Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
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Nos gustaría agradecer al Servicio de Imágenes de Neurociencia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford por proporcionar equipos y espacio para este proyecto. Esta investigación fue apoyada por fondos intramuros del Instituto de Cáncer de Stanford y la División de Oncología Ginecológica de Stanford, así como GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación, Hungría.

1. Construcción de plásmidos
<ol><li>Para generar la sonda de fusión eGFP-mCherry1, utilice un vector de expresión celular de mamíferos N1 (consulte la Tabla de materiales) con mCherry110 insertado utilizando los sitios de restricción AgeI y BsrGI.</li>
	<li>Utilice los siguientes oligonucleótidos para amplificar eGFP11 sin un codón de parada como fragmento SalI-BamHI : cebador N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG A...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

El protocolo presentado detalla el uso de la sonda de calibración de proteínas fluorescentes uno a uno acoplada genéticamente para cuantificar FRET utilizando la detección de emisión sensibilizada del aceptor y enfriamiento de la molécula donante por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para evaluar las interacciones de proteínas en el contexto fisiológico de la célula viva en diferentes compartimentos subcelulares. La resolución espacial se puede mejorar aún más aplicando el algoritmo present...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

El análisis basado en microscopía de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) permite evaluar las interacciones entre proteínas en células vivas. Proporciona información espacial y temporal, incluida información sobre dónde en la célula y en qué compartimento subcelular tiene lugar la interacción y si esta interacción cambia con el tiempo.
Theodor Förster sentó las bases teóricas de FRET en 19481. FRET es una transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia de las moléculas y la orientación relativa de sus dipolos de transición, así como de la superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. La tasa de transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia donante-aceptante. Por lo tanto, FRET se puede utilizar para medir la proximidad molecular en el rango de 1-10 nm.
FRET compite con otros procesos de desexcitación de la molécula donante y da como resultado la llamada emisión sensibilizada y de enfriamiento del donante. La extinción del donante es una reducción del número de fotones donantes emitidos, mientras que la emisión sensibilizada es un aumento de los fotones aceptores emitidos. Muchos análisis FRET microscópicos utilizan mediciones de intensidad de fluorescencia, incluido el fotoblanqueo aceptor 2, el fotoblanqueo del donante2 o el fotoblanqueo sensibilizado por FRET del aceptor3.
Aquí, se presenta un protocolo experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por aceptor4,5, un método a menudo denominado FRET ratiométrico. Se han publicado muchos protocolos sobre cómo aproximar la emisión sensibilizada, pocos han cuantificado la eficiencia FRET absoluta 6,7,8,9. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar (i) la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes y, también (ii) la eficiencia de detección de la configuración microscópica. Mientras que la diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo uno de los fluoróforos, la evaluación de la eficiencia de detección relativa de la fluorescencia donante y aceptora es más complicada. Requiere el conocimiento de al menos la relación entre el número de moléculas donadoras y aceptoras que dan lugar a las señales medidas. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía, sin embargo, de célula a célula y es desconocido. El llamado factor α caracteriza las intensidades relativas de la señal de una sola molécula donante y aceptora excitada. El conocimiento del factor es un requisito previo para las mediciones cuantitativas ratiométricas de FRET en muestras con proporciones variables de moléculas aceptoras a donantes, como las que se encuentran durante las imágenes de células vivas con proteínas fluorescentes. El uso de una proteína de fusión donante-aceptor 1 a 1 como sonda de calibración permite la determinación del factor α y también sirve como control positivo. Esta sonda genéticamente acoplada es expresada por células en cantidades totales desconocidas, pero en una cantidad relativa fija y conocida de uno a uno. El siguiente protocolo establece cómo construir la sonda 1 a 1 y cómo usarla para cuantificar la eficiencia de FRET. Una hoja de cálculo que incluye todas las fórmulas se puede encontrar en el suplemento y puede ser utilizada por los lectores para ingresar sus propias medidas en las columnas respectivas como se describe a continuación.
Si bien el protocolo utiliza el par donante/aceptor GFP-Cherry, el enfoque presentado se puede realizar con cualquier otro par FRET. El Archivo Suplementario 1 proporciona detalles sobre los pares cian-amarillo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es la transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia y orientación de las moléculas, así como del grado de superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. FRET permite estudiar la interacción de proteínas en la célula viva a lo largo del tiempo y en diferentes compartimentos subcelulares. En la literatura se han descrito diferentes algoritmos basados en la intensidad para medir FRET utilizando microscopía. Aquí, se proporciona un protocolo y un algoritmo para cuantificar la eficiencia FRET basada en la medición tanto de la emisión sensibilizada del aceptor como del enfriamiento de la molécula donante. La cuantificación de FRET ratiométrico en la célula viva no solo requiere la determinación de la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes, sino también la eficiencia de detección de la configuración microscópica. El protocolo proporcionado aquí detalla cómo evaluar estos parámetros críticos.

La Figura 1 muestra las imágenes obtenidas en el canal donante, canal 1 (488, 505-530 nm), el canal de transferencia, canal 2 (488, >585 nm), y el canal aceptor, canal 3 (561, >585 nm), respectivamente. Imágenes representativas de células que expresan GFP solamente, solo cereza, co-expresando GFP y cereza, y expresando la proteína de fusión GFP-Cherry. Las eficiencias celulares medias de FRET calculadas en células NRK que expresan proteína de fusión G...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre dos moléculas fluoróforas se puede utilizar para estudiar las interacciones de proteínas en la célula viva. Aquí, se proporciona un protocolo sobre cómo medir FRET en células vivas mediante la detección de la emisión sensibilizada del aceptor y el enfriamiento de la molécula donante utilizando microscopía de barrido láser confocal.

Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Este protocolo describe un proceso experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por el aceptor. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar la diafonía de las proteínas fluorescentes y las eficiencias relativas de emisión y detección de los fluoróforos en la configuración microscópica. La diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo un fluoróforo.La evaluación de la eficiencia de detección de una molécula donante o aceptora requiere un conocimiento de la relación entre el número de moléculas donantes y aceptoras que dan lugar a la señal de medida. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía de célula a célula y es desconocido. La sonda de calibración utilizada en este método, una proteína de fusión donante-aceptor uno a uno, permite determinar la eficiencia de detección relativa de las moléculas donante y aceptora.Para comenzar, utilice un vector de expresión celular de mamíferos N1 con mCherry 1 para generar la sonda de fusión EGFP mCherry 1. Diseñar oligonucleótidos para amplificar EGFP sin un codón de parada como una célula de un fragmento BAM h1. El enlace de cinco aminoácidos entre la proteína fluorescente verde y roja debe producir una deficiencia media de FRET para el par donante-aceptor de cerezas GFP de 0.25 a 0.3.Use cualquier línea celular y medio sin rojo fenol para reducir la fluorescencia de fondo. Una vez que las células estén 80% confluentes, separarlas con un mililitro de 0.05% tripsina EDTA y sembrar aproximadamente 10, 000 células en cada pocillo de una placa de ocho pocillos agregando tres gotas de una suspensión de células de cinco mililitros. 24 horas después del recubrimiento, transfectar las células utilizando un medio de transfección apropiado.Incubar las células durante 20 horas antes de obtener imágenes de células vivas para permitir la expresión, el plegamiento y la maduración adecuados de las proteínas fluorescentes. Imagen de las células en una cámara ambiental humidificada y calentada a 37 grados centígrados con un microscopio de barrido confocal. Para amortiguar los medios celulares a pH fisiológico, agregue 20 HEPES milimolares para que el medio celular sea independiente del dióxido de carbono.Luego monte el portaobjetos en el microscopio. Utilice la línea de 488 nanómetros del láser de iones de argón para excitar el GFP y el láser de diodo de 561 nanómetros para excitar la cereza. Configure el láser de 488 nanómetros para la excitación en el canal uno a través de una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros y en el canal dos con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros.Utilice el láser de 561 nanómetros para la excitación en el canal tres con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros. Excite los dos láseres secuencialmente y configure el modo de imagen para cambiar después de cada línea para que la excitación de la imagen de 512 por 512 píxeles se alterne después de cada línea. Configure una mini serie temporal de tres imágenes para detectar si se produce un fotoblanqueo significativo y reducir la potencia del láser si es necesario.Primero, las células de imagen que expresan la construcción de fusión de cerezas GFP. Establezca los parámetros que definen la intensidad láser integrada en el tiempo por píxel en una imagen confocal. Utilice un objetivo de aceite de 63X y un zoom ajustado a 3X para obtener imágenes de una celda en su totalidad con suficiente aumento y resolución.Apunte a un tamaño de píxel de 70 a 80 nanómetros. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de dos a cuatro microsegundos y la transmisión AOTF para el láser de 488 nanómetros y 561 nanómetros, de modo que las imágenes muestren una buena relación señal-ruido sin blanqueamiento y sin píxeles que indiquen saturación de intensidad de fluorescencia. Ajuste la potencia del láser de 488 y 561 de modo que los niveles de señal en el canal uno y el canal tres sean similares.Establezca la ganancia del multiplicador de fotos en 600 a 800. Imagen de 15 a 20 células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, células que expresan GFP, cereza, GFP y cereza, y células no transeccionadas. A continuación, las células de imagen co-expresan las proteínas de interés acopladas a GFP y cereza respectivamente.Para calcular FRET, mida la señal donante en el canal uno, el canal donante con excitación de 488 nanómetros y una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros. Luego mida la señal aceptora en el canal tres, el canal aceptor con excitación de 561 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros. Finalmente, mida la señal FRET en el canal dos, el canal de transferencia con excitación de 488 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros.La señal en el canal dos es una suma de cuatro componentes diferentes: el derrame espectral de la señal donante apagada en el canal de detección de más de 585 con un factor de diafonía S1, la señal aceptora de la excitación directa por luz de 488 nanómetros con un factor de diafonía S2, la emisión sensibilizada del aceptor por FRET de la molécula donante excitada, y la señal de fondo. Las imágenes se obtuvieron en el canal donante, el canal de transferencia y el canal aceptor, se muestran células que expresan GFP solamente, solo cereza, coexpresión de GFP y cereza, y la proteína de fusión de cereza GFP. Las eficiencias celulares medias de FRET calculadas en células NRK que expresan proteína de fusión de cereza GFP y aquellas que coexpresan cereza GFP se representan gráficamente versus la relación de intensidad de la relación aceptor-donante o la relación molecular en cada célula.Aquí se muestran imágenes FRET normalizadas píxel por píxel de células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, coexpresando GFP y cereza como control negativo y expresando subunidades receptoras del receptor de Ashwell-Morell. RHL1 y 2 de la lectina hepática de rata se marcaron con GFP y cereza en el lado citoplasmático de la membrana plasmática. Las eficiencias medias celulares FRET de las células que expresan GFP RHL1 y cereza RHL2 y GFP RHL1 delta stock y cereza RHL2 se representan gráficamente frente a la relación molecular aceptor-donante.El enfoque FRET cuantitativo presentado permite lo siguiente. Detección de interacciones proteicas en el contexto fisiológico de la célula viva. Cambios en las interacciones de proteínas a lo largo del tiempo.Diferencias en las interacciones en compartimentos subcelulares hasta el nivel píxel por píxel de una imagen confocal. Y la dependencia de la señal FRET detectada de la relación aceptor-donante molecular expresada en una célula viva.

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Biology

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...