritmo são fornecidos para quantificar a eficiência do FRET com base na medição da emissão sensibilizada do aceptor e da têmpera da molécula doadora. A quantificação do FRET ratiométrico na célula viva não requer apenas a determinação do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes, mas também a eficiência de detecção da configuração microscópica. O protocolo fornecido aqui detalha como avaliar esses parâmetros críticos.

A Figura 1 mostra as imagens obtidas no canal doador, canal 1 (488, 505-530 nm), canal de transferência, canal 2 (488, >585 nm) e canal aceitador, canal 3 (561, >585 nm), respectivamente. Imagens representativas de células expressando apenas GFP, somente Cherry, co-expressando GFP e Cherry e expressando a proteína de fusão GFP-Cherry. As eficiências celulares médias de FRET calculadas em células NRK que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry (contr...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Este protocolo descreve um processo experimental passo-a-passo e um algoritmo matemático para quantificar o FRET usando a têmpera do doador e a emissão sensibilizada pelo aceitador. A quantificação das eficiências de FRET na célula viva requer a determinação do crosstalk das proteínas fluorescentes e das eficiências relativas de emissão e detecção dos fluoróforos na configuração microscópica. O crosstalk pode ser avaliado por células de imagem que expressam apenas um fluoróforo.A avaliação da eficiência de detecção de uma molécula dadora ou de uma molécula aceptora requer um conhecimento da razão entre o número de moléculas dadoras e aceitadoras que dão origem ao sinal de medida. O número de fluoróforos expressos em células vivas varia de célula para célula e é desconhecido. A sonda de calibração utilizada neste método, uma proteína de fusão um-para-um doador-aceptor, permite determinar a eficiência relativa de detecção de moléculas doadoras e aceitadoras.Para começar, use um vetor de expressão de células de mamíferos N1 com mCherry 1 para gerar a sonda de fusão EGFP mCherry 1. Projetar oligonucleotídeos para amplificar o EGFP sem um códon de parada como um fragmento de célula um BAM h1. O ligador de cinco aminoácidos entre a proteína fluorescente verde e vermelha deve produzir uma deficiência média de FRET para o par doador-aceptor de cereja GFP de 0,25 a 0,3.Use qualquer linhagem celular e meio sem vermelho de fenol para reduzir a fluorescência de fundo. Uma vez que as células estejam 80% confluentes, separe-as com um mililitro de EDTA de 0,05% de tripsina e semeie cerca de 10.000 células em cada poço de uma placa de oito poços, adicionando três gotas de uma suspensão celular de cinco mililitros. 24 horas após o revestimento, transfecte as células usando um meio de transfecção apropriado.Incubar as células por 20 horas antes da imagem de células vivas para permitir a expressão, o enovelamento e a maturação adequados de proteínas fluorescentes. Fotografe as células em uma câmara ambiental umidificada e aquecida a 37 graus Celsius com um microscópio de varredura confocal. Para tamponar o meio celular em pH fisiológico, adicione 20 HEPES milimolares para tornar o meio celular independente do dióxido de carbono.Em seguida, monte a lâmina no microscópio. Use a linha de 488 nanômetros do laser de íons de argônio para excitar a GFP e o laser de diodo de 561 nanômetros para excitar a cereja. Configure o laser de 488 nanômetros para excitação no canal um através de uma banda de emissão de 505 a 530 nanômetros e no canal dois com um filtro de passagem longa de mais de 585 nanômetros.Use o laser de 561 nanômetros para excitação no canal três com um filtro passa-longo de mais de 585 nanômetros. Excite os dois lasers sequencialmente e defina o modo de imagem para alternar após cada linha para que a excitação da imagem de 512 por 512 pixels se alterne após cada linha. Configure uma minissérie temporal de três imagens para detectar se ocorre fotobranqueamento significativo e reduzir a potência do laser, se necessário.Primeiro, células de imagem expressando a construção de fusão de cereja GFP. Defina os parâmetros que definem a intensidade do laser integrada ao tempo por pixel em uma imagem confocal. Use uma objetiva de óleo de 63X e zoom definido como 3X para criar uma imagem de uma célula em sua totalidade com ampliação e resolução suficientes.Aponte para um tamanho de pixel de 70 a 80 nanômetros. Defina o tempo de permanência de pixels para dois a quatro microssegundos e a transmissão AOTF para o laser de 488 nanômetros e 561 nanômetros, de modo que as imagens mostrem uma boa relação sinal-ruído sem qualquer branqueamento e sem pixels indicando saturação de intensidade de fluorescência. Ajuste a potência do laser de 488 e 561 de modo que os níveis de sinal no canal um e no canal três sejam semelhantes.Defina o ganho do multiplicador de fotos para 600 a 800. Imagem 15 a 20 células expressando a proteína de fusão de cereja GFP, células expressando GFP, cereja, GFP e cereja e células não transectadas. Em seguida, as células de imagem co-expressando as proteínas de interesse acopladas à GFP e à cereja, respectivamente.Para calcular o FRET, meça o sinal do doador no canal um, o canal doador com excitação de 488 nanômetros e uma banda de emissão de 505 a 530 nanômetros. Em seguida, meça o sinal aceitador no canal três, o canal aceitador com excitação de 561 nanômetros e emissão acima de 585 nanômetros. Finalmente, meça o sinal FRET no canal dois, o canal de transferência com excitação e emissão de 488 nanômetros acima de 585 nanômetros.O sinal no canal dois é uma soma de quatro componentes diferentes: o transbordamento espectral do sinal do doador apagado para o canal de detecção acima de 585 com um fator de crosstalk S1, o sinal aceptor da excitação direta por luz de 488 nanômetros com um fator de crosstalk S2, a emissão sensibilizada do aceitador pelo FRET a partir da molécula doadora excitada, e o sinal de fundo. As imagens foram obtidas no canal doador, no canal de transferência e no canal aceptor, células expressando GFP apenas, cereja apenas, co-expressando GFP e cereja, e a proteína de fusão de cereja GFP são mostradas. As eficiências celulares médias de FRET calculadas em células NRK que expressam a proteína de fusão de cereja GFP e aquelas que co-expressam a cereja GFP são plotadas versus a razão de intensidade da relação aceptor-doador ou razão molecular em cada célula.Imagens FRET pixelizadas pixel a pixel de células expressando a proteína de fusão de cereja GFP, co-expressando GFP e cereja como um controle negativo e expressando subunidades receptoras do receptor Ashwell-Morell são mostradas aqui. RHL1 e 2 da lectina hepática de rato foram marcados com GFP e cereja no lado citoplasmático da membrana plasmática. As eficiências celulares médias de FRET das células que expressam GFP RHL1 e do estoque delta de cereja RHL2 e GFP RHL1 e RHL2 de cereja são plotadas versus a relação molecular aceptor-doador.A abordagem quantitativa FRET apresentada permite o seguinte. Detecção de interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva. Mudanças nas interações proteicas ao longo do tempo.Diferenças nas interações em compartimentos subcelulares até o nível de pixel por pixel de uma imagem confocal. E a dependência do sinal FRET detectado da relação aceptor-doador molecular expressa em uma célula viva.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...