Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
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Este trabalho de desenvolvimento desse protocolo contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EB019453-02), do Escritório do Diretor de Inteligência Nacional, Atividade de projetos de pesquisa avançada em Inteligência através da Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), o Programa de Investigação de Biohub Chan-Zuckerberg, Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa através da Texas A&M University (W911NF1920013) e Centros de Controle e Prevenção de Doenças através da Universidade Johns Hopkins Aplicada Laboratório de Física (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). As opiniões e conclusões aqui contidas são dos autores e não devem ser interpretadas como necessariamente representando as políticas oficiais, expressas ou implícitos, das organizações acima ou do Governo dos EUA. O governo dos EUA está autorizado a reproduzir e distribuir reimpressões para fins governamentais, apesar de qualquer anotação de direitos autorais.

1. Preparação de partículas de hidrogel para emulsificação de modelos de partículas.
Partículas de hidrogel usadas para emulsificação de modelos de partículas podem ser preparadas usando dois métodos diferentes.
<ol><li>Preparação usando partículas disponíveis comercialmente
	<ol>
<li>Adicione 0,5 g de partículas secas de poliacrilamida compatíveis com PTE (por exemplo, Gel Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm de diâmetro) a 30 mL de água estéril em um tubo cônico de 50 mL e misture bem. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação utilizando fabricação microfluidica de partículas NOTA: As partículas de poliacrilamida compatíveis com o PTE podem ser preparadas usando fabricantes de gotas disponíveis comercialmente (por exemplo, Gerador de Gota QX200 (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) etc.), ou por design microfluido personalizado.<ol><li>Fabricação de mestre personalizado
		<ol>
<li>Projete uma máscara de fotolitografia macia usando o software CAD (Computer-Aided Design, design aided design" de computador. Imprima a máscara fotográfica com uma resolução de 10 μm no filme de placa de circuito.</li>
			<li>Despeje 1 mL de fotoresist no centro de uma bolacha de 3 em silício. Use um revestr de spin para criar uma camada de 50 μm de fotoresist girando-a a 500 rpm por 30 segundos, seguida por 1250 rpm por 30 segundos. Coloque o wafer sobre uma placa de aquecimento definida para 95 °C por 15 minutos para evaporar o solvente.</li>
			<li>Fixar a máscara fotográfica no wafer de silício com um escorregador de vidro de cobertura e expor o wafer sob um LED UV de 190 mW, 365 μm por 2,5 min. Coloque o wafer em uma placa de aquecimento definida para 95 °C para 5 min para assar após a exposição.</li>
			<li>Desenvolva o wafer fotoresist-silicon imergindo-o em um banho de acetato de éter monometo de glitil glitil 100% propileno (PGMEA) por até 15 minutos. Enxágüe o wafer com novo 100% PGMEA seguido de isopropanol 100%. A seco o wafer.</li>
			<li>Remova qualquer isopropanol residual secando o wafer em uma placa de aquecimento definida para 95 °C por 1 min. Coloque o wafer em um 3 limpo na placa de Petri.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricação do dispositivo microfluido personalizado
		<ol>
<li>Misture a base de silicone de polidimtilsiloxano (PDMS) e o reagente de cura em uma proporção de 10:1 por massa. Degas o PDMS misto usando um desiccador sob vácuo da casa até que nenhuma bolha de ar seja observável.</li>
			<li>Despeje o PDMS desgaseado sobre o mestre na placa de petri, garantindo que o wafer de silício esteja completamente submerso. Desgas o wafer de silício e PDMS para remover quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado durante o derramamento.</li>
			<li>Cure o PDMS colocando o wafer de silício e pdms em um forno definido a 65 °C por pelo menos 60 min. Extite um bloco de PDMS contendo as características microfluidas da placa de petri usando um bisturi. Tome cuidado extra para evitar danificar quaisquer características presentes no mestre de silício.</li>
			<li>Digite as entradas e as tomadas no bloco PDMS correspondente às entradas e tomadas do dispositivo microfluido usando um soco de biópsia de 0,75 mm. Remova qualquer poeira e partículas com a aplicação repetitiva e remoção da fita de embalagem para a superfície do bloco PDMS.</li>
			<li>Limpe uma lâmina de vidro de 50 mm x 75 mm enxaguando-a com isopropanol 100% e, posteriormente, ar secando a superfície. O plasma trata tanto o slide de vidro quanto o PDMS (características voltadas para cima) usando 1 mbar de plasma O2 por 1 min usando um fiador de plasma.</li>
			<li>Afixe o PDMS na lâmina de vidro colocando o PDMS tratado de plasma com características voltadas para baixo sobre o slide de vidro, lado tratado de plasma voltado para cima. Coloque o slide em um forno definido a 65 °C por pelo menos 30 minutos para completar a ligação.</li>
			<li>Trate todos os canais microfluidos com um tratamento de superfície fluorada para garantir a hidrofobitude superficial e evitar a motação. Asse o dispositivo a 65 °C por pelo menos 10 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricação de partículas templating
		<ol>
<li>Prepare uma solução de poliacrilamida (PAA) composta por 6,2% de acrilamida, 0,18% N,N'-metilenobis (acrilamida) e 0,3% persulfito de amônio. Carregue esta solução em uma seringa de 1 mL com uma agulha 28G.</li>
			<li>Prepare uma fase contínua insolúvel composta por 5% (w/w) fluorosurfactante e 1% N,N,NN-tetrametilenediamina (TEMED) em óleo de hidrofluoroether (HFE) para geração e estabilização de gotículas. Carregue a solução em nova seringa de 1 mL.</li>
			<li>Carregue tanto a solução PAA quanto a HFE contendo seringas em bombas de seringa (por exemplo, NE-501). Conecte ambas as seringas ao dispositivo microfluido usando tubos de polietileno inseridos na seringa e no dispositivo. Antes da conexão, prime as bombas para remover o ar da tubulação. NOTA: Dependendo do modelo, as bombas de seringa podem ser controladas com entrada incorporada, software de fabricação ou um script personalizado (disponível em https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>Execute o dispositivo de geração de gota com entradas de óleo PAA e HFE a 300 μL/h e 500 μL/h, respectivamente. Colete 1 mL das gotículas em um tubo de coleta de 15 mL e incubar por 3 h a temperatura ambiente para polimerização. Após a incubação, remova a camada inferior do óleo por tubulação.</li>
			<li>Adicione 1 mL de 20% (v/v) perfluoro-1-octanol (PFO) em óleo HFE ao tubo de coleta de 15 mL como um demulsificador químico. Após a mistura, gire o tubo de coleta de 15 mL a 2000 x g por 2 min. Remova o supernatante PFO/HFE por pipetação. Repita 1x.</li>
			<li>Adicione 2 mL de monooleato sorbitano de 2% em hexano ao tubo de coleta de 15 mL e vórtice para misturar. Gire o tubo a 3000 x g por 3 min. Remova o supernatante por pipetação para remover a solução surfactante/hexatano. Repita 2x.</li>
			<li>Adicione 5 mL de tampão TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) e misture bem. Gire a 3.000 x g por 3 min. Remova o supernatante por pipetação. Repita 3x.</li>
			<li>Resuspend em 5 mL TEBST. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C indefinidamente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Emulsificação modelada por partículas.
Após a preparação de partículas templating, PTE é usado para encapsular a amostra e reagentes em gotículas.
<ol><li>Prepare as partículas de poliacrilamida para emulsificação de partículas modelada por centrifugação a 6000 x g por 1 min para peloear as partículas, em seguida, remova o sobrenante por pipetação e resuspend usando água estéril. Repita 3x para garantir a remoção de qualquer TEBST residual.</li>
	<li>Determine a concentração e o diâmetro das partículas templating usando um hemótmetro (ou equivalente). Calcule o diâmetro de partículas individuais medindo os diâmetros em pixels e convertendo-se em mícrons. A conversão de pixels em mícrons pode ser calculada usando o hemótmetro (ou equivalente) como um slide de calibração e medindo a distância conhecida da grade em pixels.</li>
	<li>Prepare a fase de dispersão em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL fresco usando uma mistura mestre pcr, os primers apropriados e uma sonda de hidrolise fluoresceína de acordo com a Tabela 1. Incubar à temperatura ambiente por 5 min sob agitação suave (10 rpm) usando um rotador de tubo para garantir a distribuição homogênea dos componentes. NOTA: O volume e a concentração de destino das partículas baseiam-se no carregamento de Poisson. Como regra geral, o número de partículas deve ser uma ordem de magnitude maior do que o número de amostras a serem encapsuladas. Para amostras de concentrações desconhecidas, uma série de diluição é necessária para garantir o carregamento de Poisson.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volume</td>
			<td>Reagente</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μL</td>
			<td>Partículas (450 partículas / μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μL</td>
			<td>2x mix mestre PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Primer para frente de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Primer reverso de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Sonda de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 μL</td>
			<td>Tritão X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45,2 μL</td>
			<td>Água livre de nuclease</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Preparação do mix mestre pcr usado com PTE para PCR droplet digital.
<ol start="4"><li>Centrifugar a fase de dispersão a 6000 x g por 1 min e remover o supernante. Registo o volume do supernacido extraído e utilizando o volume total de fase de dispersão calculado em 2,3 determinar o volume de pelotas. NOTA: A quantidade de supernascido extraído variará dependendo da embalagem de partículas, diâmetro e concentração com um volume mínimo esperado de 300 μL.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae DNA genômico à pelota de 2,4 e misture completamente por pipetação ou toques vigorosos. NOTA: A presença de excesso de conteúdo aquoso pode diminuir a eficiência do encapsulamento. Se o volume amostral exceder 1% do volume de pelotas, concentre a amostra. Se a amostra não puder ser concentrada, dimensione a mistura mestre do PCR e o volume de pelotas resultante de acordo com o volume da amostra. O PTE permite a emulsificação de pequenos (10 μL) a grandes (2 mL) de partículas templating. O mix mestre pcr (2.3) e o óleo (2.6) podem ser dimensionados de acordo com o volume alvo (2.3) e medido (2,4) da pelota de partículas, respectivamente.</li>
	<li>Adicione 200 μL 2% fluorosurfactante no óleo HFE ao tubo como a fase contínua insolúvel para emulsificação. Certifique-se de que a pelota está desalojada por pipetar ou tocar/apertar o tubo. Em seguida, vórtice a 3000 rpm por 30 segundos. NOTA: A configuração correspondente a 3000 rpm pode variar dependendo da marca e do modelo.</li>
	<li>Permita que as emulsões se contentem com 1 min. Remova 100 μL da fase inferior do óleo e substitua este volume por fluorosurfactante fresco de 2% no óleo HFE. Inverta suavemente o tubo várias vezes para misturar. Repita 3-5x ou até que pequenas gotículas de satélite tenham sido removidas.</li>
</ol>3. PCR e análise de gotícula digital.
<ol><li>Após 2-5 minutos de assentamento, remova a fase inferior do óleo. Substitua este volume por 5% fluorosurfactante em óleo fluorocarbono (por exemplo, FC-40).</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta larga, pipeta cuidadosamente os 100 μL de amostra em tubos PCR de 200 μL. Coloque os tubos PCR em um termociclador e execute de acordo com a Tabela 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Duração</td>
			<td>Anotações</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Repita x34 passos 2 a 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>segurar</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 2. Condições de termociclismo para PCR de gotícula digital usando emulsões PTE.
<ol start="3"><li>Pipeta a amostra em um slide de contagem usando uma ponta de pipeta larga para imagem fluorescente. Imagem da amostra usando um microscópio fluorescente com excitação de 490 nm e comprimentos de onda de detecção de emissões de 525 nm.</li>
	<li>Quantifique as gotículas fluorescentes positivas (Np) e as gotas totais (NT) para verificar a presença e calcular o número de moléculas de modelo (λ) usando a fração de gotículas positivas (Np/NT) e estatísticas de Poisson: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>Calcule o intervalo de confiança de 95% (zc = 1,96) por: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>Calcule a concentração amostral (moléculas/μL) utilizando o volume (ν in μL) da amostra adicionada na etapa 2.5, utilizando a equação dada abaixo. Determine o desvio médio e padrão da concentração amostral utilizando réplicas técnicas. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Pte usa partículas para encapsular amostras em gotículas monodispersed por vórtice. Além de sua simplicidade e acessibilidade, o PTE oferece vários benefícios adicionais, incluindo permitir que grandes volumes de gotículas sejam gerados instantaneamente. Além disso, o processo pode ser conduzido em um tubo isolado, evitando a necessidade de transferência de amostras para dispositivos microfluidos, agilizando o fluxo de trabalho global e limitando oportunidades de contaminação ou perda de amostras. As partículas templating também fornecem um meio pelo qual projetar o conteúdo das reações de gotículas resultantes. Por exemplo, o tamanho das partículas, a química e a umidade podem ser projetados para biomolécula ou captura celular direcionada, enquanto moieties funcionais, como enzimas, ativos ou ácidos nucleicos, podem ser exibidos em partículas para facilitar reações, como para sequenciamento de células únicas ou caracterização funcional. Embora a abordagem seja flexível, há, no entanto, restrições importantes ao seu uso. Por exemplo, atualmente não é possível realizar adições de gotículas como são frequentemente conduzidas com microfluidos, exigindo que todos os componentes de reação sejam introduzidos antes do encapsulamento; isso requer que os reagentes sejam compatíveis e estáveis até que as gotículas possam ser geradas e, no caso de combinações problemáticas, muitas vezes podem ser tratadas misturando e emulsificando rapidamente a amostra no gelo. Alternativamente, podem ser utilizados componentes reativos que podem ser acionados externamente com luz ou calor13. Assim, o PTE fornece um método flexível e escalável para a realização de ensaios de gotículas acessíveis a não especialistas. Isso, aliado à sua simplicidade inata e flexibilidade, torna o PTE ideal para a execução e desenvolvimento de inúmeras aplicações de gotículas.

Microfluidos de gotículas aproveitam a compartimentação em gotículas picoliter para aumentar a sensibilidade e a precisão dos ensaios em comparação com reações a granel, e têm inúmeras aplicações em triagem química, engenharia de proteínas e sequenciamento de próxima geração1,2,3. Por exemplo, a reação em cadeia de polimerase de gotícula digital (ddPCR) proporciona maior precisão em comparação com a reação em cadeia de polimerase quantitativa em massa (qPCR), com aplicações para variação genética em cânceres, detecção de doenças causadoras de mutações e diagnóstico pré-natal4,5,6. Um desafio dos microfluidos gotículas, no entanto, é a exigência de dispositivos microfluidos para amostras de partição; enquanto os microfluidos oferecem um excelente controle sobre propriedades de gotículas, eles exigem expertise especializada para construir e operar 7,8. Consequentemente, os métodos baseados em gotículas são em grande parte limitados a laboratórios especializados ou, em raros casos, aplicações em que um instrumento comercial está disponível9,10. Para ampliar o uso de ensaios de gotículas, a exigência de instrumentação microfluida especializada é um obstáculo que deve ser superado.
Neste artigo, descrevemos a Emulsificação de Modelo de Partículas (PTE), um método livre de microfluidic para realizar reações em gotículas monodispersadas. Em PTE, partículas templating engolfam a amostra em gotículas em óleo transportador por vórtice simples (Figura 1). À medida que o sistema se mistura, a porção aquosa se fragmenta em gotículas de tamanho redutor até que as gotículas contenham partículas únicas, momento em que a fragmentação adicional não é possível porque requer a quebra das partículas. A amostra engolfada envolve as partículas como uma concha nas gotículas, encapsulando assim quaisquer células dispersas, reagentes ou moieties funcionais (Figura 1D). Assim, o PTE não requer nenhum equipamento ou perícia para realizar reações de gotículas além de um vórtice comum. Além disso, a geração de gotículas leva segundos em comparação com minutos ou horas com microfluidos, e a quantidade produzida é proporcional ao volume do recipiente, não ao tempo de operação do dispositivo, tornando-o extremamente escalável. Esses benefícios tornam o PTE ideal para a realização de ensaios de gotículas em uma variedade de circunstâncias em que os microfluidos são impraticáveis. Aqui, demonstramos PTE e usamos para realizar ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Figura 1. Visão geral do processo de emulsificação de modelos de partículas. (A) Partículas templating são misturadas com reagentes. (B) Os reagentes em excesso são removidos após a centrifugação. (C) A adição de moléculas de modelo ocorre antes da adição de óleo. (D) O vortexing produz gotículas contendo uma única molécula de modelo. (E) A termociclismo e a imagem subsequentes permitem a análise digital de gotículas do modelo de destino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

As reações realizadas em gotículas monodispersadas proporcionam maior precisão e sensibilidade em comparação com as equivalentes realizadas em massa. No entanto, a exigência de microfluidics para formar gotículas controladas impõe uma barreira aos não especialistas, limitando seu uso. Aqui, descrevemos a emulsificação de modelos de partículas, uma abordagem para gerar gotículas monodispersas sem microfluidos. Usando esferas de hidrogel templating, encapsulamos amostras em gotículas monodispersadas por vórtice simples. Demonstramos a abordagem usando-a para executar PCR digital sem microfluidic.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Figura 2. Encapsulamento da amostra em gotículas usando emulsificação de modelo de partículas. (A) partículas templating utilizadas para emulsificação de templatização de partículas. (B) Separação da pellet de partículas templating de supernasce após centrifugação. (C) Gotículas resultantes da emulsificação de molde de partículas com (D) concha aquosa identificável. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
No PTE, a monodispersidade das emulsões é ditada pela das partículas templating, porque as gotículas têm um diâmetro ligeiramente maior que as partículas. Assim, partículas uniformes são centrais para encapsulamento PTE controlado11. Existem diversos métodos para a geração de partículas templating uniformes, incluindo métodos químicos (sol-gel, polimerização emulsion), hidrodinâmico (emulsificação de membrana, homogeneização) e filtragem. Abordagens microfluídicas, em particular, oferecem monodispersidade soberba (Figura 2A) e permitem que a engenharia adicional de partículas melhore sua funcionalidade no PTE12. Alternativamente, partículas templating podem ser adquiridas, embora sua uniformidade, embora adequada, seja tipicamente menor do que com geração microfluida11.
Para realizar PTE, as partículas são misturadas com a amostra a ser encapsulada (Figura 1A), e o excesso de supernante é removido por centrifugação e pipetação (Figura 1B), como ilustrado por uma fotografia de uma pelota de partículas na parte inferior de um tubo PCR (Figura 2B). O óleo encapsulante contendo um surfactante estabilizador é então adicionado (Figura 1C), e a amostra suavemente pipetada antes do vórtice por 30 segundos (Figura 1D), para gerar a emulsão (Figura 2C). As gotículas resultantes contêm um núcleo de partículas e uma concha aquosa que compreende a amostra inicial, dentro da qual residem os reagentes, moléculas-alvo e células necessárias para a reação (Figura 2D). Assim como no encapsulamento microfluido gotícula, entidades discretas como pequenas contas ou células são encapsuladas aleatoriamente e de acordo com uma distribuição de Poisson, embora quase todas as gotículas contenham uma partícula templating devido à natureza da física pte.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Figura 3. Identificação e limpeza de gotículas de emulsificação modelada de partículas. (A) Exemplo de geração de gotículas não uniformes com múltiplas partículas por gotícula de vórtice insuficiente. (B) Presença esperada de satélites e gotículas após emulsificação de partículas modelada e (C) o fracionamento água-em-óleo. (D) Emulsão resultante após a lavagem do óleo. (E) Geração excessiva de satélites resultantes de sobrenaspeito residual durante a emulsificação de modelos de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Mesmo em PTE bem sucedido, existem gotículas de núcleo duplo ou triplo, embora geralmente contribuam de forma negligente para a reação, desde que sejam raras. Alcançar uma baixa frequência de gotículas multicoras, mantendo conchas adequadas, requer otimização dos parâmetros de processo, incluindo tensão superficial, forças de adesão inter-partículas, viscosidade amostral, tamanho do contêiner e poder e tempo de vórtice. Por exemplo, uma emulsificação mal otimizada pode conter gotículas polidispersed com muitas partículas templating (Figura 3A), indicando que o vórtice foi insuficiente para emulsionar totalmente a amostra. Nesses casos, detergentes podem ser adicionados para reduzir a adesão inter-partícula e menor tensão superficial, ou poder de vórtice ou tempo pode ser aumentado. Outra questão comum é a geração de satélites excessivos, que são pequenas gotículas vazias (Figura 3B). Satélites podem ser inevitáveis em emulsões de PTE, dependendo da tensão interfacial e propriedades reológicas da amostra e do óleo transportador. No entanto, muitas vezes resultam de não remover adequadamente o excesso de amostra antes da emulsificação (Figura 2B), ou vórtices com muita potência, retirando as conchas das gotículas. Em uma emulsificação pte bem sucedida, os satélites não devem incluir mais de ~10% do volume total de amostras encapsuladas (Figura 3C)11. Nesse nível, eles geralmente contribuem de forma negligente para a reação e podem ser ignorados. Para fins estéticos, podem ser retirados da emulsão lavando com óleo fresco (Figura 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Figura 4. Avaliação do modelo de partículas emulsionamento digital gotícula PCR. (A) A imagem fluorescente das gotículas identifica gotículas fluorescentes positivas e gotículas negativas não fluorescentes. (B) Identificação de modelo raro ou baixas concentrações de modelo com PCR de gotícula digital. (C) Sobre o encapsulamento de modelo abundante, resultando em um número variável de moléculas de modelo por gotícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para demonstrar a utilidade do PTE, usamos-na para realizar o PCR11 digital sem microfluidic. Usando o processo, encapsulamos uma amostra composta por DNA genômico de S. cerevisiae , e o termociclizamos. No PCR digital, gotículas contendo alvos amplificados tornam-se fluorescentes, enquanto aquelas sem permanecer fracas. Assim, uma gotícula fluorescente indica um alvo, permitindo a quantitação direta das metas contando gotículas positivas (Figura 4A). O número de gotículas fluorescentes, portanto, escala com as moléculas-alvo, produzindo poucos pontos positivos quando o alvo é raro (Figura 4B) e muitos quando é abundante (Figura 4C). Assim como no encapsulamento de outros componentes discretos, o encapsulamento de alvo segue uma distribuição poisson, permitindo que a fração de gotícula positiva seja transformada na concentração de destino (Figura 4D), demonstrando assim a capacidade de executar PCR digital com PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Figura 5. Demonstração do PCR de gotícula digital usando PAA disponível comercialmente. (A) A imagem fluorescente das gotículas identifica gotículas negativas não fluorescentes. (B) Identificação de baixas concentrações de modelo com PCR de gotícula digital. (C) Identificação de altas concentrações de modelo com PCR de gotícula digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Esses resultados são repetíveis usando partículas de poliacrilamida disponíveis comercialmente (Figura 5) e demonstram a capacidade do PTE de executar PCR digital padrão com partículas de poliacrilamida disponíveis comercialmente, obtendo medições precisas ao longo da mesma faixa.
Arquivo suplementar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Ensaios de gotículas de água em óleo são úteis para química analítica, evolução enzimático e análise de células únicas, mas normalmente requerem microfluidos para formar as gotículas. Aqui, descrevemos a emulsificação de modelos de partículas, uma abordagem microfluida livre para realizar ensaios de gotículas.

Emulsificação de modelos de partículas permite ensaios de gotículas livres de microfluídicos

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

O PCR de gotícula digital oferece maior precisão e sensibilidade em comparação com o PCR quantitativo. Este é um método simples para PCR de gotícula digital que requer equipamentos mínimos e sem experiência. A emulsificação de modelos de partículas é um método de emulsificação sem microfluidic que não requer nenhum equipamento especializado.Além disso, a emulsificação ocorre durante um período de segundos e escalas para o volume do contêiner. Para contas comerciais, adicione 0,5 gramas de partículas secas de poliacrilamida compatíveis com emulsificação de modelo de partículas, ou PTE, a 30 mililitros de água estéril em um tubo cônico de 50 mililitros, e misture bem. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.Para a fabricação microfluida de contas, despeje um mililitro de fotoresist no centro de um wafer de silício de três polegadas e gire-o a 500 RPM por 30 segundos, seguido por 1250 RPM por 30 segundos. Coloque o wafer em uma placa de aquecimento a 95 graus Celsius por 15 minutos para evaporar o solvente. Fixar a máscara fotográfica no wafer de silício com um slide de vidro de cobertura e expor o wafer sob um LED UV colidido por 2,5 minutos.Coloque o wafer em uma placa de aquecimento definida para 95 graus Celsius durante cinco minutos para assar após a exposição. Desenvolva o wafer de silício fotoresist, imergindo-o em um banho de 100% PGMEA por até 15 minutos. Enxágüe o wafer com novo 100% PGMEA, seguido de isopropanol de 100%.Seque o wafer, depois seque-o em uma placa quente fixada a 95 graus Celsius por um minuto, e coloque-o em uma placa de Petri limpa de três polegadas. Misture a base de silicone PDMS e o reagente de cura em uma proporção de 10:1, em seguida, desgas o PDMS misto usando um desiccador sob vácuo até que nenhuma bolha de ar seja observável. Despeje o PDMS desgaseado na placa de Petri, garantindo que o wafer de silício esteja completamente submerso.Desgas o wafer de silício e PDMS, e, em seguida, curar o PDMS colocando o wafer de silício em um forno definido a 65 graus Celsius por pelo menos 60 minutos. Extite um bloco de PDMS contendo as características microfluidas da placa de Petri, usando um bisturi. Bata as entradas e as tomadas no bloco PDMS usando um soco de biópsia de 0,75 milímetros.Em seguida, remova qualquer poeira e partículas com a aplicação repetitiva e remoção da fita de embalagem para a superfície do bloco. Limpe uma lâmina de vidro enxaguando-a com isopropanol de 100% e, posteriormente, secando a superfície. O plasma trata tanto o slide de vidro quanto o PDMS com um milibar de plasma de oxigênio por um minuto, usando um fiador de plasma.Afixe o PDMS na lâmina de vidro colocando o PDMS tratado com plasma com características voltadas para baixo sobre o slide de vidro, lado tratado com plasma voltado para cima. Coloque o deslizamento em um forno definido a 65 graus Celsius por pelo menos 30 minutos, para completar a ligação. Trate todos os canais microfluidos com um tratamento de superfície fluorada para garantir a hidrofobiidade superficial e, em seguida, asse o dispositivo a 65 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.Carregue tanto poliacrilamida, ou PAA, quanto hidrofluoroether, ou HFE, seringas contendo soluções em bombas de seringa. Conecte ambas as seringas ao dispositivo microfluido usando tubos de polietileno. Execute o dispositivo de geração de gota e colete um mililitro das gotículas em um tubo de coleta de 15 mililitros, em seguida, incubar por três horas em temperatura ambiente para polimerização.Após a incubação, remova a camada inferior do óleo por tubulação. Adicione um mililitro de 20% PFO em óleo HFE ao tubo de coleta de 15 mililitros como um demulsificador químico. Após a mistura, gire o tubo de coleta de 15 mililitros a 2000 x g, por dois minutos.Remova a camada inferior por pipetação e repita o processo mais uma vez. Adicione dois mililitros de monooleato de 2%sorbitan em hexano ao tubo de coleta de 15 mililitros e vórtice dele. Gire o tubo a 3000 x g por três minutos e remova o supernatante por pipetação para remover a solução surfactante.Repita isso duas vezes. Adicione cinco mililitros de tampão TEBST e misture bem, depois gire a 3000 x g por três minutos e remova o supernatante por pipetação. Repita isso três vezes e, em seguida, resuspend em cinco mililitros de TEBST.Prepare as partículas de poliacrilamida para emulsificação de partículas modelando centrifugando a 6000 x g por um minuto para pelotar as partículas. Em seguida, remova o supernatante por pipetação, e resuspenque a pelota em água estéril. Repita três vezes para garantir a remoção de qualquer TEBST residual.Prepare a fase de dispersão em um tubo de centrífuga de 15 mililitros fresco, usando uma mistura mestre pcr, os primers apropriados e uma sonda de hidrolise fluoresceína, como descrito no manuscrito do texto. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos sob agitação suave, usando um rotador de tubo. Centrifugar a fase de dispersão a 6000 x g por um minuto e remover o supernatante.Adicione um microliter de Saccharomyces cerevisiae DNA genômico à pelota, e misture bem por pipetar ou tocar vigorosamente. Adicione 200 microlitres de 2% fluorosurfactantes em óleo HFE ao tubo, para emulsificação. Desaloja a pelota por pipetar ou tocar o tubo e, em seguida, vórtice a 3000 RPM por 30 segundos.Deixe que as emulsões se contentem por um minuto, depois remova 100 microliters da fase inferior do óleo e substitua esse volume por um fluorosurfactante fresco de 2% no óleo HFE. Inverta suavemente o tubo várias vezes para misturar. Repita isso três vezes ou mais, até que pequenas gotículas de satélite sejam removidas.Após dois a cinco minutos de assentamento, remova a fase inferior do óleo. Substitua este volume por 5% fluorosurfactante em óleo fluorocarbono. Pipeta 100 microliters de amostra em tubos PCR de 200 microliteres, e coloque os tubos PCR em um termociclador.Pipeta a amostra em um slide de contagem para imagem fluorescente, e imagem da amostra. Emulsificação modelada por partículas proporciona excelente monodispersidade. À medida que o excesso de supernascer é removido estabilizador, a amostra é vórtice para gerar a emulsão.As gotículas resultantes consistem em núcleo de partículas e amostra aquosa contendo reagentes e moléculas de amostras ou células necessárias para a reação. Gotículas polidispersadas com partículas templating indicam vórtice insuficiente. Outra questão é a geração de satélites excessivos, que reduzem a eficiência de encapsulamento.Os satélites não devem incluir mais de 10% do volume total de amostras encapsuladas. Eles podem ser retirados da emulsão lavando com óleo fresco. A utilidade do PTE pode ser demonstrada no PCR digital quando gotículas contendo alvos amplificados se tornam fluorescentes, permitindo a quantitação direta dos alvos.As gotículas fluorescentes produzem poucos pontos positivos quando o alvo é raro, e muitos quando é abundante. Esses resultados são repetíveis usando partículas de poliacrilamida disponíveis comercialmente, obtendo medições precisas ao longo da mesma faixa. A remoção do supernasal da fase de dispersão é importante para o encapsulamento da amostra.Conhecer o volume da pelota e do supernatante pode ajudar a identificar a interface entre os dois. Na dúvida, erre ao lado de remover o supernaspeso.

Research

JoVE Journal

Biology

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

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A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biologia

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

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Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

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Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

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Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

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Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

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