Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Dit werk bij de ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01-EB019453-02), het Office of the Director of National Intelligence, Intelligence Advanced Research Projects Activity via Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), het Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency via Texas A & M University (W911NF1920013) en Centers for Disease Control and Prevention via Johns Hopkins University Applied Natuurkundig Laboratorium (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). De standpunten en conclusies die hierin zijn opgenomen, zijn die van de auteurs en mogen niet worden geïnterpreteerd als noodzakelijkerwijs het officiële beleid, expliciet of impliciet, van de bovengenoemde organisaties of de Amerikaanse regering vertegenwoordigen. De Amerikaanse overheid is gemachtigd om herdrukken te reproduceren en te verspreiden voor overheidsdoeleinden, niettegenstaande eventuele auteursrechtelijke annotaties daarin.

1. Voorbereiding van hydrogeldeeltjes voor emulgering van deeltjes.
Hydrogeldeeltjes die worden gebruikt voor emulgering van deeltjessjablonen kunnen met twee verschillende methoden worden bereid.
<ol><li>Bereiding met behulp van in de handel verkrijgbare deeltjes
	<ol>
<li>Voeg 0,5 g gedroogde polyacrylamidedeeltjes die compatibel zijn met PTE (bijv. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm diameter) toe aan 30 ml steriel water in een conische buis van 50 ml en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding met behulp van microfluïdische fabricage van deeltjes OPMERKING: Polyacrylamidedeeltjes die compatibel zijn met PTE kunnen worden bereid met behulp van in de handel verkrijgbare druppelmakers (bijv. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) enz.), Of door een aangepast microfluïdisch ontwerp.<ol><li>Fabricage van aangepaste master
		<ol>
<li>Ontwerp een zacht fotolithografiemasker met behulp van CAD-software (Computer-Aided Design). Print het fotomasker met een resolutie van 10 μm op printplaatfolie.</li>
			<li>Giet 1 ml fotoresist op het midden van een 3 in silicium wafer. Gebruik een spincoater om een fotoresistlaag van 50 μm te creëren door deze gedurende 30 seconden bij 500 tpm te draaien, gevolgd door 1250 tpm gedurende 30 seconden. Plaats de wafer gedurende 15 minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 °C om het oplosmiddel te verdampen.</li>
			<li>Bevestig het fotomasker op de siliciumwafer met een afdekglasplaat en stel de wafer gedurende 2,5 minuten bloot onder een gecollimeerde 190 mW, 365 μm UV-LED. Plaats de wafer op een kookplaat die gedurende 5 minuten op 95 °C is ingesteld voor het bakken na blootstelling.</li>
			<li>Ontwikkel de fotoresist-siliciumwafer door deze onder te dompelen in een bad van 100% propyleenglycolmonomethyletheracetaat (PGMEA) gedurende maximaal 15 minuten. Spoel de wafer af met verse 100% PGMEA gevolgd door 100% isopropanol. Droog de wafer aan de lucht.</li>
			<li>Verwijder eventuele resterende isopropanol door de wafer gedurende 1 minuut te drogen op een kookplaat die is ingesteld op 95 °C. Doe de wafel in een schone 3 in petrischaal.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricage van het aangepaste microfluïdische apparaat
		<ol>
<li>Meng de siliciumbasis polydimethylsiloxaan (PDMS) en het uithardingsreagens in een massaverhouding van 10:1. Ontgas het gemengde PDMS met behulp van een exsiccator onder huisvacuüm totdat er geen luchtbellen waarneembaar zijn.</li>
			<li>Giet het ontgaste PDMS over de master in de petrischaal, zodat de siliciumwafer volledig onder water komt te staan. Ontgas de siliciumwafer en PDMS om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich tijdens het gieten hebben gevormd.</li>
			<li>Hard de PDMS uit door de siliciumwafer en PDMS gedurende ten minste 60 minuten in een oven op 65 °C te plaatsen. Verwijder een blok PDMS met de microfluïdische kenmerken uit de petrischaal met behulp van een scalpel. Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat eventuele functies op de siliciummaster worden beschadigd.</li>
			<li>Pons de inlaten en de uitlaten in het PDMS-blok dat overeenkomt met de in- en uitlaten in het microfluïdische apparaat met behulp van een biopsiepons van 0,75 mm. Verwijder stof en deeltjes met het herhaaldelijk aanbrengen en verwijderen van verpakkingstape op het oppervlak van het PDMS-blok.</li>
			<li>Reinig een glasplaat van 50 mm x 75 mm door deze af te spoelen met 100% isopropanol en vervolgens het oppervlak aan de lucht te drogen. Plasma behandelt zowel de glasplaat als de PDMS (functies naar boven gericht) met behulp van 1 mbar O2-plasma gedurende 1 minuut met behulp van een plasma-bonder.</li>
			<li>Bevestig de PDMS op de glasplaat door de met plasma behandelde PDMS met functies naar beneden op de glasplaat te plaatsen, plasmabehandelde zijde naar boven. Plaats de schuif in een oven die ten minste 30 minuten op 65 °C is ingesteld om de hechting te voltooien.</li>
			<li>Behandel alle microfluïdische kanalen met een gefluoreerde oppervlaktebehandeling om oppervlaktehydrofobiciteit te garanderen en bevochtiging te voorkomen. Bak het apparaat minstens 10 minuten op 65 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricage van templaatdeeltjes
		<ol>
<li>Bereid een polyacrylamide (PAA) oplossing bestaande uit 6,2% acrylamide, 0,18% N, N′-methyleenbis (acrylamide) en 0,3% ammoniumperssulfaat. Laad deze oplossing in een spuit van 1 ml met een naald van 28 G.</li>
			<li>Bereid een onoplosbare continue fase bestaande uit 5% (m/w) fluorosurfactant en 1% N,N,NN-tetramethylethyleendiamine (TEMED) in fluorkoolwaterstofolie (HFE) voor de vorming en stabilisatie van druppels. Laad de oplossing in een nieuwe spuit van 1 ml.</li>
			<li>Laad zowel PAA- als HFE-oplossing met spuiten in spuitpompen (bijv. NE-501). Sluit beide spuiten aan op het microfluïdische apparaat met behulp van polyethyleenslangen die op de spuit en in het apparaat zijn ingebracht. Voordat u aansluit, bereidt u de pompen voor om de lucht uit de slang te verwijderen. OPMERKING: Afhankelijk van het model kunnen spuitpompen worden aangestuurd met ingebouwde invoer, fabricagesoftware of een aangepast script (verkrijgbaar bij https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>Laat het dropgeneratie-apparaat met PAA- en HFE-olie-ingangen draaien op respectievelijk 300 μL/h en 500 μL/h. Verzamel 1 ml van de druppels in een opvangbuis van 15 ml en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur voor polymerisatie. Verwijder na de incubatie de onderste laag olie door te pipetteren.</li>
			<li>Voeg 1 ml 20% (v/v) perfluor-1-octanol (PFO) in HFE-olie toe aan de opvangbuis van 15 ml als chemische demulgator. Draai na het mengen de opvangbuis van 15 ml gedurende 2 minuten op 2000 x g . Verwijder het PFO/HFE-supernatant door te pipetteren. Herhaal dit 1x.</li>
			<li>Voeg 2 ml 2% sorbitanmonooleaat in hexaan toe aan de verzamelbuis van 15 ml en vortex om te mengen. Draai de buis gedurende 3 min op 3000 x g . Verwijder het supernatant door te pipetteren om oppervlakteactieve stof/hexaanoplossing te verwijderen. Herhaal dit 2x.</li>
			<li>Voeg 5 ml TEBST-buffer toe (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) en meng goed. Draai gedurende 3 minuten naar beneden bij 3.000 x g . Verwijder het supernatant door te pipetteren. Herhaal dit 3x.</li>
			<li>Resuspend in 5 mL TEBST. Deze oplossing mag voor onbepaalde tijd bij 4 °C worden bewaard.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Emulgering van deeltjessjablonen.
Na de bereiding van templaatdeeltjes wordt PTE gebruikt om het monster en de reagentia in druppels in te kapselen.
<ol><li>Bereid de polyacrylamidedeeltjes voor op emulgering van deeltjes door gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 6000 x g om de deeltjes te pelleteren, verwijder vervolgens het supernatant door te pipetteren en opnieuw te suspenderen met steriel water. Herhaal dit 3x om ervoor te zorgen dat eventuele resterende TEBST wordt verwijderd.</li>
	<li>Bepaal de concentratie en diameter van de templating deeltjes met behulp van een hemocytometer (of gelijkwaardig). Bereken de individuele deeltjesdiameter door de diameters in pixels te meten en om te zetten in microns. Conversie van pixels naar microns kan worden berekend met behulp van de hemocytometer (of gelijkwaardig) als een kalibratieschuif en het meten van de bekende rasterafstand in pixels.</li>
	<li>Bereid de dispersiefase voor in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een PCR-mastermix, de juiste primers en een fluoresceïnehydrolysesonde volgens tabel 1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten onder zacht roeren (10 rpm) met behulp van een buisrotator om een homogene verdeling van de componenten te garanderen. OPMERKING: Het volume en de doelconcentratie van deeltjes zijn gebaseerd op poissonbelasting. Als algemene regel geldt dat het aantal deeltjes een orde van grootte groter moet zijn dan het aantal monsters dat moet worden ingekapseld. Voor monsters met onbekende concentraties is een verdunningsreeks nodig om de Poisson-belasting te waarborgen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volume</td>
			<td>Reagens</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μL</td>
			<td>Deeltjes (450 deeltjes / μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μL</td>
			<td>2x PCR master mix</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM sonde</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 μL</td>
			<td>Triton X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45,2 μL</td>
			<td>Nuclease vrij water</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Bereiding van de PCR-mastermix gebruikt met PTE voor digitale druppel PCR.
<ol start="4"><li>Centrifugeer de dispergeerfase bij 6000 x g gedurende 1 min en verwijder het supernatant. Noteer het volume van het geëxtraheerde supernatant en bepaal met behulp van het totale disperse fasevolume berekend in 2.3 het pelletvolume. OPMERKING: De hoeveelheid geëxtraheerd supernatant varieert afhankelijk van de deeltjesverpakking, diameter en concentratie met een minimaal verwacht volume van 300 μL.</li>
	<li>Voeg 1 μL van 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomisch DNA toe aan de pellet van 2,4 en meng grondig door pipetteren of krachtig tappen. OPMERKING: De aanwezigheid van overtollig waterig gehalte kan de inkapselingsefficiëntie verminderen. Als het monstervolume meer dan 1% van het pelletvolume bedraagt, concentreert u het monster. Als het monster niet kan worden geconcentreerd, schaalt u het PCR-hoofdmengsel en het resulterende pelletvolume op basis van het monstervolume. PTE maakt de emulgering van kleine (10 μL) tot grote (2 ml) volumes templaatdeeltjes mogelijk. De PCR-mastermix (2.3) en olie (2.6) kunnen worden geschaald volgens respectievelijk het doelvolume (2.3) en het gemeten (2.4) volume van de deeltjeskorrel.</li>
	<li>Voeg 200 μL 2% fluorosurfactant in HFE-olie toe aan de buis als de onoplosbare continue fase voor emulgering. Zorg ervoor dat de pellet wordt losgemaakt door de buis te pipetteren of te tikken/vegen. Dan vortex bij 3000 rpm gedurende 30 sec. OPMERKING: De instelling die overeenkomt met 3000 tpm kan variëren, afhankelijk van het merk en het model.</li>
	<li>Laat de emulsies 1 min bezinken. Verwijder 100 μL van de onderste oliefase en vervang dit volume door verse 2% fluorosurfactant in HFE-olie. Keer de buis voorzichtig meerdere keren om om te mengen. Herhaal dit 3-5x of totdat kleine satellietdruppeltjes zijn verwijderd.</li>
</ol>3. Digitale druppel PCR en analyse.
<ol><li>Verwijder na 2-5 minuten bezinken de onderste oliefase. Vervang dit volume door 5% fluorosurfactant in fluorkoolstofolie (bijv. FC-40).</li>
	<li>Pipetteer met behulp van een pipetpunt met brede boring voorzichtig de 100 μL monster in PCR-buizen van 200 μL. Plaats de PCR-buizen in een thermocycler en voer uit volgens tabel 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Temperatuur</td>
			<td>Duur</td>
			<td>Notities</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Herhaal x34 stap 2 tot en met 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>houden</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Thermocyclische omstandigheden voor digitale druppel PCR met behulp van PTE emulsies.
<ol start="3"><li>Pipetteer het monster op een telschuif met behulp van een pipetpunt met brede boring voor fluorescerende beeldvorming. Stel het monster voor met een fluorescerende microscoop met 490 nm excitatie en 525 nm emissiedetectiegolflengten.</li>
	<li>Kwantificeer de positieve fluorescerende druppels (Np) en totale druppels (NT) om de aanwezigheid te verifiëren en het aantal sjabloonmoleculen (λ) te berekenen met behulp van de fractie van positieve druppels (Np / NT) en Poisson-statistieken: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>Bereken het 95% betrouwbaarheidsinterval (zc = 1,96) met: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>Bereken de monsterconcentratie (moleculen/μL) met behulp van het volume (ν in μL) van het monster dat in stap 2.5 is toegevoegd, met behulp van de onderstaande vergelijking. Bepaal het gemiddelde en de standaardafwijking van de monsterconcentratie met behulp van technische replicaties. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

PTE gebruikt deeltjes om monsters in monodispersed druppels in te kapselen door vortexing. Naast de eenvoud en toegankelijkheid biedt PTE verschillende extra voordelen, waaronder het onmiddellijk genereren van grote hoeveelheden druppels. Bovendien kan het proces worden uitgevoerd in een geïsoleerde buis, waardoor het niet nodig is om monsters over te brengen naar microfluïdische apparaten, waardoor de algehele workflow wordt gestroomlijnd en de mogelijkheden voor monsterbesmetting of -verlies worden beperkt. De templating deeltjes bieden ook een middel om de inhoud van de resulterende druppelreacties te manipuleren. Deeltjesgrootte, chemie en bevochtigbaarheid kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen voor gerichte biomolecuul- of celvangst, terwijl functionele moieties zoals enzymen, actieve stoffen of nucleïnezuren op deeltjes kunnen worden weergegeven om reacties te vergemakkelijken, zoals voor single cell sequencing of functionele karakterisering. Hoewel de aanpak flexibel is, zijn er toch belangrijke beperkingen aan het gebruik ervan. Het is momenteel bijvoorbeeld niet mogelijk om druppeltoevoegingen uit te voeren zoals vaak wordt uitgevoerd met microfluïdica, waarbij alle reactiecomponenten vóór de inkapseling moeten worden geïntroduceerd; dit vereist dat reagentia compatibel en stabiel zijn totdat de druppels kunnen worden gegenereerd en, in het geval van lastige combinaties, vaak kunnen worden aangepakt door het monster snel op ijs te mengen en te emulgeren. Als alternatief kunnen reactieve componenten worden gebruikt die extern met licht of warmte kunnen worden geactiveerd13. PTE biedt dus een flexibele en schaalbare methode voor het uitvoeren van druppeltests die toegankelijk zijn voor niet-experts. Dit, in combinatie met zijn aangeboren eenvoud en flexibiliteit, maakt PTE ideaal voor de uitvoering en ontwikkeling van tal van druppeltoepassingen.

Druppelmicrofluïdica maakt gebruik van compartimentering in picoliterdruppels om de gevoeligheid en nauwkeurigheid van assays te verhogen in vergelijking met bulkreacties, en heeft tal van toepassingen in chemische screening, eiwittechnologie en sequencing van de volgende generatie1,2,3. Digitale druppelpolymerasekettingreactie (ddPCR) biedt bijvoorbeeld een verhoogde nauwkeurigheid in vergelijking met bulk kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), met toepassingen voor genetische variatie in kankers, detectie van ziekteveroorzakende mutaties en prenatale diagnostiek4,5,6. Een uitdaging van druppelmicrofluïdica is echter de vereiste van microfluïdische apparaten om monsters te partitioneren; hoewel microfluïdica een uitstekende controle over druppeleigenschappen bieden, vereisen ze gespecialiseerde expertise om te bouwen en te bedienen7,8. Bijgevolg zijn op druppels gebaseerde methoden grotendeels beperkt tot deskundige laboratoria of, in zeldzame gevallen, toepassingen waarin een commercieel instrument beschikbaar is9,10. Om het gebruik van druppeltests te verbreden, is de vereiste voor gespecialiseerde microfluïdische instrumentatie een hindernis die moet worden overwonnen.
In dit artikel beschrijven we Particle Templated Emulsification (PTE), een microfluïdisch-vrije methode voor het uitvoeren van reacties in monodispersed druppels. Bij PTE overspoelen templerende deeltjes het monster in druppeltjes in dragerolie door eenvoudige vortexing (figuur 1). Terwijl het systeem zich mengt, fragmenteert het waterige gedeelte in druppels van afnemende grootte totdat de druppels afzonderlijke deeltjes bevatten, op welk punt verdere fragmentatie niet mogelijk is omdat het nodig is om de deeltjes te breken. Het verzwelgende monster omringt de deeltjes als een schil in de druppels, waardoor alle gedispergeerde cellen, reagentia of functionele moieties worden ingekapseld (figuur 1D). PTE vereist dus geen apparatuur of expertise om druppelreacties uit te voeren die verder gaan dan een gemeenschappelijke vortexer. Bovendien duurt het genereren van druppels seconden in vergelijking met minuten of uren met microfluïdica, en de geproduceerde hoeveelheid is evenredig met het containervolume, niet met de bedrijfstijd van het apparaat, waardoor het uiterst schaalbaar is. Deze voordelen maken PTE ideaal voor het uitvoeren van druppeltests in verschillende omstandigheden waarin microfluïdica onpraktisch zijn. Hier demonstreren we PTE en gebruiken het om ddPCR uit te voeren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Figuur 1. Overzicht van het emulgeringsproces met deeltjessjabloon. (A) Templating deeltjes worden gemengd met reagentia. (B) Overtollige reagentia worden verwijderd na centrifugeren. (C) De toevoeging van sjabloonmoleculen vindt plaats vóór de toevoeging van olie. (D) Vortexing produceert druppeltjes die een enkel sjabloonmolecuul bevatten. (E) Daaropvolgende thermocycling en beeldvorming maken digitale druppelanalyse van doelsjabloon mogelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

Reacties uitgevoerd in monodispersed druppels zorgen voor verbeterde nauwkeurigheid en gevoeligheid in vergelijking met equivalente druppels die in bulk worden uitgevoerd. De vereiste van microfluïdica om gecontroleerde druppels te vormen, legt echter een barrière op voor niet-experts, waardoor het gebruik ervan wordt beperkt. Hier beschrijven we deeltjessjabloonemulgering, een benadering om monodisperse druppels te genereren zonder microfluïdica. Met behulp van templating hydrogel bollen, kapselen we monsters in monodispersed druppels door eenvoudige vortexing. We demonstreren de aanpak door het te gebruiken om microfluïdisch-vrije digitale PCR uit te voeren.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Figuur 2. Inkapseling van het monster in druppels met behulp van emulgering van deeltjessjablonen. (A) templating deeltjes die worden gebruikt voor het templeren van deeltjes. (B) Scheiding van templating deeltjeskorrel van supernatant na centrifugering. (C) Druppels die het resultaat zijn van emulgering van deeltjes met (D) identificeerbare waterige schil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Bij PTE wordt de monodispersiteit van de emulsies bepaald door die van de templaatdeeltjes, omdat de druppels een diameter hebben die iets groter is dan de deeltjes. Uniforme deeltjes staan dus centraal bij gecontroleerde PTE-inkapseling11. Er bestaan verschillende methoden voor het genereren van uniforme templating deeltjes, waaronder chemische (sol-gel, emulsiepolymerisatie), hydrodynamische (membraanemulgering, homogenisatie) en filtratiemethoden. Microfluïdische benaderingen in het bijzonder, bieden uitstekende monodispersiteit (figuur 2A) en maken extra deeltjestechnologie mogelijk om hun functionaliteit in PTE12 te verbeteren. Als alternatief kunnen tempulerende deeltjes worden gekocht, hoewel hun uniformiteit, hoewel voldoende, meestal minder is dan bij microfluïdische generatie11.
Om PTE uit te voeren, worden de deeltjes gemengd met het in te kapselen monster (figuur 1A) en wordt het overtollige supernatant verwijderd door centrifugeren en pipetteren (figuur 1B), zoals geïllustreerd door een foto van een deeltjespellet aan de onderkant van een PCR-buis (figuur 2B). De inkapselende olie die een stabiliserende oppervlakteactieve stof bevat, wordt vervolgens toegevoegd (figuur 1C) en het monster wordt voorzichtig gepipetteerd voordat het gedurende 30 seconden vortext (figuur 1D) om de emulsie te genereren (figuur 2C). De resulterende druppels bevatten een deeltjeskern en een waterige schil die het eerste monster vormen, waarin zich de reagentia, doelmoleculen en cellen bevinden die nodig zijn voor de reactie (figuur 2D). Net als bij druppelmicrofluïdische inkapseling worden discrete entiteiten zoals kleine kralen of cellen willekeurig en in overeenstemming met een Poisson-verdeling ingekapseld, hoewel bijna alle druppels een temperend deeltje bevatten vanwege de aard van de PTE-fysica.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Figuur 3. Identificatie en opschoning van emulgeringdruppels met deeltjessjabloon. (A) Voorbeeld van niet-uniforme druppelgeneratie met meerdere deeltjes per druppel door onvoldoende vortexing. (B) Verwachte aanwezigheid van satellieten en druppels na emulgering van deeltjessjablonen en (C) de water-in-olie fractionering. (D) Resulterende emulsie na het wassen van olie. (E) Overmatige satellietgeneratie als gevolg van resterend supernatant tijdens emulgering van deeltjespatronen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Zelfs bij succesvolle PTE bestaan dubbele of drievoudige kerndruppels, hoewel ze over het algemeen verwaarloosbaar bijdragen aan de reactie, op voorwaarde dat ze zeldzaam zijn. Het bereiken van een lage frequentie van multicore druppels met behoud van adequate schalen vereist optimalisatie van procesparameters, waaronder oppervlaktespanning, adhesiekrachten tussen deeltjes, monsterviscositeit, containergrootte en vortexingvermogen en -tijd. Een slecht geoptimaliseerde emulgering kan bijvoorbeeld polydispersed druppels bevatten met veel templating deeltjes (figuur 3A), wat aangeeft dat de vortexing onvoldoende was om het monster volledig te emulgeren. In dergelijke gevallen kunnen reinigingsmiddelen worden toegevoegd om de hechting tussen deeltjes te verminderen en de oppervlaktespanning te verlagen, of kan het vortexvermogen of de vortexingskracht of -tijd worden verhoogd. Een ander veel voorkomend probleem is het genereren van overmatige satellieten, die kleine lege druppeltjes zijn (figuur 3B). Satellieten kunnen onvermijdelijk zijn bij PTE-emulsies, afhankelijk van de interfaciale spanning en reologische eigenschappen van het monster en de dragerolie. Ze zijn echter vaak het gevolg van het niet voldoende verwijderen van overtollig monster voorafgaand aan emulgering (figuur 2B), of vortexing met te veel kracht, waardoor de schelpen van de druppels worden ontdaan. Bij een succesvolle PTE-emulgering mogen satellieten niet meer dan ~10% van het totale ingekapselde monstervolume uitmaken (figuur 3C)11. Op dit niveau dragen ze meestal verwaarloosbaar bij aan de reactie en kunnen ze worden genegeerd. Voor esthetische doeleinden kunnen ze uit de emulsie worden verwijderd door te wassen met verse olie (figuur 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Figuur 4. Evaluatie van deeltjessjabloon emulgering digitale druppel PCR. (A) Fluorescerende beeldvorming van de druppels identificeert positieve fluorescerende druppels en negatieve niet-fluorescerende druppels. (B) Identificatie van zeldzame template of lage concentraties template met digitale druppel PCR. (C) Over overvloedige sjablooninkapseling resulterend in een variabel aantal sjabloonmoleculen per druppel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om het nut van PTE aan te tonen, hebben we het gebruikt om microfluïdisch-vrije digitale PCR11 uit te voeren. Met behulp van het proces hebben we een monster ingekapseld dat bestaat uit S. cerevisiae genomisch DNA en het gethermcycled. In digitale PCR worden druppels met versterkte doelen fluorescerend, terwijl die zonder dim blijven. Een fluorescerende druppel geeft dus een doel aan, waardoor doelen direct kunnen worden gekwantificeerd door positieve druppels te tellen (figuur 4A). Het aantal fluorescerende druppels schaalt dus met de doelmoleculen en levert weinig positieven op wanneer het doelwit zeldzaam is (figuur 4B) en veel wanneer het overvloedig is (figuur 4C). Net als bij inkapseling van andere discrete componenten volgt doelinkapseling een Poisson-verdeling, waardoor de positieve druppelfractie kan worden omgezet in de doelconcentratie (figuur 4D), waardoor het vermogen wordt aangetoond om digitale PCR uit te voeren met PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Figuur 5. Demonstratie van digitale druppel PCR met behulp van in de handel verkrijgbare PAA. (A) Fluorescerende beeldvorming van de druppels identificeert negatieve niet-fluorescerende druppels. (B) Identificatie van lage concentraties sjabloon met digitale druppel PCR. (C) Identificatie van hoge concentraties template met digitale druppel PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Deze resultaten zijn herhaalbaar met behulp van in de handel verkrijgbare polyacrylamidedeeltjes (figuur 5) en tonen het vermogen van PTE aan om standaard digitale PCR uit te voeren met in de handel verkrijgbare polyacrylamidedeeltjes, waardoor nauwkeurige metingen over hetzelfde bereik worden bereikt.
Aanvullend bestand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Water-in-olie druppels testen zijn nuttig voor analytische chemie, enzymevolutie en eencellige analyse, maar vereisen meestal microfluïdica om de druppels te vormen. Hier beschrijven we deeltjessjabloonemulgering, een microfluïdische benadering om druppeltests uit te voeren.

Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Digitale druppel PCR biedt verbeterde nauwkeurigheid en gevoeligheid in vergelijking met kwantitatieve PCR. Dit is een eenvoudige methode voor digitale druppel PCR die minimale apparatuur en geen expertise vereist. Deeltjessjabloonemulgering is een microfluïdische emulgeringsmethode waarvoor geen gespecialiseerde apparatuur nodig is.Bovendien vindt emulgering plaats over een periode van seconden en schaalt deze op tot containervolume. Voeg voor commerciële kralen 0,5 gram gedroogde polyacrylamidedeeltjes toe die compatibel zijn met deeltjessjabloonemulgering of PTE aan 30 milliliter steriel water in een conische buis van 50 milliliter en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Voor de microfluïdische fabricage van kralen, giet een milliliter fotoresist op het midden van een drie-inch silicium wafer en draai het vervolgens op 500 RPM gedurende 30 seconden, gevolgd door 1250 RPM gedurende 30 seconden. Plaats de wafer gedurende 15 minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius om het oplosmiddel te verdampen. Bevestig het fotomasker op de siliciumwafer met een schuifglas en stel de wafer gedurende 2,5 minuten bloot onder een gecollimeerde UV-LED.Plaats de wafel vijf minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius om na blootstelling te bakken. Ontwikkel de fotoresist siliciumwafer door deze gedurende maximaal 15 minuten onder te dompelen in een bad van 100% PGMEA. Spoel de wafel af met verse 100%PGMEA, gevolgd door 100%isopropanol.Droog de wafel aan de lucht, droog hem vervolgens gedurende één minuut op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius en plaats hem in een schone petrischaal van drie inch. Meng de PDMS-siliciumbasis en het uithardingsreagens in een verhouding van 10:1 en ontgas vervolgens de gemengde PDMS met behulp van een exsiccator onder vacuüm totdat er geen luchtbellen waarneembaar zijn. Giet het ontgaste PDMS in de petrischaal, zodat de siliciumwafer volledig onder water komt te staan.Ontgas de siliciumwafer en PDMS en hard vervolgens de PDMS uit door de siliciumwafer gedurende ten minste 60 minuten in een oven te plaatsen die is ingesteld op 65 graden Celsius. Verwijder een blok PDMS met de microfluïdische kenmerken uit de petrischaal met behulp van een scalpel. Pons de inlaten en de uitgangen in het PDMS-blok met behulp van een biopsiespons van 0,75 millimeter.Verwijder vervolgens stof en deeltjes met het herhaaldelijk aanbrengen en verwijderen van verpakkingstape naar het blokoppervlak. Reinig een glasplaat door deze af te spoelen met 100% isopropanol en vervolgens het oppervlak aan de lucht te drogen. Plasma behandelt zowel de glasplaat als het PDMS met één millibar zuurstofplasma gedurende één minuut, met behulp van een plasmabindingsmiddel.Bevestig de PDMS op de glasplaat door de plasmabehandelde PDMS met functies naar beneden gericht op de glasplaat te plaatsen, plasmabehandelde zijde naar boven gericht. Plaats de schuif minstens 30 minuten in een oven die op 65 graden Celsius is ingesteld om de hechting te voltooien. Behandel alle microfluïdische kanalen met een gefluoreerde oppervlaktebehandeling om hydrofobiciteit van het oppervlak te garanderen en bak het apparaat vervolgens gedurende ten minste 10 minuten op 65 graden Celsius.Laad zowel polyacrylamide, of PAA, als fluorwaterstof, of HFE, oplossingsbevattende spuiten in spuitpompen. Sluit beide spuiten aan op het microfluïdische apparaat met behulp van polyethyleen buizen. Voer het druppelgeneratie-apparaat uit en verzamel een milliliter van de druppels in een opvangbuis van 15 milliliter en incubeer vervolgens gedurende drie uur bij kamertemperatuur voor polymerisatie.Verwijder na de incubatie de onderste laag olie door te pipetteren. Voeg een milliliter van 20% PFO in HFE-olie toe aan de opvangbuis van 15 milliliter als chemische demulgator. Draai na het mengen de 15-milliliter opvangbuis gedurende twee minuten op 2000 x g.Verwijder de onderste laag door te pipetteren en herhaal het proces nog een keer. Voeg twee milliliter 2%sorbitanmonooleaat in hexaan toe aan de 15-milliliter verzamelbuis en vortex het. Draai de buis gedurende drie minuten op 3000 x g en verwijder het supernatant door te pipetteren om de oppervlakteactieve oplossing te verwijderen.Herhaal dit twee keer. Voeg vijf milliliter TEBST-buffer toe en meng goed, draai dan drie minuten op 3000 x g en verwijder het supernatant door te pipetteren. Herhaal dit drie keer en geef het vervolgens opnieuw op in vijf milliliter TEBST.Bereid de polyacrylamidedeeltjes voor op emulgering van deeltjes door gedurende één minuut te centrifugeren bij 6000 x g om de deeltjes te pelleteren. Verwijder vervolgens het supernatant door te pipetteren en resuspend de pellet in steriel water. Herhaal dit drie keer om ervoor te zorgen dat eventuele resterende TEBST wordt verwijderd.Bereid de disperse fase voor in een verse centrifugebuis van 15 milliliter, met behulp van een PCR-mastermix, de juiste primers en een fluoresceïnehydrolysesonde, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten onder voorzichtig roeren, met behulp van een buisrotator. Centrifugeer de dispergeerfase gedurende één minuut bij 6000 x g en verwijder het supernatant.Voeg een microliter Saccharomyces cerevisiae genomisch DNA toe aan de pellet en meng grondig door pipetteren of krachtig tappen. Voeg 200 microliter 2% fluorosurfactant in HFE-olie toe aan de buis, voor emulgering. Maak de pellet los door de buis te pipetteren of te tikken en vortex vervolgens bij 3000 RPM gedurende 30 seconden.Laat de emulsies een minuut bezinken, verwijder vervolgens 100 microliter van de onderste oliefase en vervang dit volume door verse 2% fluorosurfactant in HFE-olie. Keer de buis voorzichtig meerdere keren om om te mengen. Herhaal dit drie keer of meer, totdat kleine satellietdruppeltjes zijn verwijderd.Verwijder na twee tot vijf minuten bezinken de onderste oliefase. Vervang dit volume door 5%fluorosurfactant in fluorkoolstofolie. Pipetteer 100 microliter monster in PCR-buizen van 200 microliter en plaats de PCR-buizen in een thermocycler.Pipetteer het monster op een telglaasje voor fluorescerende beeldvorming en stel het monster af. Emulgering met deeltjessjabloon biedt uitstekende monodispersiteit. Naarmate het overtollige supernatant wordt verwijderd, wordt een stabiliserende oppervlakteactieve stof toegevoegd en wordt het monster vortexed om de emulsie te genereren.De resulterende druppels bestaan uit deeltjeskern en waterig monster met reagentia en monstermoleculen of cellen die nodig zijn voor de reactie. Polydispersed druppels met templating deeltjes duiden op onvoldoende vortex. Een ander probleem is het genereren van overmatige satellieten, die de inkapselingsefficiëntie verlagen.Satellieten mogen niet meer dan 10% van het totale ingekapselde monstervolume uitmaken. Ze kunnen uit de emulsie worden verwijderd door te wassen met verse olie. Het nut van PTE kan worden aangetoond in digitale PCR wanneer druppels met versterkte doelen fluorescerend worden, waardoor directe kwantificering van doelen mogelijk is.De fluorescerende druppels leveren weinig positieven op wanneer het doelwit zeldzaam is, en veel wanneer het overvloedig aanwezig is. Deze resultaten zijn herhaalbaar met behulp van in de handel verkrijgbare polyacrylamidedeeltjes, waardoor nauwkeurige metingen over hetzelfde bereik worden bereikt. De verwijdering van supernatant uit de disperse fase is belangrijk voor de inkapseling van monsters.Het kennen van het volume van de pellet en het supernatant kan helpen bij het identificeren van de interface tussen de twee. Bij twijfel, vergis je aan de kant van het verwijderen van het supernatant.

Research

JoVE Journal

Biology

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

High Speed ​​Droplet-based Delivery System voor Passive Pompen in microfluïdische apparaten

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Viability Assays for Cells in Culture

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro cel-migratie en invasie assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...