Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

作者声明不存在利益冲突。

结合不同的光学显微镜方法，以获得有关纳米颗粒从微气泡表面传递到周围介质的各个步骤的信息。对气泡振荡进行成像，以及对气泡壳中纳米颗粒的释放，外渗以及体内肿瘤细胞外基质的渗透进行成像。与更复杂的体内设置相比，体外成像可以筛选许多超声参数。结合这一系列成像方式的好处是在不同的时间尺度上可以获得补充信息 - 这一特征对于表征和优化微气泡以获得成功递送并获得治疗效果至关重要。这种方法有助于了解所有微气泡的递送机制，包括具有荧光标记纳米颗粒和药物的构建体。
用于研究单个微气泡的显微镜方法中最关键的步骤如下。对于荧光显微镜，纳米颗粒应进行荧光标记，以便能够可视化颗粒释放。此外，样品溶液应充分稀释以分离单个微气泡，以便在共聚焦，明场和荧光显微镜方法中进行分析。此外，重要的是选择超声波驱动频率和声压来最有效地激发气泡，即在它们的共振下。如果研究问题涉及纳米颗粒有效载荷的传递，则应将适当的超声参数作为研究的一部分。除了共振之外，这些气泡还应被驱动到或超过其纳米颗粒释放的阈值，通常在相对较高的声压振幅（MI >0.3）51。对于明场显微镜成像，选择具有足够高帧速率的高速相机以最大限度地减少运动模糊并避免混叠至关重要。
明场显微镜主要受成像帧速率和可用光源强度的限制，因为较高的帧速率可以更详细地了解气泡动力学的时间分辨，但由于曝光时间更短，因此需要更强烈的照明。为了更详细地研究粒子释放，原则上可以通过增加激光的强度来增加荧光成像的帧速率。然而，荧光标记的微气泡对高强度激光的吸收会产生热量，即使使用高量子产率染料也是如此。这种热量会干扰所涉及的实验，并且在极端情况下会诱发光热空化52。因此，在实践中，所施加的激光通量是有限制的。然而，强烈的激光照明也可以故意用于诱导脂质体的颗粒释放53。温度影响气泡动力学和超声波响应，具体取决于气泡类型54。因此，如果要客观地比较 体外 和活体内的方法，则应在37°C下进行方案中讨论的 体外 方法。 当前论文中讨论的 体外 方法的另一个局限性是气泡不在自由场环境中，因为微气泡将漂浮在样品架膜下方。此外，在对单个微气泡进行成像时存在选择偏差。然而，对单个气泡进行重复实验可以研究大小的影响并去除混杂因素 - 大小分布。如果气泡响应可以理解为大小的函数，而浓度不太高以防止气泡 - 气泡相互作用，则可以计算任何任意气泡群体的响应。最后，明场和荧光显微镜方法都提供了对二维（2D）图像中卷曲的微气泡的见解。如果研究问题需要超过2D成像，则可以通过将协议中描述的设置与多平面成像的侧视图设置相结合来解决气泡的3D行为55。
研究微气泡的另一种方法是声学表征56。然而，测量单个微气泡的回波需要定位和隔离超声束内的单个微气泡56，这带来了通常通过使用窄管或光学或声学镊子来解决的挑战57，58。为了从声学上确定气泡的大小，微气泡可以在几何散射状态下以远高于其共振频率的频率进行共振，这不会诱发体积微气泡振荡59。使用"声学相机"是一种响应超声波对单个微气泡的径向动力学进行成像的方法，其中高频超声探头用于确定气泡对低频驱动波60的径向响应。该方法的缺点是只能用于确定微气泡半径的相对变化;因此，需要另一种方法来确定绝对气泡 半径，例如，通过光学成像61，62。微气泡以高于其共振频率的频率暴露于超声波的方法的缺点是，在如此高的频率下，穿透深度减小59，限制了 体内 应用的可用性。其他形式的显微镜也可用于研究微气泡，例如扫描电子显微镜，原子力显微镜和透射电子显微镜63。然而，这些替代显微镜技术可实现的时空分辨率通常更有限，并且这些技术的缺点是成像是在超声暴露之前或之后通过离线分析进行的，并且通常呈现低通量63。另一种选择是使用光散射方法，该方法可用于实时研究单个微气泡的径向动力学，但与声学散射方法相比，信噪比较低64。
超声暴露期间的实时活体显微镜检查是一种强大的方法，可以在超声暴露期间获得有关脉管系统，微气泡，纳米颗粒或其他分子（例如右旋糖）行为的新见解。进行实时活体显微镜检查时的一般限制是仅对组织的一小部分区域进行成像，并且光对组织的穿透深度有限。如果成像的血管在视野内含有很少的微气泡和/或纳米颗粒，则很少或根本没有关于纳米颗粒行为和外渗的信息。此外，由于视场有限，光和超声波路径之间的正确对齐至关重要。如果超声压力足够高以诱发气泡破坏，那么选择脉冲重复频率也很重要，该频率允许新鲜气泡在超声脉冲之间重新注入视野。此外，由于超声波将从窗室和物镜中的盖板玻璃反射，因此将换能器放置在一定角度对于减少反射非常重要，以防止形成驻波，从而扭曲校准的压力场。另一个实际问题是，设置需要有足够的空间来安装显微镜设置中物镜上方或下方的超声探头和波导。背窗室中的肿瘤由于限制室和盖玻片而具有有限的厚度;但是，如果需要，可以使用其他模型。例如，皮肤褶皱肿瘤在乳腺脂肪垫65 或腹部活体内成像的肿瘤在各个器官66。这种肿瘤可以在适当的微环境中原位生长，因此，呈现出更具临床相关性的病例。
这项工作中描述的方法启发了荧光标记微气泡的潜力，以使用气泡和超声波研究药物递送应用的基础知识。这种显微镜方法的组合为超声谐振的微气泡响应及其相关的声学参数空间提供了有价值的见解，并提供了相关时间和长度尺度范围内微气泡和有效载荷行为的清晰视图。

超声是最广泛使用的医学成像技术。它具有非侵入性、快速、安全、经济高效且便于携带1，2，3。然而，血液是一种较差的超声散射器，静脉注射超声造影剂可以增强血池的对比度3。这种增强的血池对比能够定量器官灌注用于诊断目的， 例如，检测冠状动脉疾病4 和转移性肝病5。事实上，肿瘤脉管系统被证明是一个重要的预后因素6。现在，一项主要的研究工作是针对微气泡辅助的靶向分子成像和定制用于治疗用途的造影剂。
市售的超声造影剂通常由直径范围为1μm至10μm9的涂层微气泡悬浮液7，8组成。由于超声造影剂微气泡略小于红细胞7，因此微气泡甚至可以安全地到达最小的毛细血管，而不会产生闭塞3。与 tissue10 相比，微气泡的超声反向散射系数显著增加，因为它们具有可压缩的气体核心11。此外，微气泡回波是高度非线性的，即其频谱包含驱动频率的谐波和次谐波。此外，回波强度很大程度上取决于气泡的共振响应12。虽然组织仅线性散射，但少量微气泡足以在谐波成像中实现高检测灵敏度13，14。这种非线性对比度生成甚至可以强大到足以跟踪体内的单个气泡15。
超声造影剂的外壳可稳定气泡，防止溶解和凝聚，从而增加它们在血液池中的循环时间16。外壳可以由脂质，聚合物或变性蛋白质组成3，8。它降低了界面张力，从而限制了拉普拉斯压力驱动溶解的影响17 ，并产生了防止气体扩散的电阻屏障18。为了进一步提高稳定性，造影剂微泡通常填充在血液中溶解度低的高分子量气体11。微气泡壳极大地改变了微气泡对超声共振的反应11。未涂覆的气泡具有与其大小成反比的特征共振频率，并且由于壳的固有刚度，添加脂质涂层会增加相对于未涂层气泡的共振频率3。此外，壳体通过膨胀粘度消散能量，膨胀粘度是涂层气泡阻尼的主要来源3。稳定壳具有额外的优点，即它可以功能化， 例如， 通过将靶向配体结合到微气泡表面。这种靶向使这些气泡的许多应用成为可能，特别是超声波分子成像14，19。
微气泡造影剂在超声药物输送应用中具有很大的前景。在血管范围内振荡的微气泡可导致毛细血管壁上的微流以及局部法向和剪切应力3。在高声压下，大振幅振荡可能导致微气泡塌陷，这称为惯性空化，进而可能导致血管破裂或内陷20。这些暴力现象可以诱导生物效应，例如超声手术21，增强治疗药物通过内皮壁（细胞旁或跨细胞）渗入间质。它还可以改善治疗剂通过富含基质的肿瘤的细胞外基质21，22 和生物膜23，24的渗透，尽管这种机制仍然知之甚少26。
超声介导的药物递送在临床前27，28 和临床试验中都显示出有希望的结果22。此外，当与相对低频超声（~1 MHz）一起使用时，据报道微气泡局部和短暂地增加了血脑屏障通透性，从而使药物能够在临床前和临床研究中进入脑实质29，30，31，32，33，34。
超声介导的药物递送通常有两种方法：治疗材料可以与气泡共同施用，或者可以附着在气泡壳中或装入气泡壳28，35，36。第二种方法已被证明在药物输送方面更有效37。微气泡可以装载药物或遗传物质，这些药物或遗传物质封装在附着在壳上的纳米颗粒（脂质体或聚合物纳米结构）中或直接掺入微气泡壳中35，36。纳米颗粒负载的微气泡可以通过（聚焦）超声波激活，以局部释放纳米颗粒有效载荷28，33，38，39，40。如果这种微气泡与细胞直接接触，则 在体外 已经表明，有效载荷甚至可以在称为声压印的过程中沉积到细胞细胞质膜上34，35。
微气泡谐振的超声参数空间广阔， 体内 生物条件进一步增加复杂性。因此，聚焦超声和纳米颗粒负载微气泡的组合在靶向治疗领域提出了挑战。
这项工作的目的是提供可用于详细成像微气泡响应作为超声参数函数的方案，并研究导致壳破裂和随后释放荧光标记的壳材料的机制。这组协议适用于含有荧光染料的外壳的微气泡。图1显示了SINTEF（挪威特隆赫姆）开发的聚合物纳米颗粒和蛋白质稳定微气泡的示意图。这些气泡充满全氟丙烷气体（C3F8），稳定外壳的纳米颗粒含有NR668，它是Nile Red荧光染料的亲脂衍生物38，43。纳米颗粒由聚（2-乙基丁基氰基丙烯酸酯）（PEBCA）组成，并被PEGylation.聚乙二醇（PEG）的功能化减少了单核吞噬细胞系统的调性和吞噬作用，从而延长了循环时间14，44。结果，PEGylation增加了到达目标位点的纳米颗粒的量，从而提高了处理的功效16。图2说明了使用四种显微镜方法如何使研究人员能够覆盖所有相关的时间和长度尺度。应该注意的是，光学显微镜中可实现的空间分辨率由衍射极限决定，衍射极限取决于光的波长和物镜的数值孔径（NA）以及物体照明源的数值孔径（NA）45。对于手头的系统，光学分辨率限制通常为200 nm。此外，活体显微镜检查可用于在亚细胞水平上成像46。对于这项工作中使用的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡，与活体显微镜相关的最小长度尺度是小毛细血管的大小（≥10μm）。描述了单个微气泡的体外高速光学成像（每秒1000万帧）和高速荧光成像（每秒500，000帧）实验。纳秒时间尺度的高速明场成像适用于研究振动气泡的时间分辨径向动力学。相比之下，高速荧光显微镜允许直接可视化荧光标记纳米颗粒的释放。此外，可以使用Z-stack三维（3D）共聚焦显微镜和扫描电子显微镜（后者的协议不包括在当前工作中）来研究微气泡壳的结构。活体显微镜包括使用多光子显微镜对在背窗室中生长的肿瘤进行成像，以提供有关局部血流和荧光标记纳米颗粒在体内命运的实时信息47。这些显微镜方法的结合最终提供了对治疗微泡剂响应超声的行为的详细见解，无论是在体外还是在体内。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

微气泡造影剂在超声药物输送应用中具有很大的前景。将药物封装在纳米颗粒中可降低全身毒性并增加药物的循环时间。在微气泡辅助药物递送的新方法中，纳米颗粒被掺入微气泡壳中或微气泡壳上，从而能够通过超声波局部和触发释放纳米颗粒有效载荷。全面了解广阔超声参数空间内的释放机制对于高效和受控释放至关重要。这组提出的方案适用于具有含有荧光标记的外壳的微气泡。在这里，重点是装载聚（2-乙基丁基氰基丙烯酸酯）聚合物纳米颗粒的微气泡，掺杂了改性的尼罗河红染料。颗粒固定在变性的酪蛋白壳内。微气泡通过剧烈搅拌产生，在含有酪蛋白和纳米颗粒的液相中形成全氟丙烷气体的分散体，之后微气泡壳自组装。需要各种显微镜技术来表征纳米颗粒稳定微气泡在纳米颗粒释放过程的所有相关时间尺度上。纳米颗粒的荧光可以对单个微气泡进行共聚焦成像，揭示壳内的颗粒分布。使用明场显微镜以每秒1000万帧的速度进行 体外 超高速成像，可以深入了解响应超声共振的气泡动力学。最后，从气泡壳中释放的纳米颗粒最好通过荧光显微镜进行可视化，以每秒500，000帧的速度进行。为了表征 体内药物递送，在植入背侧皮褶窗室的肿瘤中使用活体显微镜研究脉管系统内纳米颗粒的触发释放及其在内皮层之外的外渗，时间范围为几分钟。这些互补表征技术的结合为微气泡的行为及其有效载荷在 体外 和 体内的时间和长度尺度上的释放提供了独特的见解。

按照协议中所述产生的微气泡使用各种显微镜方法和各种时间尺度进行分析。
共聚焦显微镜中纳米颗粒的荧光（图6A）表明壳具有不均匀的颗粒分布。其他显微镜方法可用于气泡表征。例如， 图6B 显示了使用扫描电子显微镜的微气泡的整体结构，如先前的工作34所示。
径向动力学和现象学气泡行为可以使用所描述的 体外 明场显微镜方法进行研究，其中微气泡以每秒1000万帧的速度成像。单个微气泡的半径是使用内部编写的脚本随着时间的推移提取的。这种径向响应的示例如图 7所示。
如图8A所示，典型成功纳米颗粒递送的图像序列，如第2.3.6节所述。当激光到达气泡时，可以看到嵌入微气泡壳中的纳米颗粒由于荧光而发光。在超声共振的驱动下，荧光纳米颗粒从微气泡的气芯中分离出来，沉积在样品支架的膜上。最后，激光关闭，荧光纳米颗粒不再被激发。微气泡的荧光标记有效载荷的不成功传递通常看起来像图8B中所示的图像序列，其中荧光纳米颗粒在微气泡的外壳上发光，在超声暴露期间保持完整。
采用超声实时活体内多光子显微镜检查，研究了超声和微气泡对血液中纳米颗粒行为的影响，增强了肿瘤血管的通透性，改善了纳米颗粒的递送。可以表征渗透到细胞外基质中的程度和动力学，作为声压，频率和脉冲长度的函数。超声治疗的效果可能因血管的大小和形态以及由此产生的气泡限制而异。超声波治疗如何影响血流和方向可以确定。 图9 显示了纳米颗粒随时间推移的外渗的示例实验，机械指数（MI）为0.826。活体内多光子显微镜的结果阐明了超声暴露过程中纳米颗粒的空间和时间外渗，这对于完全了解超声介导的纳米颗粒递送机制并优化此类技术非常有益26。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> 图1：变性酪蛋白中具有荧光标记的聚合物纳米颗粒壳的微气泡的示意图。微气泡的直径通常在1μm到10μm之间。纳米颗粒的直径大多在100nm和200nm38之间。缩写：C3F8 = 全氟丙烷气体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> 图 2：示意图，显示了明场显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜和活体显微镜的相关时间和长度尺度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> 图3：明场显微镜实验的示意图， （A）实验设置，（B）时序图，（C）典型的记录框架。比例尺 （C） = 10 μm。缩写：fps = 每秒帧数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> 图4：荧光显微镜实验的示意图。 （A）实验设置，（B）时序图，和（C）典型记录帧。比例尺 （C） = 10 μm。缩写：fps = 每秒帧数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> 图5：活体显微镜实验的示意图， （A）实验设置，（B）时序图，（C）典型的记录框架。比例尺 （C） = 50 μm。绿色对应于葡聚糖-FITC，红色对应于纳米颗粒。缩写：GaAsP = 砷化镓磷化物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> 图6：单个纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的3D结构 （A）使用共聚焦显微镜显示纳米颗粒，（B）使用扫描电子显微镜显示3D结构。（二）经34许可转载。（A） 中的比例尺 = 5 μm;（B） 中的比例尺 = 2 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> 图7：在1 MHz的超声频率和142 kPa的声压振幅下，2.89μm半径的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的典型球形振荡。比例尺 = 5 μm，红线表示初始半径。照明曲线（任意单位）由黄色表示。放大倍率为 120 倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> 图8：来自高速荧光显微镜的图像序列。 （A）在2 MHz的超声频率和600 kPa的声压振幅下，成功递送纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的荧光标记纳米颗粒。（B）在2 MHz的超声频率和210 kPa的声压振幅下发出的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的荧光标记纳米颗粒的递送不成功。比例尺 = 10 μm。放大倍率为 120 倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> 图9：纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡在1 MHz的超声频率和800 kPa的声压振幅下进行振动显微镜检查 （A）容器内的纳米颗粒，以及（B）由白色虚线正方形指示的区域的图像序列，描绘了葡聚糖（绿色）和纳米颗粒（红色）的外渗。比例尺 = 50 μm。放大倍率为 20 倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

所提出的方案可用于表征为超声触发的药物递送应用而设计的荧光标记微气泡的反应，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 用于 捕获相关长度和时间尺度的 体外和体内 显微镜技术。

用于表征用于超声触发药物释放的荧光标记微气泡的多时间尺度显微镜方法

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

该协议可用于表征荧光标记微气泡的反应，这些微气泡设计用于超声触发的药物递送应用，包括激活机制和生物效应。关键在于成像技术的结合，这使我们能够在不同的空间尺度和不同的时间尺度上解开超声波触发的气泡药物递送的多尺度问题。对于通过明场显微镜进行的单气泡成像，放置一个19号通气针，并使用配备19号针头的一毫升注射器将少量微气泡悬浮液从玻璃瓶中除去到小管中，以便在下一步中更容易移液。使用移液器，将微气泡溶液稀释在过滤的磷酸盐缓冲盐水中。使用10毫升注射器将样品注入样品架的一个出口，直到支架充满而不会产生气泡，必要时注入更多样品。关闭样品架的两个阀门，并将样品架垂直于显微镜的光轴放置。在样品分析之前，在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压，并从样品架一角的视场开始，使用XYZ载物台移动支架以定位显微镜视野中的单个微泡，然后将连接到水浴的光纤连接到频闪灯并开始记录。根据超声设置，根据需要多次重复成像，将样品架移动到包含未声速微气泡的视野中，以进行每次分析。对于微气泡的荧光显微成像，在如图所示稀释磷酸盐缓冲盐水中的微气泡溶液后，在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压，并在脉冲延迟发生器上设置激光的触发延迟，用于从微气泡中激发纳米颗粒的荧光，然后使用XYZ载物台移动样品架以定位单个微气泡并将它们带入焦点 目标，然后触发记录。根据需要通过改变超声设置并将样品架移动到新的视野来重复成像，如图所示。对于活体显微镜成像，首先将加热的动物支架放置在波导和物镜之间的XY定位台上，并向波导中加入耦合凝胶。将尾静脉导管插入麻醉的含肿瘤小鼠的尾静脉中，并将装有窗室的小鼠放入加热的支架中。在盖玻片上加入水滴。为了可视化肿瘤组织脉管系统，静脉注射30微升每毫升4毫克荧光标记的2兆道尔顿葡聚糖到尾静脉导管中，并使用XY平移阶段移动小鼠，直到可以找到具有合适血管的视野。根据实验参数调整帧速率，视野和记录长度，并记录容器的基线图像。获取基线图像后，在任意波形发生器上设置超声驱动频率、脉冲长度和声压幅度，并静脉注射50微升微气泡样品到尾静脉中。然后如图所示对脉管系统进行成像。通过共聚焦荧光显微镜对微气泡进行分析，揭示了微气泡壳的不均匀颗粒分布。微气泡的整体结构可以通过扫描电子显微镜进一步可视化。通过明场显微镜分析不均匀微气泡的径向动力学和现象学行为，可以评估微气泡半径随时间变化的相对变化。在这里，显示了典型成功递送荧光标记纳米颗粒的图像序列。嵌入微气泡壳中的纳米颗粒可以观察到激光到达气泡时发出荧光。然而，正如在这种不成功的递送中观察到的那样，荧光纳米颗粒照射在微气泡的外壳上，其在超声暴露期间保持完整。活体多光子成像可用于确定超声暴露期间纳米颗粒的空间和时间外渗，这有利于理解和优化超声介导的纳米颗粒递送机制。通过在所有长度和时间尺度上对光学和声学通路进行完美排列，可以全面了解超声触发的药物递送。我们的多尺度实验提供的答案现在将被转化为临床实践。这些结果将为包括癌症治疗在内的一系列治疗应用提供有价值的见解。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

单层的合成，装配和表征蛋白质单分子膜的电化学保护的金纳米粒子薄膜

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

科研

生物工程

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

创建的胶粘剂和可溶性梯度荧光显微镜成像细胞迁移

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

模型和方法来评价药物输送系统在整个细胞屏障的运输

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

方法表征的共同发展生物膜和生境异质性

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

交变磁场敏感的混合明胶微凝胶药物控释

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

对干燥空气-LC接口Megamolecular生物大分子的自我整合方法

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

用 Widefield 高含量分析系统实现荧光标记组织的自动滑动扫描和分割

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

用三种互补方法综合评价胎盘靶向药物的有效性和安全性

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

用利穆鲁布莱巴细胞裂解液 (lal) 法检测纳米配方中的内毒素

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

枯草芽孢杆菌中细菌体和内膜的可视化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...