Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
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Ce travail d’élaboration de ce protocole a été soutenu par les National Institutes of Health (R01-EB019453-02), le Bureau du directeur du renseignement national, l’activité des projets de recherche avancée sur le renseignement par l’intermédiaire de Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), le chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, la Defense Advanced Research Projects Agency par l’intermédiaire de la Texas A & M University (W911NF1920013) et les Centers for Disease Control and Prevention de l’Université Johns Hopkins Applied Laboratoire de physique (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Les points de vue et les conclusions contenus dans le présent document sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant nécessairement les politiques officielles, expresses ou implicites, des organisations susmentionnées ou du gouvernement des États-Unis. Le gouvernement des États-Unis est autorisé à reproduire et à distribuer des réimpressions à des fins gouvernementales nonobstant toute annotation de droit d’auteur.

1. Préparation de particules d’hydrogel pour l’émulsification de particules.
Les particules d’hydrogel utilisées pour l’émulsification par gabarit de particules peuvent être préparées à l’aide de deux méthodes différentes.
<ol><li>Préparation à l’aide de particules disponibles dans le commerce
	<ol>
<li>Ajouter 0,5 g de particules de polyacrylamide séchées compatibles avec le PTE (p. ex. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm de diamètre) à 30 mL d’eau stérile dans un tube conique de 50 mL et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation par fabrication microfluidique de particules REMARQUE: Les particules de polyacrylamide compatibles avec PTE peuvent être préparées à l’aide de gouttes disponibles dans le commerce (par exemple, QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent), etc.), ou par conception microfluidique personnalisée.<ol><li>Fabrication de maître sur mesure
		<ol>
<li>Concevez un masque de photolithographie souple à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Imprimez le photomasque avec une résolution de 10 μm sur un film de carte de circuit imprimé.</li>
			<li>Verser 1 mL de résine photosensible sur le centre d’une plaquette de silicium 3 dans. Utilisez un enrobeur de spin pour créer une couche de résine photosensible de 50 μm en la faisant tourner à 500 tr/min pendant 30 secondes, puis à 1250 tr/min pendant 30 secondes. Placer la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 15 min pour évaporer le solvant.</li>
			<li>Fixez le photomasque sur la plaquette de silicium à l’aide d’une lame de verre de couverture et exposez la plaquette sous une LED UV collimée de 190 mW et 365 μm pendant 2,5 min. Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 5 min pour la cuisson post-exposition.</li>
			<li>Développer la plaquette de silicium photorésistant en l’immergeant dans un bain d’acétate d’éther monométhylique (PGMEA) à 100% de propylène glycol pendant 15 min. Rincez la plaquette avec de l’AMDA frais 100% suivi de 100% d’isopropanol. Sécher la plaquette à l’air libre.</li>
			<li>Retirer tout isopropanol résiduel en séchant la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 1 min. Placez la gaufrette dans un 3 propre dans une boîte de Pétri.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabrication du dispositif microfluidique sur mesure
		<ol>
<li>Mélanger la base de silicium polydiméthylsiloxane (PDMS) et le réactif de durcissement dans un rapport de 10:1 en masse. Dégazez le PDMS mélangé à l’aide d’un dessiccateur sous vide domestique jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit observable.</li>
			<li>Versez le PDMS dégazé sur le maître dans la boîte de Pétri, en veillant à ce que la plaquette de silicium soit complètement immergée. Dégazez la plaquette de silicium et le PDMS pour éliminer les bulles d’air qui ont pu se former pendant le versement.</li>
			<li>Durcissez le PDMS en plaçant la plaquette de silicium et le PDMS dans un four réglé à 65 °C pendant au moins 60 min. Excisez un bloc de PDMS contenant les caractéristiques microfluidiques de la boîte de Pétri à l’aide d’un scalpel. Prenez des précautions supplémentaires pour éviter d’endommager les caractéristiques présentes sur le maître de silicium.</li>
			<li>Poinçonner les entrées et les sorties dans le bloc PDMS correspondant aux entrées et sorties du dispositif microfluidique à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm. Enlevez la poussière et les particules avec l’application répétitive et le retrait du ruban d’emballage à la surface du bloc PDMS.</li>
			<li>Nettoyez une lame de verre de 50 mm x 75 mm en la rinçant avec 100% d’isopropanol et en séchant ensuite la surface à l’air. Le plasma traite à la fois la lame de verre et le PDMS (caractéristiques tournées vers le haut) en utilisant 1 mbar de plasma O2 pendant 1 min à l’aide d’un liant plasma.</li>
			<li>Fixez le PDMS sur la lame de verre en plaçant le PDMS traité au plasma avec des caractéristiques tournées vers le bas sur la lame de verre, côté traité au plasma vers le haut. Placez la glissière dans un four réglé à 65 °C pendant au moins 30 minutes pour terminer le collage.</li>
			<li>Traiter tous les canaux microfluidiques avec un traitement de surface fluoré pour assurer l’hydrophobicité de surface et prévenir le mouillage. Cuire l’appareil à 65 °C pendant au moins 10 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabrication de particules de modélisation
		<ol>
<li>Préparer une solution de polyacrylamide (PAA) composée de 6,2 % d’acrylamide, de 0,18 % de N,N′-méthylènebis (acrylamide) et de persulfate d’ammonium à 0,3 %. Chargez cette solution dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 28G.</li>
			<li>Préparer une phase continue insoluble composée de 5 % (p/p) de fluorosurfactant et de 1 % de N,N,NN-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans de l’huile d’hydrofluoroéther (HFE) pour la génération et la stabilisation des gouttelettes. Chargez la solution dans une nouvelle seringue de 1 mL.</li>
			<li>Chargez les seringues contenant des seringues PAA et HFE dans des pompes à seringues (p. ex. NE-501). Connectez les deux seringues au dispositif microfluidique à l’aide d’un tube en polyéthylène inséré sur la seringue et dans l’appareil. Avant le raccordement, amorcez les pompes pour éliminer l’air du tube. REMARQUE: Selon le modèle, les pompes à seringue peuvent être contrôlées avec une entrée intégrée, un logiciel de fabrication ou un script personnalisé (disponible à https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>Exécutez le dispositif de génération de gouttes avec des entrées d’huile PAA et HFE à 300 μL / h et 500 μL / h, respectivement. Recueillir 1 mL des gouttelettes dans un tube collecteur de 15 mL et incuber pendant 3 h à température ambiante pour la polymérisation. Après l’incubation, retirez la couche inférieure d’huile par pipetage.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de perfluoro-1-octanol (PFO) à 20 % (v/v) dans l’huile HFE au tube de collecte de 15 mL comme désémulsifiant chimique. Après le mélange, faire tourner le tube collecteur de 15 mL à 2000 x g pendant 2 min. Retirer le surnageant PFO/HFE par pipetage. Répétez 1x.</li>
			<li>Ajouter 2 mL de monooléate de sorbitan à 2 % dans l’hexane au tube de collecte de 15 mL et au vortex pour mélanger. Faire tourner le tube à 3000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage pour éliminer la solution de tensioactif/hexane. Répétez 2x.</li>
			<li>Ajouter 5 mL de tampon TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2 % Triton X-100) et bien mélanger. Tourner vers le bas à 3 000 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant par pipetage. Répétez 3x.</li>
			<li>Remise en suspension en 5 mL TEBST. Cette solution peut être conservée à 4 °C indéfiniment.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Émulsification à gabarit de particules.
Après la préparation des particules de modélisation, le PTE est utilisé pour encapsuler l’échantillon et les réactifs dans des gouttelettes.
<ol><li>Préparer les particules de polyacrylamide pour l’émulsification par gabarit de particules en centrifugant à 6000 x g pendant 1 min pour granuler les particules, puis retirer le surnage par pipetage et remise en suspension à l’aide d’eau stérile. Répétez 3x pour vous assurer de l’élimination de tout TEBST résiduel.</li>
	<li>Déterminer la concentration et le diamètre des particules de modélisation à l’aide d’un hémocytomètre (ou équivalent). Calculez le diamètre des particules individuelles en mesurant les diamètres en pixels et en les convertissant en microns. La conversion des pixels en microns peut être calculée à l’aide de l’hémocytomètre (ou équivalent) comme diapositive d’étalonnage et en mesurant la distance connue de la grille en pixels.</li>
	<li>Préparer la phase dispersée dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL à l’aide d’un mélange maître PCR, des amorces appropriées et d’une sonde d’hydrolyse de la fluorescéine conformément au tableau 1. Incuber à température ambiante pendant 5 min sous agitation douce (10 tr/min) à l’aide d’un rotateur à tube pour assurer une distribution homogène des composants. REMARQUE: Le volume et la concentration cible des particules sont basés sur la charge de Poisson. En règle générale, le nombre de particules doit être supérieur d’un ordre de grandeur au nombre d’échantillons à encapsuler. Pour les échantillons de concentrations inconnues, une série de dilution est nécessaire pour assurer le chargement de Poisson.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volume</td>
			<td>Réactif</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μL</td>
			<td>Particules (450 particules / μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μL</td>
			<td>2x mélange maître PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Amorce avant de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Amorce inverse de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Sonde de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 μL</td>
			<td>Triton X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45,2 μL</td>
			<td>Eau sans nucléase</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Préparation du mélange maître PCR utilisé avec PTE pour la PCR numérique par gouttelettes.
<ol start="4"><li>Centrifuger la phase dispersée à 6000 x g pendant 1 min et retirer le surnageant. Enregistrer le volume du surnageant extrait et, à l’aide du volume total de la phase de dispersion calculé au point 2.3 , déterminer le volume de granulés. REMARQUE: La quantité de surnageant extraite variera en fonction de l’emballage des particules, du diamètre et de la concentration avec un volume minimum prévu de 300 μL.</li>
	<li>Ajouter 1 μL d’ADN génomique de 1,62 pg/μL de Saccharomyces cerevisiae à la pastille à partir de 2,4 et bien mélanger par pipetage ou tapotement vigoureux. REMARQUE: La présence d’un excès de contenu aqueux peut diminuer l’efficacité de l’encapsulation. Si le volume de l’échantillon dépasse 1 % du volume de granulés, concentrez l’échantillon. Si l’échantillon ne peut pas être concentré, mettez à l’échelle le mélange maître PCR et le volume de granulés résultant en fonction du volume de l’échantillon. Le PTE permet l’émulsification de petits (10 μL) à grands (2 mL) volumes de particules de modélisation. Le mélange maître PCR (2.3) et l’huile (2.6) peuvent être mis à l’échelle en fonction du volume cible (2.3) et mesuré (2.4) de la pastille de particules respectivement.</li>
	<li>Ajouter 200 μL 2% de fluorosurfactant dans l’huile HFE au tube comme phase continue insoluble pour l’émulsification. Assurez-vous que la pastille est délogée en pipetant ou en tapotant/agitant le tube. Puis vortex à 3000 tr/min pendant 30 sec. REMARQUE: Le réglage correspondant à 3000 tr / min peut varier en fonction de la marque et du modèle.</li>
	<li>Laissez les émulsions se déposer pendant 1 min. Retirer 100 μL de la phase huileuse inférieure et remplacer ce volume par du fluorosurfactant frais à 2 % dans l’huile HFE. Inverser doucement le tube plusieurs fois pour mélanger. Répétez 3-5x ou jusqu’à ce que les petites gouttelettes satellites aient été enlevées.</li>
</ol>3. PCR et analyse numériques des gouttelettes.
<ol><li>Après 2-5 min de décantation, retirez la phase d’huile de fond. Remplacez ce volume par un fluorosurfactant à 5 % dans l’huile de fluorocarbone (p. ex. FC-40).</li>
	<li>À l’aide d’une pointe de pipette à large alésage, pipettez soigneusement les 100 μL d’échantillon dans des tubes PCR de 200 μL. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et faites fonctionner conformément au tableau 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Pas</td>
			<td>Température</td>
			<td>Durée</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Répétez les étapes x34 2 à 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>tenir</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Conditions de thermocyclage pour la PCR numérique par gouttelettes à l’aide d’émulsions PTE.
<ol start="3"><li>Pipettez l’échantillon sur une lame de comptage à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage pour l’imagerie fluorescente. Imagez l’échantillon à l’aide d’un microscope fluorescent avec une excitation de 490 nm et des longueurs d’onde de détection d’émission de 525 nm.</li>
	<li>Quantifier les gouttelettes fluorescentes positives (Np) et les gouttes totales (NT) pour vérifier la présence et calculer le nombre de molécules modèles (λ) en utilisant la fraction de gouttelettes positives (Np/NT) et les statistiques de Poisson : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>Calculez l’intervalle de confiance à 95 % (zc = 1,96) en : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>Calculer la concentration de l’échantillon (molécules/μL) en utilisant le volume (ν en μL) de l’échantillon ajouté à l’étape 2.5, en utilisant l’équation ci-dessous. Déterminer la moyenne et l’écart-type de la concentration de l’échantillon à l’aide de répétitions techniques. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

PTE utilise des particules pour encapsuler des échantillons dans des gouttelettes monodispersées par vortex. En plus de sa simplicité et de son accessibilité, PTE offre plusieurs avantages supplémentaires, notamment en permettant de générer instantanément de grands volumes de gouttelettes. De plus, le processus peut être effectué dans un tube isolé, ce qui évite d’avoir à transférer des échantillons vers des dispositifs microfluidiques, rationalise le flux de travail global et limite les possibilités de contamination ou de perte d’échantillons. Les particules de modélisation fournissent également un moyen de concevoir le contenu des réactions de gouttelettes résultantes. Par exemple, la taille, la chimie et la mouillabilité des particules peuvent être conçues pour la capture ciblée de biomolécules ou de cellules, tandis que des fractions fonctionnelles telles que des enzymes, des actifs ou des acides nucléiques peuvent être affichées sur des particules pour faciliter les réactions, telles que le séquençage d’une seule cellule ou la caractérisation fonctionnelle. Bien que l’approche soit flexible, son utilisation comporte néanmoins d’importantes contraintes. Par exemple, il n’est actuellement pas possible d’effectuer des ajouts de gouttelettes comme c’est souvent le cas avec la microfluidique, ce qui nécessite que tous les composants de la réaction soient introduits avant l’encapsulation; cela nécessite que les réactifs soient compatibles et stables jusqu’à ce que les gouttelettes puissent être générées et, dans le cas de combinaisons gênantes, peuvent souvent être traités en mélangeant et en émulsifiant rapidement l’échantillon sur de la glace. Alternativement, des composants réactifs qui peuvent être déclenchés à l’extérieur avec de la lumière ou de la chaleur peuvent être utilisés13. PTE fournit ainsi une méthode flexible et évolutive pour effectuer des tests de gouttelettes accessibles aux non-experts. Ceci, associé à sa simplicité et à sa flexibilité innées, rend PTE idéal pour l’exécution et le développement de nombreuses applications de gouttelettes.

La microfluidique des gouttelettes tire parti du compartimentage dans les gouttelettes de picolitre pour augmenter la sensibilité et la précision des essais par rapport aux réactions en vrac, et a de nombreuses applications dans le criblage chimique, l’ingénierie des protéines et le séquençage de nouvelle génération1,2,3. Par exemple, la réaction en chaîne par polymérase par gouttelettes numériques (ddPCR) offre une précision accrue par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative en vrac (qPCR), avec des applications pour la variation génétique des cancers, la détection des mutations causant des maladies et le diagnostic prénatal4,5,6. Un défi de la microfluidique des gouttelettes, cependant, est l’exigence de dispositifs microfluidiques pour partitionner les échantillons; Bien que la microfluidique offre un excellent contrôle sur les propriétés des gouttelettes, elle nécessite une expertise spécialisée pour construire et exploiter7,8. Par conséquent, les méthodes à base de gouttelettes sont largement limitées aux laboratoires d’experts ou, dans de rares cas, aux applications dans lesquelles un instrument commercial est disponible9,10. Pour élargir l’utilisation des essais de gouttelettes, la nécessité d’instruments microfluidiques spécialisés est un obstacle qui doit être surmonté.
Dans cet article, nous décrivons l’émulsification par gabarit de particules (PTE), une méthode sans microfluidique pour effectuer des réactions dans des gouttelettes monodispersées. Dans le PTE, les particules de modélisation engloutissent l’échantillon en gouttelettes dans l’huile porteuse par simple vortex (Figure 1). Au fur et à mesure que le système se mélange, la partie aqueuse se fragmente en gouttelettes de taille réductrice jusqu’à ce que les gouttelettes contiennent des particules uniques, auquel cas une fragmentation supplémentaire n’est pas possible car elle nécessite de casser les particules. L’échantillon englouti entoure les particules comme une coquille dans les gouttelettes, encapsulant ainsi toutes les cellules dispersées, les réactifs ou les fractions fonctionnelles (Figure 1D). Ainsi, PTE ne nécessite aucun équipement ou expertise pour effectuer des réactions de gouttelettes au-delà d’un vortexeur commun. De plus, la génération de gouttelettes prend quelques secondes par rapport aux minutes ou aux heures avec la microfluidique, et la quantité produite est proportionnelle au volume du conteneur, et non au temps de fonctionnement de l’appareil, ce qui la rend extrêmement évolutive. Ces avantages rendent le PTE idéal pour effectuer des tests de gouttelettes dans diverses circonstances dans lesquelles la microfluidique n’est pas pratique. Ici, nous démontrons le PTE et l’utilisons pour effectuer la ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Graphique 1. Vue d’ensemble du processus d’émulsification par modèle de particules. (A) Les particules de modélisation sont mélangées à des réactifs. (B) Les réactifs excédentaires sont éliminés après centrifugation. (C) L’ajout de molécules modèles se produit avant l’ajout d’huile. (D) Le vortex produit des gouttelettes contenant une seule molécule modèle. (E) Le thermocyclage et l’imagerie ultérieurs permettent l’analyse numérique des gouttelettes du gabarit cible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

Les réactions effectuées dans des gouttelettes monodispersées offrent une précision et une sensibilité accrues par rapport à des réactions équivalentes effectuées en vrac. Cependant, l’exigence de la microfluidique pour former des gouttelettes contrôlées impose une barrière aux non-experts, limitant leur utilisation. Ici, nous décrivons l’émulsification par gabarit de particules, une approche pour générer des gouttelettes monodispersées sans microfluidique. À l’aide de sphères d’hydrogel à modélisation, nous encapsulons des échantillons dans des gouttelettes monodispersées par simple vortex. Nous démontrons l’approche en l’utilisant pour effectuer une PCR numérique sans microfluidique.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Graphique 2. Encapsulation de l’échantillon en gouttelettes à l’aide d’une émulsification à gabarit de particules. (A) les particules de modélisation utilisées pour l’émulsification de modélisation de particules. B) Séparation de la pastille de particules de modélisation du surnageant après centrifugation. (C) Gouttelettes résultant d’une émulsification par gabarit de particules avec (D) coquille aqueuse identifiable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
En PTE, la monodispersion des émulsions est dictée par celle des particules templatantes, car les gouttelettes ont un diamètre légèrement plus grand que les particules. Ainsi, les particules uniformes sont au cœur de l’encapsulation PTE contrôlée11. Il existe diverses méthodes pour générer des particules de modélisation uniformes, notamment chimiques (sol-gel, polymérisation en émulsion), hydrodynamiques (émulsification membranaire, homogénéisation) et de filtration. Les approches microfluidiques, en particulier, offrent une superbe monodispersité (Figure 2A) et permettent une ingénierie des particules supplémentaire pour améliorer leur fonctionnalité dans PTE12. Alternativement, des particules de modélisation peuvent être achetées, bien que leur uniformité, bien qu’adéquate, soit généralement inférieure à celle de la génération microfluidique11.
Pour effectuer la PTE, les particules sont mélangées à l’échantillon à encapsuler (Figure 1A), et l’excès de surnageant est éliminé par centrifugation et pipetage (Figure 1B), comme l’illustre une photographie d’une pastille de particules au fond d’un tube PCR (Figure 2B). L’huile d’encapsulation contenant un tensioactif stabilisant est ensuite ajoutée (Figure 1C), et l’échantillon doucement pipeté avant le vortex pendant 30 secondes (Figure 1D), pour générer l’émulsion (Figure 2C). Les gouttelettes résultantes contiennent un noyau de particules et une coquille aqueuse comprenant l’échantillon initial, dans lequel résident les réactifs, les molécules cibles et les cellules nécessaires à la réaction (Figure 2D). Tout comme dans l’encapsulation microfluidique des gouttelettes, des entités discrètes comme de petites billes ou des cellules sont encapsulées de manière aléatoire et conformément à une distribution de Poisson, bien que presque toutes les gouttelettes contiennent une particule de modélisation en raison de la nature de la physique PTE.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Graphique 3. Identification et nettoyage des gouttelettes d’émulsification modélisées par des particules. (A) Exemple de génération de gouttelettes non uniformes avec plusieurs particules par gouttelette provenant d’un vortex insuffisant. (B) Présence attendue de satellites et de gouttelettes à la suite d’une émulsification par gabarit de particules et (C) du fractionnement de l’eau dans l’huile. (D) Émulsion résultante après lavage à l’huile. (E) Génération excessive de satellites résultant d’un surnageant résiduel au cours de l’émulsification par gabarit de particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Même dans les PTE réussis, il existe des gouttelettes à double ou triple cœur, bien qu’elles contribuent généralement de manière négligeable à la réaction, à condition qu’elles soient rares. Atteindre une faible fréquence de gouttelettes multicœurs tout en conservant des coques adéquates nécessite une optimisation des paramètres du processus, y compris la tension superficielle, les forces d’adhérence interparticulaires, la viscosité de l’échantillon, la taille du récipient et la puissance et le temps de vortex. Par exemple, une émulsification mal optimisée peut contenir des gouttelettes polydispersées avec de nombreuses particules de modélisation (Figure 3A), ce qui indique que le vortex était insuffisant pour émulsionner complètement l’échantillon. Dans de tels cas, des détergents peuvent être ajoutés pour réduire l’adhérence entre les particules et abaisser la tension superficielle, ou la puissance ou le temps de vortex peut être augmenté. Un autre problème courant est la génération de satellites excessifs, qui sont de petites gouttelettes vides (Figure 3B). Les satellites peuvent être inévitables dans les émulsions PTE en fonction de la tension interfaciale et des propriétés rhéologiques de l’échantillon et de l’huile porteuse. Cependant, ils résultent souvent d’un retrait inadéquat de l’échantillon excédentaire avant l’émulsification (figure 2B) ou d’un vortex avec trop de puissance, dépouillant les coquilles des gouttelettes. Dans une émulsification PTE réussie, les satellites ne doivent pas représenter plus d’environ 10 % du volume total de l’échantillon encapsulé (Figure 3C)11. À ce niveau, ils contribuent généralement de manière négligeable à la réaction et peuvent être ignorés. À des fins esthétiques, ils peuvent être éliminés de l’émulsion en les lavant à l’huile fraîche (Figure 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Graphique 4. Évaluation de la PCR numérique des gouttelettes d’émulsification modélisée par modèle de particules. (A) L’imagerie fluorescente des gouttelettes identifie les gouttelettes fluorescentes positives et les gouttelettes non fluorescentes négatives. (B) Identification de gabarits rares ou de faibles concentrations de gabarits à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. (C) Encapsulation de gabarit surabondante entraînant un nombre variable de molécules de gabarit par gouttelette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour démontrer l’utilité du PTE, nous l’avons utilisé pour effectuer une PCR11 numérique sans microfluidique. En utilisant le procédé, nous avons encapsulé un échantillon comprenant de l’ADN génomique de S. cerevisiae et l’avons thermocyclé. En PCR numérique, les gouttelettes contenant des cibles amplifiées deviennent fluorescentes, tandis que celles qui n’en contiennent pas restent faibles. Ainsi, une gouttelette fluorescente indique une cible, permettant une quantification directe des cibles en comptant les gouttelettes positives (Figure 4A). Le nombre de gouttelettes fluorescentes s’échelonne donc avec les molécules cibles, donnant peu de positifs lorsque la cible est rare (Figure 4B) et beaucoup lorsqu’elle est abondante (Figure 4C). Comme pour l’encapsulation d’autres composants discrets, l’encapsulation cible suit une distribution de Poisson, ce qui permet de transformer la fraction de gouttelettes positives en concentration cible (figure 4D), démontrant ainsi la capacité d’effectuer une PCR numérique avec PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Graphique 5. Démonstration de la PCR numérique par gouttelettes à l’aide de PAA disponible dans le commerce. (A) L’imagerie fluorescente des gouttelettes identifie les gouttelettes non fluorescentes négatives. (B) Identification de faibles concentrations de gabarit avec pcR numérique par gouttelettes. (C) Identification de fortes concentrations de gabarit à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ces résultats sont reproductibles à l’aide de particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce (Figure 5) et démontrent la capacité de PTE à effectuer une PCR numérique standard avec des particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce, obtenant des mesures précises sur la même plage.
Fichier supplémentaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Les tests de gouttelettes eau-dans-huile sont utiles pour la chimie analytique, l’évolution enzymatique et l’analyse unicellulaire, mais nécessitent généralement une microfluidique pour former les gouttelettes. Ici, nous décrivons l’émulsification à gabarit de particules, une approche sans microfluidique pour effectuer des tests de gouttelettes.

L’émulsification par gabarit de particules permet des tests de gouttelettes sans microfluidique

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

La PCR numérique par gouttelettes offre une précision et une sensibilité accrues par rapport à la PCR quantitative. Il s’agit d’une méthode simple pour la PCR numérique par gouttelettes nécessitant un équipement minimal et aucune expertise. L’émulsification à modèle de particules est une méthode d’émulsification sans microfluidique qui ne nécessite aucun équipement spécialisé.En outre, l’émulsification se produit sur une période de quelques secondes et s’adapte au volume du conteneur. Pour les billes commerciales, ajoutez 0,5 gramme de particules de polyacrylamide séchées compatibles avec l’émulsification de gabarit de particules, ou PTE, à 30 millilitres d’eau stérile dans un tube conique de 50 millilitres et mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Pour la fabrication microfluidique de billes, versez un millilitre de résine photosensible sur le centre d’une plaquette de silicium de trois pouces, puis faites-la tourner à 500 tr / min pendant 30 secondes, suivie de 1250 tr / min pendant 30 secondes. Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes pour évaporer le solvant. Fixez le photomasque sur la plaquette de silicium à l’aide d’une lame de verre de couverture et exposez la plaquette sous une LED UV collimée pendant 2,5 minutes.Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour la cuisson post-exposition. Développez la plaquette de silicium photorésistante en l’immergeant dans un bain de 100% PGMEA pendant 15 minutes. Rincer la plaquette avec du 100% PGMEA frais, suivi de 100% d’isopropanol.Séchez la plaquette à l’air libre, puis séchez-la sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant une minute et placez-la dans une boîte de Petri propre de trois pouces. Mélangez la base de silicium PDMS et le réactif de durcissement dans un rapport de 10:1, puis dégaz le PDMS mélangé à l’aide d’un dessiccateur sous vide jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit observable. Versez le PDMS dégazé dans la boîte de Pétri, en veillant à ce que la plaquette de silicium soit complètement immergée.Dégazez la plaquette de silicium et le PDMS, puis durcissez le PDMS en plaçant la plaquette de silicium dans un four réglé à 65 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes. Exciser un bloc de PDMS contenant les caractéristiques microfluidiques de la boîte de Pétri, à l’aide d’un scalpel. Poinçonnez les entrées et les sorties dans le bloc PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 millimètre.Ensuite, enlevez la poussière et les particules avec l’application répétitive et le retrait du ruban d’emballage sur la surface du bloc. Nettoyez une lame de verre en la rinçant avec 100% d’isopropanol, puis en séchant la surface à l’air. Plasma traiter à la fois la lame de verre et le PDMS avec un millibar de plasma d’oxygène pendant une minute, à l’aide d’un liant plasma.Fixez le PDMS sur la lame de verre en plaçant le PDMS traité au plasma avec des caractéristiques orientées vers le bas sur la lame de verre, côté traité au plasma vers le haut. Placez la glissière dans un four réglé à 65 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes, pour terminer le collage. Traiter tous les canaux microfluidiques avec un traitement de surface fluoré pour assurer l’hydrophobicité de surface, puis cuire l’appareil à 65 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.Chargez à la fois du polyacrylamide, ou PAA, et de l’hydrofluoroéther, ou HFE, des seringues contenant des solutions dans des pompes à seringues. Connectez les deux seringues au dispositif microfluidique à l’aide d’un tube en polyéthylène. Faites fonctionner le dispositif de génération de gouttes et collectez un millilitre des gouttelettes dans un tube de collecte de 15 millilitres, puis incubez pendant trois heures à température ambiante pour la polymérisation.Après l’incubation, retirez la couche inférieure d’huile par pipetage. Ajouter un millilitre de 20% de PFO dans de l’huile HFE au tube de collecte de 15 millilitres comme désémulsifiant chimique. Après le mélange, faire tourner le tube de collecte de 15 millilitres à 2000 x g, pendant deux minutes.Retirez la couche inférieure par pipetage et répétez le processus une fois de plus. Ajouter deux millilitres de monooléate de sorbitan à 2 % dans l’hexane au tube de collecte de 15 millilitres et le vortexer. Faire tourner le tube à 3000 x g pendant trois minutes et retirer le surnageant par pipetage pour éliminer la solution tensioactive.Répétez cette opération deux fois. Ajouter cinq millilitres de tampon TEBST et bien mélanger, puis tourner à 3000 x g pendant trois minutes et retirer le surnageant par pipetage. Répétez cette opération trois fois, puis remettez en suspension cinq millilitres de TEBST.Préparer les particules de polyacrylamide pour l’émulsification par gabarit de particules en centrifugant à 6000 x g pendant une minute pour granuler les particules. Ensuite, retirez le surnageant par pipetage et remettez la pastille dans de l’eau stérile. Répétez trois fois pour vous assurer de l’élimination de tout TEBST résiduel.Préparer la phase dispersée dans un tube de centrifugeuse frais de 15 millilitres, à l’aide d’un mélange maître PCR, des amorces appropriées et d’une sonde d’hydrolyse de la fluorescéine, comme décrit dans le manuscrit du texte. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes sous une agitation douce, à l’aide d’un rotateur tubulaire. Centrifuger la phase dispersée à 6000 x g pendant une minute et retirer le surnageant.Ajouter un microlitre d’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae à la pastille et bien mélanger par pipetage ou tapotement vigoureux. Ajouter 200 microlitres de fluorosurfactant à 2% dans l’huile HFE au tube, pour l’émulsification. Délogez la pastille en pipetant ou en tapotant le tube, puis vortexez à 3000 tr / min pendant 30 secondes.Laissez les émulsions se déposer pendant une minute, puis retirez 100 microlitres de la phase huileuse inférieure et remplacez ce volume par du fluorosurfactant frais à 2% dans de l’huile HFE. Inverser doucement le tube plusieurs fois pour mélanger. Répétez cette opération trois fois ou plus, jusqu’à ce que les petites gouttelettes satellites soient enlevées.Après deux à cinq minutes de décantation, retirez la phase d’huile inférieure. Remplacez ce volume par un fluorosurfactant à 5% dans l’huile de fluorocarbone. Pipette 100 microlitres d’échantillon dans des tubes PCR de 200 microlitres et placez les tubes PCR dans un thermocycleur.Pipettez l’échantillon sur une lame de comptage pour l’imagerie fluorescente et imagez l’échantillon. L’émulsification à gabarit de particules offre une superbe monodispersité. Au fur et à mesure que l’excès de surnageant est éliminé, un tensioactif stabilisateur est ajouté et l’échantillon est vortexé pour générer l’émulsion.Les gouttelettes résultantes sont constituées d’un noyau de particules et d’un échantillon aqueux contenant des réactifs et des molécules ou cellules d’échantillon nécessaires à la réaction. Les gouttelettes polydispersées avec des particules de modélisation indiquent un vortex insuffisant. Un autre problème est la génération de satellites excessifs, qui réduisent l’efficacité de l’encapsulation.Les satellites ne doivent pas représenter plus de 10 % du volume total de l’échantillon encapsulé. Ils peuvent être éliminés de l’émulsion en les lavant avec de l’huile fraîche. L’utilité de la PTE peut être démontrée dans la PCR numérique lorsque des gouttelettes contenant des cibles amplifiées deviennent fluorescentes, ce qui permet une quantification directe des cibles.Les gouttelettes fluorescentes donnent peu de points positifs lorsque la cible est rare, et beaucoup lorsqu’elle est abondante. Ces résultats sont reproductibles en utilisant des particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce, permettant d’obtenir des mesures précises sur la même plage. L’élimination du surnageant de la phase de dispersion est importante pour l’encapsulation de l’échantillon.Connaître le volume de la pastille et du surnageant peut aider à identifier l’interface entre les deux. En cas de doute, errez du côté de l’élimination du surnageant.

Research

JoVE Journal

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