Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Эта работа по разработке этого протокола была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01-EB019453-02), Управлением директора Национальной разведки, деятельностью по перспективным исследовательским проектам разведки через Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Программой исследователей биохабов Чан-Цукерберга, Агентством перспективных исследовательских проектов министерства обороны через Техасский университет A & M (W911NF1920013) и Центрами по контролю и профилактике заболеваний через Университет Джона Хопкинса Applied Лаборатория физики (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Мнения и выводы, содержащиеся в настоящем документе, являются мнениями и выводами авторов и не должны толковаться как обязательно представляющие официальную политику, выраженную или подразумеваемую, вышеуказанных организаций или правительства США. Правительство США уполномочено воспроизводить и распространять перепечатки для правительственных целей, несмотря на любые аннотации, содержащиеся в авторских правах.

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

PTE использует частицы для инкапсуляции образцов в монодисперсные капли путем вихря. В дополнение к своей простоте и доступности, PTE обеспечивает несколько дополнительных преимуществ, в том числе позволяет мгновенно генерировать большие объемы капель. Кроме того, процесс может проводиться в изолированной пробирке, устраняя необходимость передачи образцов в микрофлюидные устройства, оптимизируя общий рабочий процесс и ограничивая возможности для загрязнения или потери образцов. Частицы шаблона также обеспечивают средство, с помощью которого можно спроектировать содержание результирующих капельных реакций. Например, размер частиц, химический состав и смачиваемость могут быть спроектированы для целенаправленного захвата биомолекул или клеток, в то время как функциональные фрагменты, такие как ферменты, активные вещества или нуклеиновые кислоты, могут отображаться на частицах для облегчения реакций, таких как секвенирование отдельных клеток или функциональная характеристика. Хотя этот подход является гибким, тем не менее существуют серьезные ограничения на его использование. Например, в настоящее время невозможно выполнять капельные добавления, как это часто проводится с микрофлюидикой, требуя, чтобы все компоненты реакции были введены перед инкапсуляцией; это требует, чтобы реагенты были совместимыми и стабильными до тех пор, пока не будут образовываться капли, а в случае неприятных комбинаций часто могут быть устранены путем быстрого смешивания и эмульгирования образца на льду. Альтернативно, могут быть использованы реакционноспособные компоненты, которые могут быть вызваны внешним воздействием света или тепла13. Таким образом, PTE обеспечивает гибкий и масштабируемый метод проведения капельных анализов, доступный для неспециалистов. Это, в сочетании с присущей ему простотой и гибкостью, делает PTE идеальным для выполнения и разработки многочисленных капельных приложений.

Микрофлюидика капель использует компартментализацию в пиколитрных каплях для повышения чувствительности и точности анализов по сравнению с объемными реакциями и имеет многочисленные применения в химическом скрининге, белковой инженерии и секвенировании следующего поколения1,2,3. Например, цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (ddPCR) обеспечивает повышенную точность по сравнению с объемной количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), с приложениями для генетических вариаций при раке, обнаружения мутаций, вызывающих заболевание, и пренатальной диагностики4,5,6. Однако одной из проблем, связанных с микрофлюидикой капель, является требование к микрофлюидным устройствам разделять образцы; в то время как микрофлюидика обеспечивает превосходный контроль над свойствами капель, они требуют специализированных знаний для создания и эксплуатации7,8. Следовательно, методы на основе капель в значительной степени ограничены экспертными лабораториями или, в редких случаях, приложениями, в которых доступен коммерческий инструмент9,10. Для расширения использования капельных анализов потребность в специализированных микрофлюидных приборах является препятствием, которое необходимо преодолеть.
В этой статье мы опишем эмульгирование частиц (PTE), метод без микрофлюидности для выполнения реакций в монодисперсных каплях. В PTE частицы шаблона поглощают образец в капли в масле-носителе простым вихрем (рисунок 1). По мере смешивания системы водная часть распадается на капли уменьшающегося размера, пока капли не содержат одиночные частицы, и в этот момент дальнейшая фрагментация невозможна, поскольку это требует разрушения частиц. Поглощенный образец окружает частицы как оболочку в каплях, тем самым инкапсулируя любые дисперсные клетки, реагенты или функциональные фрагменты (рисунок 1D). Таким образом, PTE не требует никакого оборудования или опыта для выполнения капельных реакций за пределами общего вихря. Кроме того, генерация капель занимает секунды по сравнению с минутами или часами с микрофлюидикой, а производимое количество пропорционально объему контейнера, а не времени работы устройства, что делает его в высшей степени масштабируемым. Эти преимущества делают PTE идеальным для проведения капельных анализов в различных обстоятельствах, в которых микрофлюидика непрактична. Здесь мы демонстрируем PTE и используем его для проведения ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Рисунок 1. Обзор процесса эмульгирования по шаблонам частиц. (А) Частицы шаблона смешиваются с реагентами. (B) Избыточные реагенты удаляются после центрифугирования. (C) Добавление шаблонных молекул происходит до добавления масла. (D) Вихрь производит капли, содержащие одну молекулу шаблона. (E) Последующая термоциклировка и визуализация позволяют проводить цифровой капельный анализ целевого шаблона. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

Реакции, выполняемые в монодисперсных каплях, обеспечивают повышенную точность и чувствительность по сравнению с аналогичными реакциями, выполняемыми оптом. Однако требование микрофлюидики к образованию контролируемых капель накладывает барьер для неспециалистов, ограничивая их использование. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, подход к генерации монодисперсных капель без микрофлюидики. Используя шаблонные гидрогелевые сферы, мы инкапсулируем образцы в монодисперсные капли простым вихрем. Мы демонстрируем этот подход, используя его для выполнения цифровой ПЦР без микрофлюидности.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Рисунок 2. Инкапсуляция образца в капли с использованием шаблонной эмульгирования частиц. (A) шаблонизация частиц, используемых для эмульгирования частиц. (B) Отделение гранул частиц шаблона от супернатанта после центрифугирования. (C) Капли, образующиеся в результате эмульгирования по образцу частиц с (D) идентифицируемой водной оболочкой. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В PTE монодисперсность эмульсий диктуется монодисперсностью частиц шаблона, потому что капли имеют диаметр немного больше, чем частицы. Таким образом, однородные частицы занимают центральное место в контролируемой инкапсуляции PTE11. Существует множество методов генерации однородных шаблонизирующих частиц, включая химические (золь-гель, эмульсионная полимеризация), гидродинамические (мембранная эмульгация, гомогенизация) и методы фильтрации. Микрофлюидные подходы, в частности, обеспечивают превосходную монодисперсность (рисунок 2A) и позволяют дополнительной инженерии частиц для повышения их функциональности в PTE12. В качестве альтернативы можно приобрести частицы-шаблоны, хотя их однородность, хотя и адекватна, обычно меньше, чем при микрофлюидной генерации11.
Для выполнения PTE частицы смешивают с образцом, подлежащим инкапсулированию (рисунок 1A), а избыток супернатанта удаляют центрифугированием и пипетированием (рисунок 1B), как показано фотографией гранулы частицы на дне трубки ПЦР (рисунок 2B). Затем добавляют инкапсулирующее масло, содержащее стабилизирующее поверхностно-активное вещество (рисунок 1C), и образец осторожно пипетируют перед вихрем в течение 30 секунд (рисунок 1D), чтобы получить эмульсию (рисунок 2C). Полученные капли содержат ядро частицы и водную оболочку, содержащую исходный образец, внутри которого находятся реагенты, молекулы-мишени и клетки, необходимые для реакции (рисунок 2D). Так же, как и в микрофлюидной инкапсуляции капель, дискретные сущности, такие как маленькие шарики или клетки, инкапсулируются случайным образом и в соответствии с распределением Пуассона, хотя почти все капли содержат частицу-шаблонистку из-за природы физики PTE.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Рисунок 3. Идентификация и очистка капель эмульгирования по шаблонам частиц. (A) Пример неоднородного образования капель с множественными частицами на каплю от недостаточного вихря. B) ожидаемое присутствие спутников и капель после эмульгирования по образцу частиц и С) фракционирования воды в масле. (D) Полученная эмульсия после промывки масла. Е) чрезмерная спутниковая генерация в результате остаточного супернатанта в ходе эмульгирования по образцам частиц. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Даже при успешном ПТЭ существуют капли с двойным или тройным ядром, хотя они, как правило, незначительно влияют на реакцию, при условии, что они редки. Достижение низкой частоты многоядерных капель при сохранении адекватных оболочек требует оптимизации параметров процесса, включая поверхностное натяжение, силы адгезии между частицами, вязкость образца, размер контейнера, а также мощность и время вихря. Например, плохо оптимизированное эмульгирование может содержать полидисперсные капли со многими шаблонизирующими частицами (фиг.3А), что указывает на то, что вихрь был недостаточным для полной эмульгации образца. В таких случаях моющие средства могут быть добавлены для уменьшения адгезии между частицами и снижения поверхностного натяжения, или может быть увеличена вихревая мощность или время. Другой распространенной проблемой является генерация избыточных спутников, которые представляют собой небольшие пустые капли (рисунок 3B). Спутники могут быть неизбежны в эмульсиях PTE в зависимости от межфазного напряжения и реологических свойств образца и масла-носителя. Однако они часто возникают в результате недостаточного удаления избыточного образца перед эмульгированием (рисунок 2B) или вихря со слишком большой мощностью, удаляя оболочки из капель. При успешном эмульгировании PTE спутники должны составлять не более ~10% от общего объема инкапсулированного образца (рисунок 3C)11. На этом уровне они обычно вносят незначительный вклад в реакцию и могут быть проигнорированы. В эстетических целях их можно очистить от эмульсии путем промывки свежим маслом (рисунок 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Рисунок 4. Оценка цифровой капельной ПЦР эмульгирования частицами. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует положительные флуоресцентные капли и отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация редкого шаблона или низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Чрезмерная инкапсуляция шаблона, приводящая к переменному количеству молекул шаблона на каплю. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Чтобы продемонстрировать полезность PTE, мы использовали его для выполнения цифровой PCR11 без микрофлюидности. Используя этот процесс, мы инкапсулировали образец, содержащий геномную ДНК S. cerevisiae , и термоциклировали его. При цифровой ПЦР капли, содержащие амплифицированные мишени, становятся флуоресцентными, в то время как без них остаются тусклыми. Таким образом, флуоресцентная капля указывает цель, позволяя напрямую количественно оценивать цели путем подсчета положительных капель (рисунок 4A). Таким образом, количество флуоресцентных капель масштабируется вместе с молекулами-мишенями, давая мало положительных результатов, когда мишень редка (рисунок 4B) и много, когда она в изобилии (рисунок 4C). Как и в случае с инкапсуляцией других дискретных компонентов, целевая инкапсуляция следует распределению Пуассона, позволяя положительной фракции капель трансформироваться в целевую концентрацию (рисунок 4D), тем самым демонстрируя способность выполнять цифровую ПЦР с PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Рисунок 5. Демонстрация цифровой капельной ПЦР с использованием коммерчески доступной ПАА. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Идентификация высоких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Эти результаты повторяются с использованием коммерчески доступных полиакриламидных частиц (рисунок 5) и демонстрируют способность PTE выполнять стандартную цифровую ПЦР с коммерчески доступными полиакриламидными частицами, достигая точных измерений в том же диапазоне.
Дополнительный файл. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Капельные анализы «вода в масле» полезны для аналитической химии, эволюции ферментов и анализа одиночных клеток, но обычно требуют микрофлюидики для образования капель. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, безфлюидный подход к выполнению капельных анализов.

Эмульгирование с шаблоном частиц позволяет проводить микрофлюидные капельные анализы

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Цифровая капельная ПЦР обеспечивает повышенную точность и чувствительность по сравнению с количественной ПЦР. Это простой метод цифровой капельной ПЦР, требующий минимального оборудования и отсутствия опыта. Шаблонная эмульгация частиц представляет собой метод эмульгирования без микрофлюидности, который не требует какого-либо специализированного оборудования.Кроме того, эмульгирование происходит в течение нескольких секунд и масштабируется до объема контейнера. Для коммерческих шариков добавьте 0,5 грамма высушенных полиакриламидных частиц, совместимых с эмульгированием шаблона частиц или PTE, к 30 миллилитрам стерильной воды в 50-миллилитровой конической трубке и хорошо перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.Для микрофлюидного изготовления бусин налейте один миллилитр фоторезиста на центр трехдюймовой кремниевой пластины, а затем вращайте его при 500 оборотах в минуту в течение 30 секунд, а затем 1250 об/мин в течение 30 секунд. Поместите пластину на конфорку, установленную на 95 градусов Цельсия, на 15 минут, чтобы испарить растворитель. Закрепите фотомаску на кремниевой пластине с помощью стеклянного затвора и обнажите пластину под коллимированным УФ-светодиодом в течение 2,5 минут.Поместите на конфорку, установленную на 95 градусов Цельсия, в течение пяти минут для выпечки после экспозиции. Разработайте фоторезистическую кремниевую пластину, погрузив ее в ванну с 100% PGMEA на срок до 15 минут. Промыть пластину свежим 100% PGMEA, а затем 100% изопропанолом.Высушите пластину на воздухе, затем высушите ее на конфорке, установленной на 95 градусов цельсия в течение одной минуты, и поместите ее в чистую трехдюймовую чашку Петри. Смешайте кремниевую основу PDMS и реагент для отверждения в соотношении 10:1, затем дегазируйте смешанную PDMS с помощью осушителя под вакуумом, пока не будут наблюдаться пузырьки воздуха. Вылейте дегазированную PDMS в чашку Петри, убедившись, что кремниевая пластина полностью погружена в воду.Дегазируйте кремниевую пластину и PDMS, а затем отверждайте PDMS, помещая кремниевую пластину в духовку, установленную на 65 градусов Цельсия в течение не менее 60 минут. Вырежьте блок PDMS, содержащий микрофлюидные признаки, из чашки Петри, используя скальпель. Продувите входные и выходные отверстия в блок PDMS с помощью 0,75-миллиметрового биопсийного перфоратора.Затем удалите всю пыль и твердые частицы с повторным нанесением и удалением упаковочной ленты на поверхность блока. Очистите стеклянную горку, промыв ее 100% изопропанолом, а затем высушив поверхность на воздухе. Плазма обрабатывает как стеклянный слайд, так и PDMS одним миллибаром кислородной плазмы в течение одной минуты, используя плазменный бондер.Прикрепите PDMS к стеклянному слайду, поместив обработанную плазмой PDMS с элементами, обращенными вниз, на стеклянную горку, обработанную плазмой сторону вверх. Поместите горку в духовку, установленную на 65 градусов Цельсия, не менее чем на 30 минут, чтобы завершить склеивание. Обработайте все микрофлюидные каналы фторированной обработкой поверхности для обеспечения гидрофобности поверхности, затем выпекайте устройство при 65 градусах Цельсия в течение не менее 10 минут.Загрузите в шприцы, содержащие раствор, как полиакриламидные, или PAA, так и гидрофторэфирные, или HFE, содержащие шприцы. Подключите оба шприца к микрофлюидному устройству с помощью полиэтиленовой трубки. Запустите устройство генерации капель и соберите один миллилитр капель в 15-миллилитровую сборную трубку, затем инкубируйте в течение трех часов при комнатной температуре для полимеризации.После инкубации удалите нижний слой масла путем пипетки. Добавьте один миллилитр 20% PFO в HFE масле в 15-миллилитровую коллекторную трубку в качестве химического деэмульгатора. После перемешивания открутите 15-миллилитровую сборную трубку при 2000 х г в течение двух минут.Снимите нижний слой путем пипетки и повторите процесс еще раз. Добавьте два миллилитра 2%-ного сорбитана моноолеата в гексане в 15-миллилитровую коллекторную трубку и вихрьте ее. Раскрутите трубку при 3000 х г в течение трех минут и удалите супернатант путем пипетки, чтобы удалить раствор поверхностно-активного вещества.Повторите это дважды. Добавьте пять миллилитров буфера TEBST и хорошо перемешайте, затем раскрутите при 3000 х г в течение трех минут и удалите супернатант путем пипетирования. Повторите это три раза, затем повторно суспендируйте в пяти миллилитрах TEBST.Подготовьте частицы полиакриламида для эмульгирования частиц путем центрифугирования при 6000 х г в течение одной минуты, чтобы гранулировать частицы. Затем удалите супернатант путем пипетки и повторно суспендируйте гранулу в стерильной воде. Повторите три раза, чтобы обеспечить удаление любого остаточного TEBST.Подготовьте дисперсную фазу в свежей 15-миллилитровой центрифужной трубке, используя мастер-смесь ПЦР, соответствующие праймеры и гидролизный зонд флуоресцеина, как описано в текстовой рукописи. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут под мягким перемешиванием, используя трубчатый ротатор. Центрифугируйте дисперсную фазу при 6000 х г в течение одной минуты и удалите супернатант.Добавьте один микролитр геномной ДНК Saccharomyces cerevisiae в гранулу и тщательно перемешайте путем пипетирования или энергичного постукивания. Добавьте 200 микролитров 2%-го фтор-фазанта в HFE-масле в трубку для эмульгирования. Вытесните гранулу путем пипетки или постукивания по трубе, а затем вихрь при 3000 об/мин в течение 30 секунд.Дайте эмульсиям отстояться в течение одной минуты, затем удалите 100 микролитров нижней масляной фазы и замените этот объем свежим 2%-ным фторповерхностным веществом в масле HFE. Осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать. Повторяйте это три раза или более, пока не будут удалены небольшие спутниковые капли.После двух-пяти минут отстаивания удалите нижнюю масляную фазу. Замените этот объем 5% фторповерхностным веществом во фторуглеродном масле. Пипетка 100 микролитров образца в 200-микролитровые ПЦР-трубки и поместите ПЦР-трубки в термоциклер.Пипетка образца на счетный слайд для флуоресцентной визуализации и изображение образца. Эмульгирование частиц обеспечивает превосходную монодисперсность. По мере удаления избытка супернатанта добавляется стабилизирующее поверхностно-активное вещество, и образец вихрь генерируется для получения эмульсии.Полученные капли состоят из ядра частиц и водного образца, содержащего реагенты и образцы молекул или клеток, необходимых для реакции. Полидисперсные капли с шаблонизирующими частицами указывают на недостаточный вихрь. Другой проблемой является генерация избыточных спутников, которые снижают эффективность инкапсуляции.Спутники должны составлять не более 10% от общего объема инкапсулированной пробы. Их можно очистить от эмульсии, промыв свежим маслом. Полезность PTE может быть продемонстрирована в цифровой ПЦР, когда капли, содержащие амплифицированные мишени, становятся флуоресцентными, что позволяет проводить прямое количественное определение целей.Флуоресцентные капли дают мало положительных результатов, когда мишень редка, и много, когда она в изобилии. Эти результаты повторяются с использованием коммерчески доступных полиакриламидных частиц, достигая точных измерений в том же диапазоне. Удаление супернатанта из дисперсной фазы имеет важное значение для инкапсуляции образца.Знание объема гранулы и супернатанта может помочь определить интерфейс между ними. Когда сомневаетесь, ошибитесь на стороне удаления супернатанта.

Research

JoVE Journal

Biology

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

Высокоскоростной капли основе Delivery System для пассивного Насосные в микрожидкостных устройств

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Два типа Анализы для обнаружения Chemoattraction спермы лягушки

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Viability Assays for Cells in Culture

Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Изоляция и флуоресценции изображений для одной частицы реконструкция Хламидомонада Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Капли на основе штриховое кодирование одну ячейку Transcriptomics взрослых тканей млекопитающих

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...