Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Службу визуализации неврологии в Медицинской школе Стэнфордского университета за предоставление оборудования и места для этого проекта. Это исследование было поддержано очным финансированием Стэнфордского института рака и отделения гинекологической онкологии Стэнфорда, а также GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 от Национального управления исследований, разработок и инноваций, Венгрия.

1. Плазмидная конструкция
<ol><li>Для генерации зонда слияния eGFP-mCherry1 используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 (см. Таблицу материалов) со вставленным mCherry110 с использованием сайтов рестрикции AgeI и BsrGI.</li>
	<li>Используйте следующие олигонуклеотид...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

В представленном протоколе подробно описано использование генетически связанного взаимно-однозначного калибровочного зонда флуоресцентного белка для количественной оценки FRET с использованием детектирования сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы ме...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Анализ резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе микроскопии позволяет оценить взаимодействия между белками в живых клетках. Он предоставляет пространственную и временную информацию, включая информацию о том, где в клетке и в каком субклеточном компартменте происходит взаимодействие, и изменяется ли это взаимодействие с течением времени.
Теодор Фёрстер заложил теоретическую основу FRET в 1948 году1. FRET представляет собой безрадиационную передачу энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния между молекулами и относительной ориентации их переходных диполей, а также от перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. Скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния донор-акцептор. Таким образом, FRET можно использовать для измерения молекулярной близости в диапазоне 1-10 нм.
FRET конкурирует с другими процессами девозбуждения молекулы-донора и приводит к так называемому донор-гашению и сенсибилизированному излучению акцептора. Донорное гашение — это уменьшение количества испускаемых фотонов-доноров, в то время как сенсибилизированное излучение — увеличение испускаемых акцепторных фотонов. Во многих микроскопических анализах FRET используются измерения интенсивности флуоресценции, включая акцепторное фотообесцвечивание 2, донорское фотообесцвечивание2 или FRET-сенсибилизированное фотообесцвечивание акцептора3.
Здесь представлен пошаговый экспериментальный протокол и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорного гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения4,5, метода, часто называемого ратиометрическим FRET. Было опубликовано много протоколов о том, как аппроксимировать сенсибилизированное излучение, лишь немногие количественно определили абсолютную эффективность FRET 6,7,8,9. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения (i) перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, а также (ii) эффективности обнаружения микроскопической установки. В то время как перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один из флуорофоров, оценка относительной эффективности обнаружения донорской и акцепторной флуоресценции является более сложной. Это требует знания, по крайней мере, соотношения числа молекул-доноров и акцепторов, порождающих измеряемые сигналы. Однако количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Так называемый фактор α характеризует относительную силу сигнала от одной возбужденной молекулы-донора и акцептора. Знание фактора является необходимым условием для количественных измерений коэффициентометрического FRET в образцах с переменным отношением акцепторных и донорных молекул, как это происходит во время визуализации живых клеток флуоресцентными белками. Использование белка слияния донора-акцептора 1 к 1 в качестве калибровочного зонда позволяет определить фактор α, а также служит положительным контролем. Этот генетически связанный зонд экспрессируется клетками в неизвестных общих количествах, но в фиксированном и известном относительном количестве один к одному. В следующем протоколе изложено, как построить зонд 1-к-1 и как использовать его для количественной оценки эффективности FRET. Электронная таблица, включающая все формулы, может быть найдена в приложении и может использоваться читателями для ввода своих собственных измерений в соответствующие столбцы, как указано ниже.
В то время как протокол использует пару донор/акцептор GFP-Cherry, представленный подход может быть выполнен с любой другой парой FRET. Дополнительный файл 1 содержит подробную информацию о голубо-желтых парах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.

На рисунке 1 показаны изображения, полученные в донорном канале, канале 1 (488, 505-530 нм), канале передачи, канале 2 (488, >585 нм) и акцепторном канале, канале 3 (561, >585 нм) соответственно. Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих только GFP, только вишню, ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между двумя молекулами флуорофора может быть использован для изучения белковых взаимодействий в живой клетке. Здесь представлен протокол о том, как измерять FRET в живых клетках путем обнаружения сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Этот протокол описывает пошаговый экспериментальный процесс и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорского гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения перекрестных помех флуоресцентных белков и относительной эффективности излучения и обнаружения флуорофоров в микроскопической установке. Перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один флуорофор.Оценка эффективности детектирования донора или акцепторной молекулы требует знания соотношения числа донорных и акцепторных молекул, дающих сигнал измерения. Количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Калибровочный зонд, используемый в этом методе, взаимно-однозначный донорно-акцепторный слитый белок, позволяет определить относительную эффективность обнаружения донорных и акцепторных молекул.Для начала используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 с mCherry 1 для создания термоядерного зонда EGFP mCherry 1. Проектирование олигонуклеотидов для амплификации EGFP без стоп-кодона в виде клеточного фрагмента BAM h1. Линкер из пяти аминокислот между зеленым и красным флуоресцентным белком должен давать средний дефицит FRET для пары донор-акцептор вишни GFP от 0,25 до 0,3.Используйте любую клеточную линию и среду без фенолового красного, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. Как только клетки будут на 80% сливаться, отделите их одним миллилитром 0,05% трипсина ЭДТА и засейте около 10 000 клеток в каждую лунку восьмилуночной пластины, добавив три капли из пятимиллилитровой клеточной суспензии. Через 24 часа после нанесения покрытия трансфицируйте клетки, используя соответствующую среду для трансфекции.Инкубируйте клетки в течение 20 часов перед визуализацией живых клеток, чтобы обеспечить надлежащую экспрессию, сворачивание и созревание флуоресцентного белка. Сфотографируйте клетки в увлажненной и нагретой камере окружающей среды при температуре 37 градусов Цельсия с помощью конфокального сканирующего микроскопа. Чтобы буферизовать клеточную среду при физиологическом pH, добавьте 20 миллимолярных HEPES, чтобы сделать клеточную среду независимой от углекислого газа.Затем установите предметное стекло на микроскоп. Используйте 488-нанометровую линию аргоново-ионного лазера для возбуждения GFP и 561-нанометровый диодный лазер для возбуждения вишни. Настройте 488-нанометровый лазер для возбуждения в первом канале через полосу излучения от 505 до 530 нанометров и во втором канале с фильтром длинных проходов более 585 нанометров.Используйте 561-нанометровый лазер для возбуждения в третьем канале с фильтром длинных проходов более 585 нанометров. Последовательно возбуждайте два лазера и установите режим визуализации на переключение после каждой строки, чтобы возбуждение изображения размером 512 на 512 пикселей чередовалось после каждой линии. Настройте мини-временной ряд из трех изображений, чтобы определить, происходит ли значительное фотообесцвечивание, и при необходимости уменьшить мощность лазера.Во-первых, ячейки изображения, экспрессирующие конструкцию слияния вишни GFP. Задайте параметры, определяющие интегрированную по времени интенсивность лазера на пиксель в конфокальном изображении. Используйте 63-кратный масляный объектив и 3-кратное увеличение, чтобы получить изображение ячейки целиком с достаточным увеличением и разрешением.Стремитесь к размеру пикселя от 70 до 80 нанометров. Установите время выдержки пикселя на две-четыре микросекунды и передачу AOTF для лазера 488 нанометра и 561 нанометра таким образом, чтобы изображения показывали хорошее соотношение сигнал/шум без какого-либо обесцвечивания и без пикселей, указывающих на насыщенность интенсивности флуоресценции. Отрегулируйте мощность лазера 488 и 561 таким образом, чтобы уровни сигнала в первом и третьем каналах были одинаковыми.Установите коэффициент усиления множителя фотографии от 600 до 800. Изображение От 15 до 20 клеток, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, клетки, экспрессирующие GFP, вишню, GFP и вишню, и нетрансецированные клетки. Затем изображения клеток, совместно экспрессирующих интересующие белки, связанные с GFP и вишней соответственно.Чтобы рассчитать FRET, измерьте донорский сигнал в первом канале, донорском канале с возбуждением 488 нанометров и полосой излучения от 505 до 530 нанометров. Затем измерьте акцепторный сигнал в третьем канале, канале акцептора с возбуждением 561 нанометр и излучением выше 585 нанометров. Наконец, измерьте сигнал FRET во втором канале, передаточном канале с возбуждением 488 нанометров и излучением при температуре выше 585 нанометров.Сигнал во втором канале представляет собой сумму четырех различных составляющих: спектральный перетекание от погашенного донорского сигнала к каналу детектирования более 585 с коэффициентом перекрестных помех S1, акцепторный сигнал от прямого возбуждения 488-нанометровым светом с коэффициентом перекрестных помех S2, сенсибилизированное излучение акцептора FRET от возбужденной молекулы-донора, и фоновый сигнал. Изображения были получены в донорском канале, транспортном канале и акцепторном канале, показаны клетки, экспрессирующие только GFP, только вишня, коэкспрессирующие GFP и вишня, а также белок слияния вишни GFP. Средняя клеточная эффективность FRET, рассчитанная в клетках NRK, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, и в клетках, совместно экспрессирующих вишню GFP, строится в зависимости от отношения акцептора к донору, отношения интенсивности или молекулярного отношения в каждой клетке.Здесь показаны нормализованные попиксельные FRET-изображения клеток, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, коэкспрессирующих GFP и вишню в качестве отрицательного контроля, а также экспрессирующих рецепторных субъединиц рецептора Эшвелла-Морелла. RHL1 и 2 лектина печени крысы были помечены GFP и вишней на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Средняя клеточная эффективность FRET клеток, экспрессирующих GFP RHL1 и вишневый RHL2 и GFP RHL1 дельта-запас и вишневый RHL2, построены в зависимости от молекулярного отношения акцептора к донору.Представленный количественный подход FRET позволяет добиться следующего. Обнаружение белковых взаимодействий в физиологическом контексте живой клетки. Изменения в белковых взаимодействиях с течением времени.Различия во взаимодействиях в субклеточных компартментах вплоть до попиксельного уровня конфокального изображения. И зависимость детектируемого сигнала FRET от молекулярного отношения акцептора к донору, выраженного в живой клетке.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...