Name: assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Vi vill tacka Neuroscience Imaging Service vid Stanford University School of Medicine för att tillhandahålla utrustning och utrymme för detta projekt. Denna forskning stöddes av intramural finansiering av Stanford Cancer Institute och Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 från National Research, Development and Innovation Office, Ungern.

1. Plasmidkonstruktion
<ol><li>För att generera fusionssonden eGFP-mCherry1, använd en N1-celluttrycksvektor för däggdjur (se materialförteckning) med mCherry110 infogad med restriktionsställena AgeI och BsrGI.</li>
	<li>Använd följande oligonukleotider för att förstärka eGFP11 utan stoppkodon som SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' och C-terminal primer 5'-AAT A...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Det presenterade protokollet beskriver användningen av den genetiskt kopplade en-till-en fluorescerande proteinkalibreringssonden för kvantifiering av FRET med hjälp av detektion av sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av givarmolekylen genom konfokalmikroskopi. Denna metod kan tillämpas för att bedöma proteininteraktioner i den levande cellens fysiologiska sammanhang i olika subcellulära fack. Den rumsliga upplösningen kan förbättras ytterligare genom att använda den presenterade algoritmen fö...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Mikroskopibaserad analys av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) möjliggör bedömning av interaktioner mellan proteiner i levande celler. Det ger rumslig och tidsmässig information, inklusive information om var i cellen och i vilket subcellulärt fack interaktionen äger rum och om denna interaktion förändras över tiden.
Theodor Förster lade den teoretiska grunden för FRET 19481. FRET är en strålningsfri överföring av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och den relativa orienteringen av deras övergångsdipoler samt överlappningen mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. Energiöverföringshastigheten är omvänt proportionell mot den sjätte effekten av givar-acceptoravståndet. Således kan FRET användas för att mäta molekylär närhet i intervallet 1-10 nm.
FRET konkurrerar med andra de-excitationsprocesser av givarmolekylen och resulterar i den så kallade donatorsläckningen och sensibiliserade emissionen av acceptorn. Donatorsläckning är en minskning av antalet emitterade donatorfotoner, medan sensibiliserad emission är en ökning av emitterade acceptorfotoner. Många mikroskopiska FRET-analyser använder fluorescensintensitetsmätningar, inklusive acceptorfotoblekning 2, givarfotoblekning2 eller FRET-sensibiliserad fotoblekning av acceptorn3.
Här presenteras ett steg-för-steg-experimentellt protokoll och matematisk algoritm för att kvantifiera FRET med hjälp av donatorkylning och acceptorsensibiliserad emission4,5, en metod som ofta kallas ratiometrisk FRET. Många protokoll om hur man approximerar sensibiliserade utsläpp har publicerats, få har kvantifierat den absoluta FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifieringen av FRET-effektiviteten i den levande cellen kräver bestämning av (i) överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna och även (ii) detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska installationen. Medan överhörning kan bedömas genom att avbilda celler som endast uttrycker en av fluoroforerna, är bedömningen av den relativa detektionseffektiviteten hos givaren och acceptorfluorescensen mer komplicerad. Det kräver kunskap om åtminstone förhållandet mellan antalet donator- och acceptormolekyler som ger upphov till de uppmätta signalerna. Antalet fluoroforer som uttrycks i levande celler varierar dock från cell till cell och är okänt. Den så kallade α faktorn karakteriserar de relativa signalstyrkorna från en enda exciterad donator- och acceptormolekyl. Kunskap om faktorn är en förutsättning för kvantitativa ratiometriska FRET-mätningar i prover med variabla acceptor-till-donatormolekylförhållanden som påträffas vid avbildning av levande celler med fluorescerande proteiner. Användning av ett 1-till-1 donatoracceptorfusionsprotein som kalibreringssond möjliggör bestämning av den α faktorn och fungerar också som en positiv kontroll. Denna genetiskt kopplade sond uttrycks av celler i okända totala mängder men i en fast och känd relativ mängd en-till-en. Följande protokoll beskriver hur man konstruerar 1-till-1-sonden och hur man använder den för kvantifiering av FRET-effektivitet. Ett kalkylblad som innehåller alla formler finns i tillägget och kan användas av läsarna för att ange sina egna mått i respektive kolumn enligt beskrivningen nedan.
Medan protokollet använder GFP-Cherry-donator-/acceptorparet, kan det presenterade tillvägagångssättet utföras med vilket annat FRET-par som helst. Tilläggsfil 1 innehåller information om cyangula par.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) är den strålningsfria överföringen av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och orientering samt graden av överlappning mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. FRET tillåter att studera interaktionen mellan proteiner i den levande cellen över tid och i olika subcellulära fack. Olika intensitetsbaserade algoritmer för att mäta FRET med mikroskopi har beskrivits i litteraturen. Här tillhandahålls ett protokoll och en algoritm för att kvantifiera FRET-effektivitet baserat på mätning av både acceptorns sensibiliserade emission och kylning av donatormolekylen. Kvantifieringen av ratiometrisk FRET i den levande cellen kräver inte bara bestämning av överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna utan också detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska inställningen. Protokollet som tillhandahålls här beskriver hur man bedömer dessa kritiska parametrar.

Figur 1 visar bilderna som erhållits i givarkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), överföringskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) respektive acceptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Representativa bilder av celler som uttrycker endast GFP, endast körsbär, samuttryckande GFP och körsbär och uttrycker fusionsproteinet GFP-körsbär. Den genomsnittliga cellulära FRET-effektiviteten beräknad i NRK-celler som uttrycker GFP-Cherry-fusionsprotein (positiv kontroll...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan två fluoroformolekyler kan användas för att studera proteininteraktioner i den levande cellen. Här tillhandahålls ett protokoll för hur man mäter FRET i levande celler genom att detektera sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av donatormolekylen med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi.

Bedömning av proteininteraktioner i levande celler med FRET-sensibiliserad emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Detta protokoll beskriver en steg-för-steg-experimentell process och matematisk algoritm för att kvantifiera FRET med hjälp av donatorkylning och acceptorsensibiliserad emission. Kvantifieringen av FRET-effektiviteten i den levande cellen kräver bestämning av överhörningen mellan de fluorescerande proteinerna och fluoroforernas relativa emissions- och detektionseffektivitet i mikroskopisk uppställning. Överhörning kan bedömas genom att avbilda celler som uttrycker endast en fluorofor.Bedömning av detektionseffektiviteten hos en donator- eller acceptormolekyl kräver kunskap om förhållandet mellan antalet donator- och acceptormolekyler som ger upphov till mätsignalen. Antalet fluoroforer som uttrycks i levande celler varierar från cell till cell och är okänt. Kalibreringssonden som används i denna metod, ett en-till-en-donator-acceptorfusionsprotein, gör det möjligt att bestämma den relativa detektionseffektiviteten hos givar- och acceptormolekyler.För att börja, använd en N1 däggdjurscelluttrycksvektor med mCherry 1 för att generera EGFP mCherry 1 fusionssond. Designa oligonukleotider för att förstärka EGFP utan stoppkodon som en cell ett BAM h1-fragment. Femaminosyralänken mellan det gröna och röda fluorescerande proteinet bör ge en genomsnittlig FRET-brist för GFP-körsbärsdonatoracceptorparet på 0,25 till 0,3.Använd valfri cellinje och media utan fenolrött för att minska bakgrundsfluorescensen. När cellerna är 80% sammanflytande, lossa dem med en milliliter 0, 05% trypsin EDTA och frö ca 10 000 celler i varje brunn i en åtta brunnsplatta genom att tillsätta tre droppar från en fem milliliter cellsuspension. 24 timmar efter plätering, transfektera cellerna med hjälp av ett lämpligt transfektionsmedium.Inkubera cellerna i 20 timmar före avbildning av levande celler för att möjliggöra korrekt fluorescerande proteinuttryck, veckning och mognad. Avbilda cellerna i en fuktad och uppvärmd miljökammare vid 37 grader Celsius med ett konfokalt skanningsmikroskop. För att buffra cellmediet vid fysiologiskt pH, tillsätt 20 millimolar HEPES för att göra cellmediet koldioxidoberoende.Montera sedan bilden på mikroskopet. Använd argonjonlaserns 488 nanometerlinje för att excitera GFP och 561 nanometerdiodlasern för att excitera körsbär. Ställ in 488 nanometerlasern för excitation i kanal ett genom ett emissionsband på 505 till 530 nanometer och i kanal två med ett långpassfilter på över 585 nanometer.Använd 561 nanometerlaser för excitation i kanal tre med ett långpassfilter på över 585 nanometer. Excitera de två lasrarna sekventiellt och ställ in bildläget så att växlingsläget växlar efter varje rad så att excitationen av bilden på 512 x 512 pixlar alternerar efter varje rad. Ställ in en mini-tidsserie med tre bilder för att upptäcka om betydande fotoblekning inträffar och minska lasereffekten vid behov.Först bildceller som uttrycker GFP-körsbärsfusionskonstruktionen. Ställ in parametrarna som definierar tidsintegrerad laserintensitet per pixel i en konfokal bild. Använd ett 63X oljemål och zoom inställd på 3X för att avbilda en cell i sin helhet med tillräcklig förstoring och upplösning.Sikta på en pixelstorlek på 70 till 80 nanometer. Ställ in pixeluppehållstiden till två till fyra mikrosekunder och AOTF-överföring för 488 nanometer och 561 nanometer laser så att bilder visar ett bra signal-brusförhållande utan blekning och inga pixlar som indikerar fluorescensintensitetsmättnad. Justera lasereffekten på 488 och 561 så att signalnivåerna i kanal ett och kanal tre är likartade.Ställ in fotomultiplikatorförstärkningen till 600 till 800. Bild 15 till 20 celler som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet, celler som uttrycker GFP, körsbär, GFP och körsbär och icke-transekterade celler. Därefter avbildar celler som samuttrycker proteinerna av intresse kopplade till GFP respektive körsbär.För att beräkna FRET, mäta givarsignalen i kanal ett, givarkanalen med 488 nanometer excitation och ett utsläppsband på 505 till 530 nanometer. Mät sedan acceptorsignalen i kanal tre, acceptorkanalen med 561 nanometer excitation och emission vid över 585 nanometer. Slutligen mäta FRET-signalen i kanal två, överföringskanalen med 488 nanometer excitation och emission vid över 585 nanometer.Signalen i kanal två är summan av fyra olika komponenter:spektralspill från den släckta givarsignalen till detekteringskanalen över 585 med en överhörningsfaktor S1, acceptorsignalen från direkt excitation med 488 nanometerljus med en överhörningsfaktor S2, acceptorns sensibiliserade emission av FRET från den exciterade givarmolekylen, och bakgrundssignalen. Bilder erhölls i givarkanalen, överföringskanalen och acceptorkanalen, celler som endast uttrycker GFP, endast körsbär, samuttryckande GFP och körsbär och GFP-körsbärsfusionsproteinet visas. Den genomsnittliga cellulära FRET-effektiviteten beräknad i NRK-celler som uttrycker GFP-körsbärsfusionsprotein och de som uttrycker GFP-körsbär plottas jämfört med intensitetsförhållandet mellan acceptor och givare eller molekylförhållandet i varje cell.Normaliserade FRET-bilder pixel för pixel av celler som uttrycker GFP-körsbärsfusionsproteinet, som uttrycker GFP och körsbär som en negativ kontroll och uttrycker receptorsubenheter av Ashwell-Morell-receptorn visas här. RHL1 och 2 av råtthepatiskt lektin märktes med GFP och körsbär på den cytoplasmatiska sidan av plasmamembranet. Den genomsnittliga cellulära FRET-effektiviteten hos celler som uttrycker GFP RHL1 och körsbär RHL2 och GFP RHL1 delta-stam och körsbär RHL2 plottas jämfört med acceptor-till-donatormolekylförhållandet.Den presenterade kvantitativa FRET-metoden möjliggör följande: Detektion av proteininteraktioner i den levande cellens fysiologiska sammanhang. Förändringar i proteininteraktioner över tid.Skillnader i interaktioner i subcellulära fack ner till pixel för pixelnivå för en konfokal bild. Och beroendet av den detekterade FRET-signalen på molekyläracceptor-till-givarförhållandet uttryckt i en levande cell.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein interaktioner In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - transkriptom hela Kartläggning av protein-RNA interaktioner med individuella Nukleotid Upplösning

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...