Name: particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
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Este trabajo de desarrollo de este protocolo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01-EB019453-02), la Oficina del Director de Inteligencia Nacional, la Actividad de Proyectos de Investigación Avanzada de Inteligencia a través de Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), el Programa de Investigadores de Biohub Chan-Zuckerberg, la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa a través de la Universidad de Texas A& M (W911NF1920013) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades a través de la Universidad Johns Hopkins Aplicada Laboratorio de Física (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no deben interpretarse como que representan necesariamente las políticas oficiales, ya sean expresas o implícitas, de las organizaciones anteriores o del Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos está autorizado a reproducir y distribuir reimpresiones con fines gubernamentales a pesar de cualquier anotación de derechos de autor en las mismas.

1. Preparación de partículas de hidrogel para emulsificación por plantilla de partículas.
Las partículas de hidrogel utilizadas para la emulsificación de plantillas de partículas se pueden preparar utilizando dos métodos diferentes.
<ol><li>Preparación utilizando partículas disponibles comercialmente
	<ol>
<li>Añadir 0,5 g de partículas secas de poliacrilamida compatibles con PTE (por ejemplo, Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm de diámetro) a 30 ml de agua estéril en un tubo cónico de 50 ml y mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación mediante fabricación microfluídica de partículas NOTA: Las partículas de poliacrilamida compatibles con PTE se pueden preparar utilizando fabricantes de gotas disponibles comercialmente (por ejemplo, QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent), etc.), o mediante un diseño microfluídico personalizado.<ol><li>Fabricación de master personalizado
		<ol>
<li>Diseñe una máscara de fotolitografía suave utilizando un software de diseño asistido por computadora (CAD). Imprima la fotomáscara con una resolución de 10 μm en la película de la placa de circuito.</li>
			<li>Vierta 1 ml de fotorresistente en el centro de una oblea de 3 pulgadas de silicio. Utilice un recubrimiento de centrifugado para crear una capa de fotorresistente de 50 μm girándola a 500 rpm durante 30 segundos seguida de 1250 rpm durante 30 segundos. Coloque la oblea sobre una placa caliente a 95 °C durante 15 minutos para evaporar el disolvente.</li>
			<li>Asegure la fotomáscara en la oblea de silicio con un portaobjetos de vidrio de cubierta y exponga la oblea bajo un LED UV colimado de 190 mW y 365 μm durante 2,5 min. Coloque la oblea en una placa caliente ajustada a 95 °C durante 5 minutos para hornear después de la exposición.</li>
			<li>Desarrolle la oblea de silicio fotorresistente sumergiéndola en un baño de acetato de éter monometílico de propilenglicol 100% (PGMEA) durante un máximo de 15 min. Enjuague la oblea con 100% PGMEA fresco seguido de 100% isopropanol. Seque al aire la oblea.</li>
			<li>Retire cualquier isopropanol residual secando la oblea en una placa caliente a 95 °C durante 1 min. Coloque la oblea en un 3 limpio en placa de Petri.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricación del dispositivo microfluídico personalizado
		<ol>
<li>Mezcle la base de silicio de polidimetilsiloxano (PDMS) y el reactivo de curado en una proporción de 10:1 por masa. Desgasificar el PDMS mixto utilizando un desecador bajo vacío doméstico hasta que no se observen burbujas de aire.</li>
			<li>Vierta el PDMS desgasificado sobre el maestro en la placa de Petri, asegurando que la oblea de silicio esté completamente sumergida. Desgasifica la oblea de silicio y el PDMS para eliminar cualquier burbuja de aire que pueda haberse formado durante el vertido.</li>
			<li>Cure el PDMS colocando la oblea de silicio y el PDMS en un horno a 65 °C durante al menos 60 min. Elimine un bloque de PDMS que contiene las características microfluídicas de la placa de Petri con un bisturí. Tenga especial cuidado para evitar dañar cualquier característica presente en el maestro de silicio.</li>
			<li>Perfore las entradas y las salidas en el bloque PDMS correspondiente a las entradas y salidas en el dispositivo microfluídico utilizando una punción de biopsia de 0,75 mm. Elimine el polvo y las partículas con la aplicación repetitiva y la eliminación de la cinta de embalaje a la superficie del bloque PDMS.</li>
			<li>Limpie un portaobjetos de vidrio de 50 mm x 75 mm enjuagándolo con 100% isopropanol y posteriormente secando al aire la superficie. El plasma trata tanto el portaobjetos de vidrio como el PDMS (características hacia arriba) utilizando 1 mbar de plasma de O2 durante 1 minuto utilizando un enlazador de plasma.</li>
			<li>Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio colocando el PDMS tratado con plasma con características hacia abajo en el portaobjetos de vidrio, con el lado tratado con plasma hacia arriba. Coloque el portaobjetos en un horno a 65 °C durante al menos 30 minutos para completar la unión.</li>
			<li>Trate todos los canales microfluídicos con un tratamiento superficial fluorado para garantizar la hidrofobicidad superficial y evitar la humectación. Hornea el dispositivo a 65 °C durante al menos 10 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Fabricación de partículas de plantillas
		<ol>
<li>Preparar una solución de poliacrilamida (PAA) que consista en 6,2% de acrilamida, 0,18% de N,N′-metilenobis (acrilamida) y 0,3% de persulfato de amonio. Cargue esta solución en una jeringa de 1 ml con una aguja de 28G.</li>
			<li>Preparar una fase continua insoluble que consiste en 5% (p/p) de fluorosurfactante y 1% de N,N,NN-tetrametilendiamina (TEMED) en aceite de hidrofluoroéter (HFE) para la generación y estabilización de gotas. Cargue la solución en una jeringa nueva de 1 ml.</li>
			<li>Cargue las jeringas que contienen las jeringas que contienen paA y HFE en las bombas de jeringa (por ejemplo, NE-501). Conecte ambas jeringas al dispositivo microfluídico mediante tubos de polietileno insertados en la jeringa y en el dispositivo. Antes de la conexión, prepare las bombas para eliminar el aire de la tubería. NOTA: Dependiendo del modelo, las bombas de jeringa se pueden controlar con entrada incorporada, software de fabricación o un script personalizado (disponible en https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>Ejecute el dispositivo de generación de gotas con entradas de aceite PAA y HFE a 300 μL/h y 500 μL/h, respectivamente. Recoger 1 ml de las gotas en un tubo de recogida de 15 ml e incubar durante 3 h a temperatura ambiente para la polimerización. Después de la incubación, retire la capa inferior de aceite mediante pipeteo.</li>
			<li>Agregue 1 ml de perfluoro-1-octanol (PFO) al 20% (v/v) en aceite de HFE al tubo de recolección de 15 ml como demulsificante químico. Después de mezclar, gire el tubo de recolección de 15 ml a 2000 x g durante 2 minutos. Retire el sobrenadante PFO/HFE mediante pipeteo. Repita 1x.</li>
			<li>Agregue 2 ml de monooleato de sorbitano al 2% en hexano al tubo de recolección de 15 ml y al vórtice para mezclar. Girar el tubo a 3000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante mediante pipeteo para eliminar la solución de surfactante/hexano. Repita 2x.</li>
			<li>Agregue 5 ml de tampón TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) y mezcle bien. Girar hacia abajo a 3.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Repita 3x.</li>
			<li>Resuspend en 5 mL TEBST. Esta solución puede almacenarse a 4 °C indefinidamente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Emulsificación con plantilla de partículas.
Después de la preparación de las partículas de plantillas, PTE se utiliza para encapsular la muestra y los reactivos en gotas.
<ol><li>Prepare las partículas de poliacrilamida para la emulsificación por plantilla de partículas centrifugando a 6000 x g durante 1 min para granular las partículas, luego retire el sobrenadante mediante pipeteo y vuelva a suspender con agua estéril. Repita 3x para asegurar la eliminación de cualquier TEBST residual.</li>
	<li>Determine la concentración y el diámetro de las partículas de plantilla utilizando un hemocitómetro (o equivalente). Calcule el diámetro de partículas individuales midiendo los diámetros en píxeles y convirtiéndolos a micras. La conversión de píxeles a micras se puede calcular utilizando el hemocitómetro (o equivalente) como una diapositiva de calibración y midiendo la distancia de cuadrícula conocida en píxeles.</li>
	<li>Prepare la fase dispersa en un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml utilizando una mezcla maestra de PCR, los cebadores apropiados y una sonda de hidrólisis de fluoresceína de acuerdo con la Tabla 1. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min bajo agitación suave (10 rpm) utilizando un rotador de tubo para asegurar una distribución homogénea de los componentes. NOTA: El volumen y la concentración objetivo de las partículas se basan en la carga de Poisson. Como regla general, el número de partículas debe ser un orden de magnitud mayor que el número de muestras a encapsular. Para muestras de concentraciones desconocidas, es necesaria una serie de dilución para garantizar la carga de Poisson.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volumen</td>
			<td>Reactivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μL</td>
			<td>Partículas (450 partículas / μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μL</td>
			<td>2x mezcla maestra de PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Imprimación delantera de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Imprimación inversa de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>Sonda de 10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 μL</td>
			<td>Tritón X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45,2 μL</td>
			<td>Agua libre de nucleasas</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Preparación de la mezcla maestra de PCR utilizada con PTE para PCR de gotas digitales.
<ol start="4"><li>Centrifugar la fase dispersa a 6000 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante. Registre el volumen del sobrenadante extraído y utilizando el volumen total de fase de dispersión calculado en 2.3 determine el volumen de pellets. NOTA: La cantidad de sobrenadante extraído variará dependiendo del empaquetamiento de partículas, el diámetro y la concentración con un volumen mínimo esperado de 300 μL.</li>
	<li>Añadir 1 μL de ADN genómico de 1,62 pg/μL de Saccharomyces cerevisiae al pellet de 2,4 y mezclar bien mediante pipeteo o tapping vigoroso. NOTA: La presencia de exceso de contenido acuoso puede disminuir la eficiencia de encapsulación. Si el volumen de la muestra supera el 1% del volumen del pellet, concentre la muestra. Si la muestra no se puede concentrar, escale la mezcla maestra de PCR y el volumen de pellets resultante de acuerdo con el volumen de muestra. PTE permite la emulsificación de volúmenes pequeños (10 μL) a grandes (2 mL) de partículas de plantillas. La mezcla maestra de PCR (2.3) y el aceite (2.6) se pueden escalar de acuerdo con el volumen objetivo (2.3) y medido (2.4) del pellet de partículas, respectivamente.</li>
	<li>Agregue 200 μL de fluorosurfactante al 2% en aceite de HFE al tubo como la fase continua insoluble para la emulsificación. Asegúrese de que el pellet se desaloje mediante pipeteo o golpeteo / movimiento del tubo. Luego vórtice a 3000 rpm durante 30 segundos. NOTA: La configuración correspondiente a 3000 rpm puede variar según la marca y el modelo.</li>
	<li>Deje que las emulsiones se asienten durante 1 min. Retire 100 μL de la fase de aceite inferior y reemplace este volumen con fluorosurfactante fresco al 2% en aceite HFE. Invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar. Repita 3-5 veces o hasta que se hayan eliminado las pequeñas gotas de satélite.</li>
</ol>3. PCR y análisis de gotas digitales.
<ol><li>Después de 2-5 minutos de sedimentación, retire la fase de aceite inferior. Reemplace este volumen con fluorosurfactante al 5% en aceite de fluorocarbono (por ejemplo, FC-40).</li>
	<li>Usando una punta de pipeta de orificio ancho, pipetee cuidadosamente los 100 μL de muestra en tubos de PCR de 200 μL. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y corra de acuerdo con la Tabla 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Duración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>Años 90</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>Años 60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Repita los pasos 2 a 4 de x34</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>sostener</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Condiciones de termociclamiento para PCR digital de gotas utilizando emulsiones PTE.
<ol start="3"><li>Pipetear la muestra en una diapositiva de conteo utilizando una punta de pipeta de orificio ancho para imágenes fluorescentes. Tome una imagen de la muestra utilizando un microscopio fluorescente con excitación de 490 nm y longitudes de onda de detección de emisión de 525 nm.</li>
	<li>Cuantificar las gotas fluorescentes positivas (Np) y las gotas totales (NT) para verificar la presencia y calcular el número de moléculas plantilla (λ) utilizando la fracción de gotas positivas (Np/NT) y las estadísticas de Poisson: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>Calcule el intervalo de confianza del 95% (zc = 1,96) mediante: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>Calcule la concentración de la muestra (moléculas/μL) utilizando el volumen (ν en μL) de la muestra añadida en el paso 2.5, utilizando la ecuación que se indica a continuación. Determinar la media y la desviación estándar de la concentración de la muestra mediante réplicas técnicas. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

PTE utiliza partículas para encapsular muestras en gotas monodispersadas por vórtice. Además de su simplicidad y accesibilidad, PTE proporciona varios beneficios adicionales, incluido el permitir que se generen grandes volúmenes de gotas instantáneamente. Además, el proceso se puede llevar a cabo en un tubo aislado, evitando la necesidad de transferir muestras a dispositivos microfluídicos, agilizando el flujo de trabajo general y limitando las oportunidades de contaminación o pérdida de muestras. Las partículas de plantillas también proporcionan un medio para diseñar el contenido de las reacciones de gotas resultantes. Por ejemplo, el tamaño de partícula, la química y la humectabilidad se pueden diseñar para la captura de biomoléculas o células dirigidas, mientras que las partes funcionales como enzimas, activos o ácidos nucleicos, se pueden mostrar en partículas para facilitar las reacciones, como para la secuenciación de células individuales o la caracterización funcional. Si bien el enfoque es flexible, existen importantes limitaciones para su uso. Por ejemplo, actualmente no es posible realizar adiciones de gotas como a menudo se realizan con microfluídica, lo que requiere que todos los componentes de reacción se introduzcan antes de la encapsulación; esto requiere que los reactivos sean compatibles y estables hasta que se puedan generar las gotas y, en el caso de combinaciones problemáticas, a menudo se puede abordar mezclando y emulsionando rápidamente la muestra en hielo. Alternativamente, se pueden utilizar componentes reactivos que se pueden activar externamente con luz o calor13. Por lo tanto, PTE proporciona un método flexible y escalable para realizar ensayos de gotas accesibles para no expertos. Esto, junto con su simplicidad y flexibilidad innatas, hace que PTE sea ideal para la ejecución y el desarrollo de numerosas aplicaciones de gotas.

La microfluídica de gotas aprovecha la compartimentación en gotas de picolitros para aumentar la sensibilidad y la precisión de los ensayos en comparación con las reacciones a granel, y tiene numerosas aplicaciones en el cribado químico, la ingeniería de proteínas y la secuenciación de próxima generación1,2,3. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de gotas digitales (ddPCR) ofrece una mayor precisión en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a granel (qPCR), con aplicaciones para la variación genética en cánceres, la detección de mutaciones causantes de enfermedades y el diagnóstico prenatal4,5,6. Sin embargo, un desafío de la microfluídica de gotas es el requisito de que los dispositivos microfluídicos dividan las muestras; mientras que la microfluídica permite un excelente control sobre las propiedades de las gotas, requieren experiencia especializada para construir y operar7,8. En consecuencia, los métodos basados en gotas se limitan en gran medida a laboratorios expertos o, en raras ocasiones, a aplicaciones en las que se dispone de un instrumento comercial9,10. Para ampliar el uso de ensayos de gotas, el requisito de instrumentación microfluídica especializada es un obstáculo que debe superarse.
En este artículo, describimos la emulsificación con plantilla de partículas (PTE), un método libre de microfluídica para realizar reacciones en gotas monodispersadas. En PTE, las partículas de plantillas envuelven la muestra en gotas en aceite portador mediante vórtice simple (Figura 1). A medida que el sistema se mezcla, la porción acuosa se fragmenta en gotas de tamaño reducido hasta que las gotas contienen partículas individuales, momento en el que no es posible una mayor fragmentación porque requiere romper las partículas. La muestra engullida rodea las partículas como una cáscara en las gotas, encapsulando así cualquier célula dispersa, reactivos o partes funcionales (Figura 1D). Por lo tanto, PTE no requiere equipo o experiencia para realizar reacciones de gotas más allá de un vórtice común. Además, la generación de gotas toma segundos en comparación con los minutos u horas con microfluídica, y la cantidad producida es proporcional al volumen del contenedor, no al tiempo de operación del dispositivo, lo que lo hace sumamente escalable. Estos beneficios hacen que la PTE sea ideal para realizar ensayos de gotas en una variedad de circunstancias en las que la microfluídica no es práctica. Aquí, demostramos PTE y lo usamos para realizar ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Figura 1. Descripción general del proceso de emulsificación con plantilla de partículas. (A) Las partículas de plantillas se mezclan con reactivos. (B) El exceso de reactivos se elimina después de la centrifugación. (C) La adición de moléculas de plantilla ocurre antes de la adición de aceite. (D) El vórtice produce gotas que contienen una sola molécula de plantilla. (E) El termociclado y la imagen posteriores permiten el análisis digital de gotas de la plantilla objetivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

Las reacciones realizadas en gotas monodispersadas permiten una mayor precisión y sensibilidad en comparación con las equivalentes realizadas a granel. Sin embargo, el requisito de los microfluídicos de formar gotas controladas impone una barrera a los no expertos, limitando su uso. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque para generar gotas monodispersas sin microfluídica. Utilizando esferas de hidrogel de plantillas, encapsulamos muestras en gotas monodispersadas mediante vórtice simple. Demostramos el enfoque utilizándolo para realizar PCR digital sin microfluídica.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Figura 2. Encapsulación de la muestra en gotas mediante emulsificación con plantilla de partículas. A) partículas de plantillas utilizadas para la emulsificación de plantillas de partículas. (B) Separación del pellet de partículas de plantillas del sobrenadante después de la centrifugación. (C) Gotas resultantes de la emulsificación con plantilla de partículas con (D) cáscara acuosa identificable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En PTE, la monodispersidad de las emulsiones está dictada por la de las partículas de plantillas, porque las gotas tienen un diámetro ligeramente mayor que las partículas. Por lo tanto, las partículas uniformes son fundamentales para la encapsulación controlada de PTE11. Existe una variedad de métodos para generar partículas de plantillas uniformes, incluyendo métodos químicos (sol-gel, polimerización en emulsión), hidrodinámicos (emulsificación por membrana, homogeneización) y de filtración. Los enfoques microfluídicos, en particular, ofrecen una excelente monodispersidad (Figura 2A) y permiten que la ingeniería de partículas adicional mejore su funcionalidad en PTE12. Alternativamente, se pueden comprar partículas de plantillas, aunque su uniformidad, aunque adecuada, suele ser menor que con la generación microfluídica11.
Para realizar PTE, las partículas se mezclan con la muestra a encapsular (Figura 1A), y el exceso de sobrenadante se elimina por centrifugación y pipeteo (Figura 1B), como se ilustra con una fotografía de un pellet de partículas en la parte inferior de un tubo de PCR (Figura 2B). Luego se agrega el aceite encapsulante que contiene un surfactante estabilizador (Figura 1C) y la muestra se pipetea suavemente antes de vórtice durante 30 segundos (Figura 1D), para generar la emulsión (Figura 2C). Las gotas resultantes contienen un núcleo de partículas y una capa acuosa que comprende la muestra inicial, dentro de la cual residen los reactivos, las moléculas diana y las células necesarias para la reacción (Figura 2D). Al igual que en la encapsulación microfluídica de gotas, las entidades discretas como pequeñas cuentas o células se encapsulan al azar y de acuerdo con una distribución de Poisson, aunque casi todas las gotas contienen una partícula de plantillas debido a la naturaleza de la física de PTE.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Figura 3. Identificación y limpieza de gotitas de emulsificación con plantilla de partículas. (A) Ejemplo de generación de gotas no uniformes con múltiples partículas por gota de vórtice insuficiente. (B) Presencia esperada de satélites y gotas después de la emulsificación con plantilla de partículas y (C) el fraccionamiento de agua en aceite. (D) Emulsión resultante después del lavado con aceite. E) Generación excesiva de satélites resultante de la sobrenadante residual durante la emulsificación con plantilla de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Incluso en la PTE exitosa, existen gotas de doble o triple núcleo, aunque generalmente contribuyen de manera insignificante a la reacción, siempre que sean raras. Lograr una baja frecuencia de gotas multinúcleo mientras se conservan las carcasas adecuadas requiere la optimización de los parámetros del proceso, incluida la tensión superficial, las fuerzas de adhesión entre partículas, la viscosidad de la muestra, el tamaño del contenedor y la potencia y el tiempo de vórtice. Por ejemplo, una emulsificación mal optimizada puede contener gotas polidispersadas con muchas partículas de plantillas (Figura 3A), lo que indica que el vórtice fue insuficiente para emulsionar completamente la muestra. En tales casos, se pueden agregar detergentes para reducir la adhesión entre partículas y reducir la tensión superficial, o se puede aumentar la potencia o el tiempo de vórtice. Otro problema común es la generación de satélites excesivos, que son pequeñas gotas vacías (Figura 3B). Los satélites pueden ser inevitables en las emulsiones PTE dependiendo de la tensión interfacial y las propiedades reológicas de la muestra y el aceite portador. Sin embargo, a menudo son el resultado de no eliminar adecuadamente el exceso de muestra antes de la emulsificación (Figura 2B), o de un vórtice con demasiada potencia, despojando las conchas de las gotas. En una emulsificación PTE exitosa, los satélites no deben comprender más de ~ 10% del volumen total de muestra encapsulada (Figura 3C)11. En este nivel, generalmente contribuyen de manera insignificante a la reacción y pueden ser ignorados. Para fines estéticos, se pueden eliminar de la emulsión lavando con aceite fresco (Figura 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Figura 4. Evaluación de la pcrización digital de gotas de emulsificación de partículas. (A) Las imágenes fluorescentes de las gotas identifican gotas fluorescentes positivas y gotas no fluorescentes negativas. (B) Identificación de plantilla rara o bajas concentraciones de plantilla con PCR de gota digital. (C) Sobre abundante encapsulación de plantillas que resulta en un número variable de moléculas de plantilla por gota. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para demostrar la utilidad de la PTE, la utilizamos para realizar PCR11 digital libre de microfluídica. Usando el proceso, encapsulamos una muestra que comprende ADN genómico de S. cerevisiae y la termociclamos. En la PCR digital, las gotas que contienen objetivos amplificados se vuelven fluorescentes, mientras que las que no lo hacen permanecen tenues. Por lo tanto, una gota fluorescente indica un objetivo, lo que permite la cuantificación directa de los objetivos mediante el recuento de gotas positivas (Figura 4A). Por lo tanto, el número de gotas fluorescentes se escala con las moléculas objetivo, produciendo pocos positivos cuando el objetivo es raro (Figura 4B) y muchos cuando es abundante (Figura 4C). Al igual que con la encapsulación de otros componentes discretos, la encapsulación objetivo sigue una distribución de Poisson, lo que permite que la fracción de gota positiva se transforme en la concentración objetivo (Figura 4D), demostrando así la capacidad de realizar PCR digital con PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Figura 5. Demostración de PCR digital con gotas utilizando PAA disponible comercialmente. (A) Las imágenes fluorescentes de las gotas identifican gotas no fluorescentes negativas. (B) Identificación de bajas concentraciones de plantilla con GOTITAS DIGITALES PCR. (C) Identificación de altas concentraciones de plantilla con PCR digital de gotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Estos resultados son repetibles utilizando partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente (Figura 5) y demuestran la capacidad de PTE para realizar PCR digital estándar con partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente, logrando mediciones precisas en el mismo rango.
Archivo complementario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Los ensayos de gotas de agua en aceite son útiles para la química analítica, la evolución enzimática y el análisis de células individuales, pero generalmente requieren microfluídica para formar las gotas. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque libre de microfluídica para realizar ensayos de gotas.

La emulsificación con plantilla de partículas permite ensayos de gotas sin microfluídica

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

La PCR digital de gotas ofrece una mayor precisión y sensibilidad en comparación con la PCR cuantitativa. Este es un método simple para la PCR de gotas digitales que requiere un equipo mínimo y ninguna experiencia. La emulsificación por plantilla de partículas es un método de emulsificación libre de microfluídica que no requiere ningún equipo especializado.Además, la emulsificación se produce durante un período de segundos y se escala al volumen del contenedor. Para las perlas comerciales, agregue 0,5 gramos de partículas secas de poliacrilamida compatibles con la emulsificación de plantillas de partículas, o PTE, a 30 mililitros de agua estéril en un tubo cónico de 50 mililitros, y mezcle bien. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Para la fabricación microfluídica de perlas, vierta un mililitro de fotorresistencia en el centro de una oblea de silicio de tres pulgadas y luego gírela a 500 RPM durante 30 segundos, seguida de 1250 RPM durante 30 segundos. Coloque la oblea en una placa caliente a 95 grados Celsius durante 15 minutos para evaporar el disolvente. Asegure la fotomáscara en la oblea de silicio con una diapositiva de vidrio de cubierta y exponga la oblea bajo un LED UV colimado durante 2,5 minutos.Coloque la oblea en una placa caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos para hornear después de la exposición. Desarrolla la oblea de silicio fotorresistente sumergiéndola en un baño de 100%PGMEA durante un máximo de 15 minutos. Enjuague la oblea con 100% PGMEA fresco, seguido de 100% isopropanol.Seque al aire la oblea, luego séquela en una placa caliente a 95 grados Celsius durante un minuto y colóquela en una placa de Petri limpia de tres pulgadas. Mezcle la base de silicio PDMS y el reactivo de curado en una proporción de 10: 1, luego desgasifique el PDMS mixto usando un desecador al vacío hasta que no se observen burbujas de aire. Vierta el PDMS desgasificado en la placa de Petri, asegurándose de que la oblea de silicio esté completamente sumergida.Desgasifica la oblea de silicio y el PDMS, y luego cura el PDMS colocando la oblea de silicio en un horno a 65 grados Centígrados durante al menos 60 minutos. Elimine un bloque de PDMS que contenga las características microfluídicas de la placa de Petri, utilizando un bisturí. Perfore las entradas y las salidas en el bloque PDMS con una punción de biopsia de 0,75 milímetros.A continuación, elimine el polvo y las partículas con la aplicación repetitiva y la eliminación de la cinta de embalaje a la superficie del bloque. Limpie un portaobjetos de vidrio enjuagándolo con 100% de isopropanol y, posteriormente, secando al aire la superficie. El plasma trata tanto el portaobjetos de vidrio como el PDMS con un milibar de plasma de oxígeno durante un minuto, utilizando un enlazador de plasma.Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio colocando el PDMS tratado con plasma con características hacia abajo en el portaobjetos de vidrio, con el lado tratado con plasma hacia arriba. Coloque el portaobjetos en un horno a 65 grados centígrados durante al menos 30 minutos, para completar la unión. Trate todos los canales microfluídicos con un tratamiento de superficie fluorada para garantizar la hidrofobicidad de la superficie, luego hornee el dispositivo a 65 grados Celsius durante al menos 10 minutos.Cargue tanto las jeringas que contienen poliacrilamida, o PAA, como las que contienen hidrofluoroéter, o HFE, en las bombas de jeringa. Conecte ambas jeringas al dispositivo microfluídico mediante tubos de polietileno. Ejecute el dispositivo de generación de gotas y recoja un mililitro de las gotas en un tubo de recolección de 15 mililitros, luego incube durante tres horas a temperatura ambiente para la polimerización.Después de la incubación, retire la capa inferior de aceite mediante pipeteo. Agregue un mililitro de PFO al 20% en aceite de HFE al tubo de recolección de 15 mililitros como demulsificador químico. Después de mezclar, gire el tubo de recolección de 15 mililitros a 2000 x g, durante dos minutos.Retire la capa inferior mediante pipeteo y repita el proceso una vez más. Agregue dos mililitros de monooleato de sorbitano al 2% en hexano al tubo de recolección de 15 mililitros y vórtice. Gire el tubo a 3000 x g durante tres minutos y retire el sobrenadante mediante pipeteo para eliminar la solución de surfactante.Repita esto dos veces. Agregue cinco mililitros de tampón TEBST y mezcle bien, luego gire hacia abajo a 3000 x g durante tres minutos y retire el sobrenadante mediante pipeteo. Repita esto tres veces, luego vuelva a suspender en cinco mililitros de TEBST.Prepare las partículas de poliacrilamida para la emulsificación por plantilla de partículas centrifugando a 6000 x g durante un minuto para granular las partículas. Luego retire el sobrenadante mediante pipeteo y vuelva a suspender el pellet en agua estéril. Repetir tres veces para asegurar la eliminación de cualquier TEBST residual.Prepare la fase dispersa en un tubo de centrífuga fresco de 15 mililitros, utilizando una mezcla maestra de PCR, los cebadores apropiados y una sonda de hidrólisis de fluoresceína, como se describe en el manuscrito de texto. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos bajo agitación suave, utilizando un rotador de tubo. Centrifugar la fase dispersa a 6000 x g durante un minuto y retirar el sobrenadante.Agregue un microlitro de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae al pellet y mezcle bien mediante pipeteo o golpeteo vigoroso. Agregue 200 microlitros de fluorosurfactante al 2% en aceite HFE al tubo, para la emulsificación. Desaloje el pellet pipeteando o golpeando el tubo, y luego vórtice a 3000 RPM durante 30 segundos.Deje que las emulsiones se asienten durante un minuto, luego retire 100 microlitros de la fase de aceite inferior y reemplace este volumen con fluorosurfactante fresco al 2% en aceite HFE. Invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar. Repita esto tres veces o más, hasta que se eliminen las pequeñas gotas satélite.Después de dos a cinco minutos de sedimentación, retire la fase de aceite inferior. Reemplace este volumen con 5% de fluorosurfactante en aceite de fluorocarbono. Pipetear 100 microlitros de muestra en tubos de PCR de 200 microlitros y colocar los tubos de PCR en un termociclador.Pipetear la muestra en una diapositiva de conteo para imágenes fluorescentes e imagen de la muestra. La emulsificación de partículas con plantilla ofrece una excelente monodispersidad. A medida que se elimina el exceso de sobrenadante, se agrega surfactante estabilizador y se vórtice la muestra para generar la emulsión.Las gotas resultantes consisten en núcleo de partículas y muestra acuosa que contiene reactivos y moléculas de muestra o células necesarias para la reacción. Las gotas polidispersadas con partículas de plantillas indican un vórtice insuficiente. Otro problema es la generación de satélites excesivos, que reducen la eficiencia de encapsulación.Los satélites no deben comprender más del 10% del volumen total de muestra encapsulada. Se pueden eliminar de la emulsión lavándolas con aceite fresco. La utilidad de la PTE se puede demostrar en la PCR digital cuando las gotas que contienen objetivos amplificados se vuelven fluorescentes, lo que permite la cuantificación directa de los objetivos.Las gotas fluorescentes producen pocos positivos cuando el objetivo es raro, y muchos cuando es abundante. Estos resultados son repetibles utilizando partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente, logrando mediciones precisas en el mismo rango. La eliminación del sobrenadante de la fase de dispersión es importante para la encapsulación de la muestra.Conocer el volumen del pellet y el sobrenadante puede ayudar a identificar la interfaz entre los dos. En caso de duda, errar en el lado de quitar el sobrenadante.

Research

JoVE Journal

Biology

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

De alta velocidad basada en las gotas de entrega del sistema de bombeo pasiva en dispositivos de microfluidos

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Investigación

Biología

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

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El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

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Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

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Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Viability Assays for Cells in Culture

Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

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En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

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Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

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