Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل في وضع هذا البروتوكول المعاهد الوطنية للصحة (R01-EB019453-02)، ومكتب مدير الاستخبارات الوطنية، نشاط مشاريع البحوث المتقدمة الاستخبارات من خلال شركة رايثيون BBN تكنولوجيز كورب (N66001-18-C-4507)، وبرنامج تشان زوكربيرج Biohub المحقق، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع من خلال جامعة تكساس A & M (W911NF1920013)، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها من خلال جامعة جونز هوبكنز تطبيقها مختبر الفيزياء (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). إن الآراء والاستنتاجات الواردة هنا هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل بالضرورة السياسات الرسمية، سواء كانت صريحة أو ضمنية، للمنظمات المذكورة أعلاه أو حكومة الولايات المتحدة. حكومة الولايات المتحدة مخولة بإعادة إنتاج وتوزيع طبعات لأغراض حكومية على الرغم من أي تعليق حقوق الطبع والنشر فيه.

1. إعداد جزيئات الهيدروجيل للاستحلاب الجسيمات قالب.
يمكن إعداد جزيئات الهيدروجيل المستخدمة في استحلاب الجسيمات المنماذج باستخدام طريقتين مختلفتين.
<ol><li>التحضير باستخدام الجسيمات المتاحة تجاريا
	<ol>
<li>إضافة 0.5 غرام من جزيئات البولي أكريلاميد المجففة متوافقة مع PTE (على سبيل المثال، بيو-جل P-60 جل (بيو راد)، قطر 45-90 ميكرومتر) إلى 30 مل من المياه العقيمة في أنبوب مخروطي 50 مل وتخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد باستخدام تصنيع microfluidic من الجسيمات ملاحظة: يمكن إعداد جزيئات البولي أكريلاميد المتوافقة مع PTE باستخدام صانعي الإسقاط المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، QX200 قطرة مولد (بيو راد)، RayDrop (Fluigent) الخ)، أو حسب تصميم microfluidic مخصص.<ol><li>تلفيق سيد مخصص
		<ol>
<li>تصميم قناع فوتوغرافيا ناعم باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). طباعة قناع ضوئي مع قرار 10 ميكرومتر على فيلم لوحة الدارة.</li>
			<li>صب 1 مل من الكواتر الضوئي على مركز 3 في رقاقة السيليكون. استخدم طبقة الدوران لإنشاء طبقة 50 ميكرومتر من جهاز التصوير الضوئي عن طريق تدويرها عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية تليها 1250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتتبخر المذيبات.</li>
			<li>تأمين قناع ضوئي على رقاقة السيليكون مع شريحة زجاجية الغطاء وفضح رقاقة تحت 190 mW collimated، 365 ميكرومتر الأشعة فوق البنفسجية LED لمدة 2.5 دقيقة. ضع الرقاقة على مجموعة من الألواح الساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للخبز بعد التعرض.</li>
			<li>تطوير رقاقة سيليكون سيليكون الكواتر الضوئية عن طريق غمرها في حمام من 100٪ بروبيلين غليكول خلات الأثير أحادية ميثيل (PGMEA) لمدة تصل إلى 15 دقيقة. شطف رقاقة مع الطازجة 100٪ PGMEA تليها 100٪ isopropanol. الهواء يجفف الرقاقة.</li>
			<li>إزالة أي isopropanol المتبقية عن طريق تجفيف رقاقة على مجموعة hotplate إلى 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. وضع رقاقة في نظيفة 3 في طبق بيتري.</li>
		</ol></li>
		<li>تصنيع الجهاز microfluidic مخصص
		<ol>
<li>امزج قاعدة السيليكون متعدد الديميثيلسيلوكسيان (PDMS) وشفط المعالجة بنسبة 10:1 حسب الكتلة. ديغا PDMS المختلطة باستخدام مجفف تحت فراغ المنزل حتى لا فقاعات الهواء يمكن ملاحظتها.</li>
			<li>صب PDMS degassed على سيد في طبق بيتري، وضمان رقاقة السيليكون مغمورة تماما. ديغا رقاقة السيليكون وPDMS لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد تكونت أثناء صب.</li>
			<li>علاج PDMS عن طريق وضع رقاقة السيليكون وPDMS في فرن تعيين إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. استئصال كتلة من PDMS التي تحتوي على ميزات microfluidic من طبق بيتري باستخدام مشرط. اتخاذ مزيد من الحذر لتجنب إتلاف أي ميزات موجودة على سيد السيليكون.</li>
			<li>لكمة مداخل ومنافذ في كتلة PDMS المقابلة للمداخل ومنافذ في الجهاز microfluidic باستخدام لكمة خزعة 0.75 ملم. إزالة أي الغبار والجسيمات مع التطبيق المتكرر وإزالة الشريط التعبئة والتغليف إلى سطح كتلة PDMS.</li>
			<li>تنظيف شريحة زجاجية 50 ملم × 75 ملم عن طريق الشطف مع 100٪ isopropanol وتجفيف الهواء في وقت لاحق السطح. البلازما علاج كل من الشريحة الزجاجية وPDMS (ملامح تواجه) باستخدام 1 ملليبار من البلازما O2 لمدة 1 دقيقة باستخدام المستعبدين البلازما.</li>
			<li>لصق PDMS إلى الشريحة الزجاجية عن طريق وضع PDMS البلازما المعالجة مع الميزات التي تواجه أسفل على الشريحة الزجاجية، البلازما الجانب المعالجة التي تواجه ما يصل. ضع الشريحة في فرن تم ضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لإكمال الترابط.</li>
			<li>علاج جميع القنوات microfluidic مع معالجة السطح المفلور لضمان رهاب الماء السطحي ومنع التبول. خبز الجهاز في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.</li>
		</ol></li>
		<li>تصنيع جزيئات التمبلر
		<ol>
<li>إعداد محلول البولي أكريلاميد (PAA) يتكون من 6.2٪ أكريلاميد، 0.18٪ N،N′-ميثيلينبيس (أكريلاميد)، و 0.3٪ بيرسولفيت الأمونيوم. قم بتحميل هذا المحلول في حقنة 1 مل باستخدام إبرة 28G.</li>
			<li>إعداد مرحلة مستمرة غير قابلة للذوبان تتكون من 5٪ (ث / ث) الفلوروسورفاكانت و 1٪ N، N، NN-tetramethylethylenediamine (TEMED) في زيت الهيدروفلوروثير (HFE) لتوليد وتثبيت قطرات. تحميل الحل في حقنة 1 مل جديدة.</li>
			<li>تحميل كل من PAA وHFE الحل الذي يحتوي على المحاقن في مضخات حقن (على سبيل المثال، NE-501). قم بتوصيل المحاقن بجهاز microfluidic باستخدام أنابيب البولي إيثيلين التي تم إدخالها على الحقنة وفي الجهاز. قبل الاتصال، رئيس مضخات لإزالة الهواء من الأنابيب. ملاحظة: اعتمادا على النموذج، يمكن التحكم في مضخات الحقنة باستخدام الإدخال أو تصنيع البرامج أو برنامج نصي مخصص (متوفر في https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>تشغيل جهاز توليد الإسقاط مع مدخلات النفط PAA وHFE في 300 ميكرولتر / ساعة و 500 ميكرولتر / ساعة، على التوالي. جمع 1 مل من قطرات في أنبوب جمع 15 مل واحتضان لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة للبوليمرة. بعد الحضانة، قم بإزالة الطبقة السفلى من الزيت عن طريق الأنابيب.</li>
			<li>إضافة 1 مل من 20٪ (v/v) البيرفلورو-1-أوكتانول (PFO) في زيت HFE إلى أنبوب جمع 15 مل كمزيل للتمائم الكيميائي. بعد خلط، تدور أسفل أنبوب جمع 15 مل في 2000 × ز لمدة 2 دقيقة. إزالة PFO / HFE فائقة عن طريق الأنابيب. كرر 1x.</li>
			<li>إضافة 2 مل من 2٪ أحادية سوربيتان في الهيكسان إلى أنبوب جمع 15 مل ودوامة لخلط. تدور في أنبوب 3000 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة supernatant عن طريق pipetting لإزالة محلول السطحي / الهيكسان. كرر 2x.</li>
			<li>إضافة 5 مل من TEBST العازلة (20 mM تريس-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0.2٪ تريتون X-100) وتخلط جيدا. تدور أسفل في 3000 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة supernatant عن طريق الأنابيب. كرر 3x.</li>
			<li>ريسوسبند في 5 مل TEBST. قد يتم تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. استحلاب الجسيمات قالب.
بعد إعداد جزيئات التمبلات ، يتم استخدام PTE لتغليف العينة والكواشف في قطرات.
<ol><li>إعداد جزيئات البولي أكريلاميد لاستحلاب الجسيمات قالب عن طريق الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة بيليه الجسيمات، ثم إزالة supernatant عن طريق الأنابيب وإعادة الإنفاق باستخدام المياه العقيمة. كرر 3x لضمان إزالة أي TEBST المتبقية.</li>
	<li>تحديد تركيز وقطر جزيئات التمبلر باستخدام مقياس الدم (أو ما يعادله). حساب قطر الجسيمات الفردية عن طريق قياس أقطار بالبكسل وتحويلها إلى ميكرون. يمكن حساب تحويل وحدات البكسل إلى ميكرون باستخدام مقياس الدم (أو ما يعادله) كشريحة معايرة وقياس مسافة الشبكة المعروفة بالبكسل.</li>
	<li>إعداد مرحلة تفريق في أنبوب طرد دقيق جديد 1.5 مل باستخدام مزيج رئيسي PCR، والتمهيديات المناسبة، ومسبار التحلل المائي الفلورسين وفقا للجدول 1. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تحت التحريض لطيف (10 دورة في الدقيقة) باستخدام أنبوب الدوار لضمان توزيع متجانسة للمكونات. ملاحظة: يعتمد حجم الجسيمات وتركيزها المستهدف على تحميل Poisson. وكقاعدة عامة، ينبغي أن يكون عدد الجسيمات أكثر من عدد العينات التي يتعين تغليفها. لعينات من تركيزات غير معروفة، سلسلة تخفيف ضروري لضمان تحميل بواسون.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حجم</td>
			<td>الكاشف</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ميكرولتر</td>
			<td>الجسيمات (450 جسيم / ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 ميكرولتر</td>
			<td>2x PCR مزيج رئيسي</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 ميكرولتر</td>
			<td>التمهيدي الأمامي 10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 ميكرولتر</td>
			<td>التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 ميكرولتر</td>
			<td>مسبار 10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 ميكرولتر</td>
			<td>تريتون X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45.2 ميكرولتر</td>
			<td>مياه خالية من النيوكليز</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول إعداد مزيج PCR الرئيسي المستخدم مع PTE ل PCR القطيرات الرقمية.
<ol start="4"><li>الطرد المركزي مرحلة تفريق في 6000 س ز لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant. تسجيل حجم supernatant المستخرجة واستخدام مجموع حجم مرحلة تفريق محسوبة في 2.3 تحديد حجم بيليه. ملاحظة: تختلف كمية الناسخة الفائقة المستخرجة حسب تعبئة الجسيمات وقطرها وتركيزها بحد أدنى متوقع يبلغ 300 ميكرولتر.</li>
	<li>إضافة 1 ميكرولتر من 1.62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae الحمض النووي الجينومي إلى بيليه من 2.4 وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب أو التنصت قوية. ملاحظة: وجود المحتوى المائي الزائد يمكن أن يقلل من كفاءة التغليف. إذا تجاوز حجم العينة 1٪ من حجم الكريات، ركز العينة. إذا كان لا يمكن تركيز العينة، قم بتحجيم المزيج الرئيسي ل PCR وحجم الكريات الناتج وفقا لحجم العينة. تسمح PTE بتسحلب كميات صغيرة (10 ميكرولتر) إلى كميات كبيرة (2 مل) من جزيئات التمبلر. ويمكن قياس المزيج الرئيسي ل PCR (2.3) والزيت (2.6) وفقا للهدف (2.3) وقياس حجم (2.4) من بيليه الجسيمات على التوالي.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر 2٪ فلوروسورفاتانت في زيت HFE إلى الأنبوب كمرحلة مستمرة غير قابلة للذوبان لاستحلاب. تأكد من طرد بيليه عن طريق الأنابيب أو التنصت / النقر على الأنبوب. ثم دوامة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ملاحظة: قد يختلف الإعداد المطابق ل 3000 دورة في الدقيقة حسب العلامة التجارية والطراز.</li>
	<li>السماح للمستحلبات لتسوية لمدة 1 دقيقة. إزالة 100 ميكرولتر من مرحلة النفط السفلي واستبدال هذا الحجم مع 2٪ من الفلوروسورفاكانت الطازجة في زيت HFE. عكس بلطف أنبوب عدة مرات لخلط. كرر 3-5x أو حتى تتم إزالة قطرات الأقمار الصناعية الصغيرة.</li>
</ol>3. الرقمية PCR قطرة وتحليل.
<ol><li>بعد 2-5 دقائق من الاستقرار، وإزالة مرحلة النفط السفلي. استبدل هذا الحجم ب 5٪ فلوروسورفاتانت في زيت الفلوروكربون (على سبيل المثال، FC-40).</li>
	<li>باستخدام طرف ماصة واسعة تتحمل، ماصة بعناية 100 ميكرولتر من العينة في أنابيب PCR 200 ميكرولتر. ضع أنابيب PCR في دراجة حرارية واركض وفقا للجدول 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>درج</td>
			<td>درجة الحرارة</td>
			<td>مدة</td>
			<td>تلاحظ</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 درجة مئوية</td>
			<td>دقيقتان</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 درجة مئوية</td>
			<td>30 ق</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 درجة مئوية</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>60 ق</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>كرر x34 الخطوات 2 إلى 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>دقيقتان</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 درجة مئوية</td>
			<td>مسك</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2 - الأرباح ظروف الترموسيكلينج ل PCR قطرة الرقمية باستخدام مستحلبات PTE.
<ol start="3"><li>ماصة العينة على شريحة العد باستخدام تلميح ماصة تتحمل واسعة للتصوير الفلورسنت. صورة العينة باستخدام المجهر الفلوري مع 490 نانومتر الإثارة وأطوال موجية الكشف عن الانبعاثات 525 نانومتر.</li>
	<li>قياس قطرات الفلورسنت الإيجابية (NP) والقطرات الإجمالية (NT) للتحقق من وجود وحساب عدد جزيئات القالب (λ) باستخدام جزء من قطرات إيجابية (NP / NT) وإحصاءات بواسون: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>حساب الفاصل الزمني الثقة 95٪ (zc = 1.96) بواسطة: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>احسب تركيز العينة (الجزيئات/الميكروغرال) باستخدام حجم العينة المضافة في الخطوة 2.5 (μL)، باستخدام المعادلة الواردة أدناه. تحديد متوسط الانحراف المعياري لتركيز العينة باستخدام النسخ المتماثلة التقنية. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يستخدم PTE الجسيمات لتغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق الدوامة. بالإضافة إلى بساطتها وسهولة الوصول إليها ، توفر PTE العديد من الفوائد الإضافية ، بما في ذلك السماح بتوليد كميات كبيرة من القطرات على الفور. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء العملية في أنبوب معزول، مما يلغي الحاجة إلى نقل العينات إلى أجهزة ميكروفلويديك، وتبسيط سير العمل العام والحد من فرص تلوث العينات أو فقدانها. كما توفر جزيئات التمبلات وسيلة لهندسة محتويات تفاعلات القطرات الناتجة. على سبيل المثال، يمكن هندسة حجم الجسيمات والكيمياء والقدرة على الاشتعال للجزيئ الحيوي المستهدف أو التقاط الخلايا، في حين يمكن عرض ال moieties الوظيفية مثل الإنزيمات أو النشاطات أو الأحماض النووية على الجسيمات لتسهيل ردود الفعل، مثل تسلسل الخلية الواحدة أو التوصيف الوظيفي. ومع أن النهج مرن، فإن هناك مع ذلك قيودا هامة على استخدامه. فعلى سبيل المثال، لا يمكن حاليا إجراء إضافات قطرات كما تجرى في كثير من الأحيان باستخدام المركبات الدقيقة، مما يتطلب إدخال جميع مكونات التفاعل قبل التغليف؛ وهذا يتطلب أن تكون الكواشف متوافقة ومستقرة حتى يمكن توليد قطرات، وفي حالة تركيبات مزعجة، يمكن في كثير من الأحيان معالجتها عن طريق خلط بسرعة ومستحلب العينة على الجليد. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المكونات التفاعلية التي يمكن تشغيلها خارجيا مع الضوء أو الحرارة13. وبالتالي توفر PTE طريقة مرنة وقابلة للتوسع لإجراء عمليات فحص القطيرات التي يمكن لغير الخبراء الوصول إليها. هذا، إلى جانب بساطته الفطرية والمرونة، يجعل PTE مثالية لتنفيذ وتطوير العديد من التطبيقات القطيرات.

تستفيد Droplet microfluidics من التقسيم في قطرات البيكوليتر لزيادة حساسية ودقة المقايسات مقارنة بالتفاعلات السائبة ، ولها العديد من التطبيقات في الفحص الكيميائي وهندسة البروتين وتسلسل الجيل التالي1،2،3. على سبيل المثال، يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (ddPCR) دقة متزايدة مقارنة بسلسلة تفاعل البوليميراز الكمية السائبة (qPCR)، مع تطبيقات للاختلاف الوراثي في السرطانات، والكشف عن الأمراض المسببة للطفرات، وتشخيص ما قبل الولادة4،5،6. ومع ذلك، فإن التحدي المتمثل في المركبات الدقيقة القطرات هو اشتراط وجود أجهزة ميكروفلويديك لتقسيم العينات؛ في حين أن microfluidics تحمل سيطرة ممتازة على خصائص القطيرات ، فإنها تتطلب خبرة متخصصة لبناء وتشغيل7،8. وبالتالي، تقتصر الأساليب القائمة على القطيرات إلى حد كبير على مختبرات الخبراء أو، في حالات نادرة، التطبيقات التي تتوفر فيها أداة تجارية 9,10. لتوسيع استخدام المقايسات قطرة، شرط لأجهزة microfluidic المتخصصة هي عقبة يجب التغلب عليها.
في هذه المقالة، نقوم بوصف مستحلب الجسيمات (PTE)، وهي طريقة خالية من السوائل الدقيقة لأداء ردود الفعل في قطرات أحادية التشتت. في PTE، تبتلع جزيئات التمبلر العينة إلى قطرات في زيت الناقل عن طريق الدوامة البسيطة (الشكل 1). ومع اختلاط النظام، يتفتت الجزء المائي إلى قطرات من الحجم المتناقص حتى تحتوي القطرات على جزيئات مفردة، وعند هذه النقطة لا يمكن زيادة التجزؤ لأنه يتطلب كسر الجسيمات. تحيط العينة الغارقة بالجسيمات كقشرة في القطرات ، وبالتالي تغليف أي خلايا مشتتة أو كاشفات أو مويتات وظيفية (الشكل 1D). وبالتالي ، لا يتطلب PTE أي معدات أو خبرة لأداء ردود فعل قطرات تتجاوز الدوامة الشائعة. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق توليد القطيرات ثوان مقارنة بالدقائق أو الساعات مع microfluidics ، والكمية المنتجة تتناسب مع حجم الحاوية ، وليس وقت تشغيل الجهاز ، مما يجعلها قابلة للتطوير بشكل كبير. هذه الفوائد تجعل PTE مثالية لإجراء المقايسات قطرة في مجموعة متنوعة من الظروف التي microfluidics غير عملي. هنا، ونحن نثبت PTE واستخدامه لإجراء ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نظرة عامة على عملية استحلاب الجسيمات المنماذجة. (أ) تختلط جزيئات التمبلات بالكواشف. (ب) إزالة الكواشف الزائدة بعد الطرد المركزي. (ج) إضافة جزيئات قالب يحدث قبل إضافة النفط. (د) تنتج الدوامة قطرات تحتوي على جزيء قالب واحد. (ه) يسمح التصوير والسيكلات الحرارية اللاحقة بتحليل رقمي للنماذج المستهدفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

ردود الفعل التي أجريت في قطرات أحادية التشتت تحمل دقة وحساسية معززة مقارنة مع تلك التي أجريت بكميات كبيرة. ومع ذلك ، فإن شرط microfluidics لتشكيل قطرات تسيطر عليها يفرض حاجزا على غير الخبراء ، والحد من استخدامها. هنا ، نصف مستحلب الجسيمات المنماذج ، وهو نهج لتوليد قطرات أحادية التشتت دون microfluidics. باستخدام المجالات الهيدروجيل templating، ونحن تغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق دوامة بسيطة. نحن نثبت هذا النهج باستخدامه لأداء PCR الرقمية الخالية من السوائل الدقيقة.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تغليف العينة إلى قطرات باستخدام مستحلب الجسيمات المنماذج. (أ) جزيئات التمبلر المستخدمة في استحلاب الجسيمات. (ب) فصل بيليه الجسيمات المتمبلرة عن الجسيمات الفائقة بعد الطرد المركزي. (ج) قطرات الناتجة عن استحلاب الجسيمات قالب مع (D) قذيفة مائي يمكن التعرف عليها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في PTE ، يتم إملاء أحادية المستحلبات من خلال جزيئات التمبلر ، لأن قطر القطرات أكبر قليلا من الجسيمات. وبالتالي، فإن الجسيمات الموحدة هي مركزية لتغليف PTE الخاضع للرقابة11. توجد مجموعة متنوعة من الطرق لتوليد جزيئات تمبلاتينج موحدة ، بما في ذلك المواد الكيميائية (sol-gel ، البلمرة المستحلب) ، الهيدروديناميكية (مستحلب الأغشية ، التجانس) ، وطرق الترشيح. نهج Microfluidic على وجه الخصوص ، تحمل monodispersity رائعة (الشكل 2A) والسماح هندسة الجسيمات إضافية لتعزيز وظائفها في PTE12. بدلا من ذلك، يمكن شراء جزيئات التمبلر، على الرغم من أن توحيدها، على الرغم من أنها كافية، عادة أقل مما هو عليه مع الجيل الدقيق 11.
ولأداء الجسيمات PTE، يتم خلطها مع العينة التي سيتم تغليفها (الشكل 1A)، ويتم إزالة الجسيمات الفائقة الزائدة عن طريق الطرد المركزي والأنابيب (الشكل 1B)، كما يتضح من صورة لبيليه جسيم في الجزء السفلي من أنبوب PCR (الشكل 2B). ثم يضاف زيت التغليف الذي يحتوي على عامل الخافض للانضغاء السطحي المستقر (الشكل 1C)، ويتم إخراج العينة برفق قبل الدوامة لمدة 30 ثانية (الشكل 1D)، لتوليد المستحلب (الشكل 2C). تحتوي القطرات الناتجة على نواة جسيم وقشرة مائي تتألف من العينة الأولية ، والتي توجد بداخلها الكواشف والجزيئات المستهدفة والخلايا اللازمة للتفاعل (الشكل 2D). تماما كما هو الحال في تغليف القطرات الدقيقة ، يتم تغليف الكيانات المنفصلة مثل الخرز الصغير أو الخلايا بشكل عشوائي ووفقا لتوزيع بواسون ، على الرغم من أن جميع القطرات تقريبا تحتوي على جسيم تمبلر بسبب طبيعة فيزياء PTE.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحديد وتنظيف قطرات مستحلب الجسيمات قالب. (أ) مثال على توليد قطرات غير موحدة مع جزيئات متعددة لكل قطرة من دوامة غير كافية. (ب) الوجود المتوقع للسواتل والقطرات بعد استحلاب الجسيمات المضالبة و (ج) تفتيت الماء في الزيت. (د) مستحلب الناتجة بعد غسل الزيت. (ه) الإفراط في توليد السواتل الناتج عن بقايا الجسيمات الفائقة أثناء استحلاب الجسيمات المصطوب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
حتى في PTE الناجحة ، توجد قطرات أساسية مزدوجة أو ثلاثية ، على الرغم من أنها تساهم بشكل عام بشكل لا يذكر في رد الفعل ، شريطة أن تكون نادرة. يتطلب تحقيق تردد منخفض من قطرات متعددة النواة مع الاحتفاظ بالقذائف الكافية تحسين معلمات العملية ، بما في ذلك التوتر السطحي ، والقوى التصاق بين الجسيمات ، ولزوجة العينة ، وحجم الحاوية ، وقوة الدوامة والوقت. على سبيل المثال، قد يحتوي المستحلب غير المحسن بشكل جيد على قطرات متعددة الأضلاع تحتوي على العديد من الجسيمات المتمبلرة (الشكل 3A)، مما يشير إلى أن الدوامة لم تكن كافية لاستحلاب العينة بالكامل. في مثل هذه الحالات، يمكن إضافة المنظفات للحد من التصاق بين الجسيمات وانخفاض التوتر السطحي، أو يمكن زيادة قوة الدوامة أو الوقت. وثمة مسألة شائعة أخرى هي توليد السواتل المفرطة، وهي قطرات صغيرة فارغة (الشكل 3B). ويمكن تجنب السواتل في مستحلبات PTE تبعا للتوتر بين البيني والخصائص الريولوجية للعينة والنفط الناقل. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تنتج عن عدم إزالة العينة الزائدة بشكل كاف قبل الاستحلاب (الشكل 2B) ، أو الدوامة مع الكثير من الطاقة ، وتجريد الأصداف من القطرات. وفي مستحلب ناجح ل PTE، ينبغي ألا تشكل السواتل أكثر من ~ 10 في المائة من إجمالي حجم العينة المغلفة (الشكل 3C)11. على هذا المستوى ، فإنها عادة ما تسهم بشكل ضئيل في رد الفعل ويمكن تجاهلها. لأغراض جمالية، يمكن مسحها من المستحلب عن طريق غسل مع الزيت الطازج (الشكل 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تقييم الجسيمات قالب مستحلب PCR القطيرات الرقمية. (أ) التصوير الفلوري للقطرات يحدد قطرات الفلورسنت الإيجابية وقطرات غير الفلورية السلبية. (ب) تحديد قالب نادر أو تركيزات منخفضة من القالب مع PCR قطرة الرقمية. (ج) على تغليف قالب وفيرة مما أدى إلى عدد متغير من جزيئات قالب لكل قطرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لإثبات فائدة PTE ، استخدمناها لأداء PCR11 الرقمي الخالي من السوائل الدقيقة. باستخدام هذه العملية، قمنا بتغليف عينة تتألف من الحمض النووي الجينومي S. cerevisiae ، وثيرموسيكليد ذلك. في PCR الرقمية، قطرات تحتوي على أهداف مكبرة تصبح الفلورسنت، في حين أن تلك التي لا تزال قاتمة. وهكذا، تشير قطرة الفلورسنت إلى هدف، مما يسمح بالكمية المباشرة للأهداف عن طريق عد قطرات موجبة (الشكل 4A). وبالتالي فإن عدد قطرات الفلورسنت يتدرج مع الجزيئات المستهدفة ، مما يؤدي إلى عدد قليل من الإيجابيات عندما يكون الهدف نادرا (الشكل 4B) والعديد عندما يكون وفيرا (الشكل 4C). وكما هو الحال مع تغليف المكونات المنفصلة الأخرى، يتبع التغليف المستهدف توزيع بواسون، مما يسمح بتحويل كسر القطرة الإيجابي إلى التركيز المستهدف (الشكل 4D)، مما يدل على القدرة على أداء PCR الرقمي باستخدام PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم عرض توضيحي ل PCR القطيرات الرقمية باستخدام PAA المتاحة تجاريا. (أ) التصوير الفلوري للقطرات يحدد قطرات غير فلورية سلبية. (ب) تحديد تركيزات منخفضة من القالب مع PCR قطرة الرقمية. (ج) تحديد تركيزات عالية من القالب مع PCR قطرة الرقمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وهذه النتائج قابلة للتكرار باستخدام جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا (الشكل 5) وتبين قدرة PTE على أداء PCR الرقمي القياسي مع جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا، وتحقيق قياسات دقيقة على نفس النطاق.
ملف تكميلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

تعتبر مقايسات قطرات الماء في الزيت مفيدة للكيمياء التحليلية وتطور الإنزيم وتحليل الخلايا المفردة ، ولكنها تتطلب عادة مركبات ميكروفلويديك لتشكيل القطرات. هنا، ونحن نصف مستحلب الجسيمات قالب، وهو نهج خالية من microfluidic لأداء المقايسات قطرة.

مستحلب الجسيمات قالب تمكن المقايسات قطرة Microfluidic خالية

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

يتيح PCR القطيرات الرقمية دقة وحساسية معززتين مقارنة ب PCR الكمي. هذه طريقة بسيطة ل PCR القطيرات الرقمية التي تتطلب الحد الأدنى من المعدات وعدم وجود خبرة. مستحلب الجسيمات قالب هو طريقة خالية من microfluidic مستحلب التي لا تتطلب أي معدات متخصصة.بالإضافة إلى ذلك، يحدث مستحلب على مدى فترة من الثواني والمقاييس لحجم الحاوية. بالنسبة للخرزات التجارية، أضف 0.5 جرام من جزيئات البولي أكريلاميد المجففة المتوافقة مع استحلاب قالب الجسيمات، أو PTE، إلى 30 ملليلتر من الماء العقيم في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، واخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.لتصنيع microfluidic من الخرز، صب ملليلتر واحد من فوتوريست على وسط رقاقة السيليكون ثلاثة بوصة، ومن ثم تدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية، تليها 1250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتتبخر المذيبات. قم بتأمين قناع الصورة على رقاقة السيليكون مع شريحة زجاجية تغطية، وفضح الرقاقة تحت LED للأشعة فوق البنفسجية المحصلة لمدة 2.5 دقيقة.ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للخبز بعد التعرض. تطوير رقاقة السيليكون الضوئية عن طريق غمرها في حمام من PGMEA 100٪ لمدة تصل إلى 15 دقيقة. شطف رقاقة مع الطازجة 100٪PGMEA، تليها 100٪ isopropanol.يجفف الرقاقة الهواء، ثم يجففها على طبق ساخن إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ويوضع في طبق بيتري نظيف مقاس ثلاثة بوصات. مزيج قاعدة السيليكون PDMS وشفشف المعالجة في نسبة 10:1، ثم ديغا PDMS مختلطة باستخدام مجفف تحت فراغ حتى لا فقاعات الهواء يمكن ملاحظتها. صب PDMS degassed في طبق بيتري، وضمان أن رقاقة السيليكون مغمورة تماما.ديغا رقاقة السيليكون وPDMS، ومن ثم علاج PDMS عن طريق وضع رقاقة السيليكون في فرن تعيين إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. استئصال كتلة من PDMS التي تحتوي على ميزات microfluidic من طبق بيتري، وذلك باستخدام مشرط. لكمة المداخل ومنافذ في كتلة PDMS باستخدام لكمة خزعة 0.75 ملليمتر.ثم إزالة أي الغبار والجسيمات مع التطبيق المتكرر وإزالة الشريط التعبئة والتغليف إلى سطح الكتلة. تنظيف شريحة زجاجية عن طريق الشطف مع 100٪ isopropanol، وبعد ذلك الهواء تجفيف السطح. البلازما علاج كل من الشريحة الزجاجية وPDMS مع ملليبار واحد من البلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة، وذلك باستخدام المستعبدين البلازما.ألصق PDMS على الشريحة الزجاجية عن طريق وضع PDMS المعالج بالبلازما مع ميزات تواجه أسفل على الشريحة الزجاجية ، والجانب المعالج بالبلازما التي تواجه لأعلى. ضع الشريحة في فرن تم ضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، لإكمال الترابط. علاج جميع القنوات microfluidic مع معالجة السطح المفلور لضمان رهاب الماء السطحي، ثم خبز الجهاز في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.تحميل كل من البولي أكريلاميد، أو PAA، وh hydrofluoroether، أو HFE، المحاقن التي تحتوي على حل في مضخات حقنة. قم بتوصيل كلا المحاقن بجهاز microfluidic باستخدام أنابيب البولي إيثيلين. تشغيل جهاز توليد قطرة وجمع ملليلتر واحد من قطرات في أنبوب جمع 15 ملليلتر، ثم احتضان لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة للبوليمرة.بعد الحضانة، قم بإزالة الطبقة السفلى من الزيت عن طريق الأنابيب. أضف ملليلتر واحد من 20٪ PFO في زيت HFE إلى أنبوب التجميع 15 ملليلتر كمبيد للتمائم الكيميائي. بعد الخلط، قم بتدوير أنبوب التجميع 15 ملليلتر عند 2000 × ز، لمدة دقيقتين.إزالة الطبقة السفلية عن طريق pipetting، وتكرار العملية مرة أخرى. أضف ملليلترين من أحاديات اليوربيتان بنسبة 2٪ في الهيكسان إلى أنبوب التجميع 15 ملليلتر ودوامة ذلك. تدور الأنبوب في 3000 × ز لمدة ثلاث دقائق، وإزالة supernatant عن طريق pipetting لإزالة محلول السطحي.كرر هذا مرتين. إضافة خمسة ملليلتر من TEBST العازلة وتخلط جيدا، ثم تدور أسفل في 3000 × ز لمدة ثلاث دقائق وإزالة supernatant عن طريق pipetting. كرر هذا ثلاث مرات، ثم إعادة الإنفاق في خمسة ملليلتر من TEBST.إعداد جزيئات البولي أكريلاميد لاستحلاب الجسيمات قالب عن طريق الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة دقيقة واحدة بيليه الجسيمات. ثم إزالة supernatant عن طريق الأنابيب، وإعادة إنفاق بيليه في الماء العقيم. كرر ثلاث مرات لضمان إزالة أي TEBST المتبقية.إعداد مرحلة التفرق في أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر، وذلك باستخدام مزيج رئيسي PCR، والمبرمجين المناسبة، ومسبار التحلل المائي الفلورسين، كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تحت التحريض لطيف، وذلك باستخدام أنبوب الدوار. الطرد المركزي مرحلة تفريق في 6000 س غ لمدة دقيقة واحدة وإزالة supernatant.إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجينوم Saccharomyces cerevisiae إلى بيليه، وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب أو التنصت قوية. إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ الفلوروسورفاكانت في زيت HFE إلى الأنبوب، لاستحلاب. قم بإزاحة بيليه عن طريق الأنابيب أو النقر على الأنبوب ، ثم دوامة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.السماح للاستحلابات لتسوية لمدة دقيقة واحدة، ثم إزالة 100 ميكرولتر من مرحلة النفط السفلي، واستبدال هذا الحجم مع 2٪ جديدة fluorosurfactant في زيت HFE. عكس بلطف أنبوب عدة مرات لخلط. كرر هذا ثلاث مرات أو أكثر، حتى تتم إزالة قطرات الأقمار الصناعية الصغيرة.بعد دقيقتين إلى خمس دقائق من الاستقرار، قم بإزالة مرحلة الزيت السفلي. استبدل هذا الحجم ب 5٪ فلوروسورفاتانت في زيت الفلوروكربون. ماصة 100 ميكرولتر من العينة في أنابيب PCR 200 ميكرولتر، ووضع أنابيب PCR في دراجة حرارية.ماصة العينة على شريحة العد للتصوير الفلورسنت، وصورة العينة. مستحلب الجسيمات قالب يتيح monodispersity رائعة. كما تتم إزالة supernatant الزائدة استقرار السطحي يضاف، ويتم دوامة العينة لتوليد مستحلب.تتكون القطرات الناتجة من عينة نواة الجسيمات والحوافض التي تحتوي على الكواشف وجزيئات العينة أو الخلايا اللازمة للتفاعل. تشير القطرات المتعددة الأضلاع ذات الجسيمات المتمبلرة إلى دوامة غير كافية. وثمة مسألة أخرى هي توليد سواتل مفرطة، تقلل من كفاءة التغليف.وينبغي ألا تشكل السواتل أكثر من 10 في المائة من مجموع حجم العينة المغلفة. ويمكن تطهيرها من مستحلب عن طريق غسل مع الزيت الطازج. ويمكن إثبات فائدة PTE في PCR الرقمية عندما تصبح قطرات تحتوي على أهداف مكبرة الفلورسنت، مما يسمح بالكمية المباشرة للأهداف.قطرات الفلورسنت تسفر عن عدد قليل من الإيجابيات عندما يكون الهدف نادرا، وكثير عندما تكون وفيرة. هذه النتائج قابلة للتكرار باستخدام جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا، وتحقيق قياسات دقيقة على نفس النطاق. إزالة supernatant من مرحلة تفريق مهم لتغليف العينة.معرفة حجم بيليه وsupernatant يمكن أن تساعد في تحديد واجهة بين البلدين. عندما تكون في شك، يخطئ على جانب إزالة supernatant.

Research

JoVE Journal

Biology

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

عالية السرعة نظام تسليم القطرة ومقرها سلبية الضخ في أجهزة ميكروفلويديك

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

نوعان من فحوصات الكشف عن الضفدع Chemoattraction الحيوانات المنوية

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Viability Assays for Cells in Culture

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

ترانسكريبتوميكس خلية واحدة على أساس المتوازية الحبرية من أنسجة الثدييات الكبار

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...