Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Forskellige optiske mikroskopi metoder blev kombineret for at få oplysninger om de forskellige trin i leveringen af nanopartikler fra overfladen af mikrobubbles til det omgivende medium. Imaging af boblen svingninger blev udført, samt billeddannelse af frigivelsen af nanopartikler fra boblen shell, ekstravasation, og penetration gennem den ekstracellulære matrix af tumorer in vivo. In vitro imaging muliggør screening af mange ultralydsparametre sammenlignet med de mere komplekse in vivo-opsætninger . Fordelen ved at kombinere denne vifte af billeddannelsesmetoder er de komplementære oplysninger, der kan fås på forskellige tidshorisonter - en funktion, der er afgørende for at karakterisere og optimere mikroboblerne til vellykket levering og for at opnå terapeutisk effekt. Denne tilgang er nyttig til at forstå leveringsmekanismerne for alle mikrobobler, herunder konstruktioner med fluorescerende mærkede nanopartikler og lægemidler.
De mest kritiske trin i mikroskopi metoder, der anvendes til at studere enkelt mikrobobler er som følger. For fluorescensmikroskopi bør nanopartiklerne fluorescerende mærkes for at muliggøre visualisering af partikelfrigivelsen. Desuden bør prøveopløsningen fortyndes nok til at isolere enkelte mikrobobler til analyse i konfokale, lyse felt- og fluorescensmikroskopimetoder. Derudover er det vigtigt at vælge en ultralydskørselsfrekvens og akustisk tryk for at ophidse boblerne mest effektivt, nemlig ved deres resonans. Hvis forskningsspørgsmålet vedrører levering af nanopartiklernes nyttelast, bør de relevante ultralydsparametre være en del af undersøgelsen. Ved siden af resonans, disse bobler bør også køres på eller ud over deres tærskel for nanopartikler frigivelse, typisk ved relativt højt akustisk tryk amplituder (MI > 0,3)51. For lys-felt mikroskopi billeddannelse, er det afgørende at vælge en højhastigheds-kamera med en tilstrækkelig høj framerate at minimere motion blur og for at undgå aliasing.
Bright-field mikroskopi er hovedsageligt begrænset af billeddannelse framerate og intensiteten af lyskilder til rådighed, som en højere framerate ville give en mere detaljeret tid-løst indsigt i boblen dynamik, men kræver mere intens belysning på grund af kortere eksponeringstider. For at studere partikeludslip mere detaljeret kan rammehastigheden for fluorescensbilleddannelse i princippet øges ved at øge laserlysets intensitet. Men absorptionen af det højintensive laserlys ved fluorescerende mærkede mikrobobler genererer varme, selv med højt kvanteudbyttefarvestoffer. Denne varme kan forstyrre de eksperimenter, der er på spil, og i ekstreme tilfælde fremkalde foto-termisk kavitation52. Således er der i praksis en grænse for den anvendte laser fluence. Men, intens laser belysning kan også bevidst bruges til at fremkalde partikel frigivelse fra liposomer53. Temperatur påvirker boble dynamik og ultralyd respons, afhængigt af boble type54. Hvis in vitro- og intravitale metoder skal sammenlignes objektivt, bør de in vitro-metoder, der er beskrevet i protokollen, derfor udføres ved 37 °C. En anden begrænsning af de in vitro-metoder, der er diskuteret i det aktuelle papir, er, at boblerne ikke er i et frit feltmiljø, da mikrobubbles vil flyde under prøveholdermembranen. Desuden er der et valg bias, når billeddannelse enkelte mikrobobler. Men udførelse af gentagne eksperimenter på enkeltbobler giver mulighed for at undersøge effekten af størrelse og fjernelse af den forvirrende faktor-størrelsesfordelingen. Hvis bobleresponset som en funktion af størrelse kan forstås, mens koncentrationen ikke er for høj til at forhindre boblebobleinteraktioner, kan svaret fra enhver vilkårlig boblepopulation beregnes. Endelig giver både lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder indsigt i mikrobobler, der er indviklet i et todimensionelt (2D) billede. Hvis forskningsspørgsmålet kræver mere end 2D-billeddannelse, kan boblernes 3D-funktionsmåde løses ved at kombinere den opsætning, der er beskrevet i protokollen, med en sideviewopsætning til multiplanbilledbilled55.
En alternativ metode til at studere mikrobubbles er akustisk karakterisering56. Men måling af ekkoet af en enkelt mikrobobble kræver lokalisering og isolering af en enkelt mikrobobble i ultralydsstrålen56, hvilket udgør en udfordring, der typisk tackles ved brug af et smalt rør eller optisk eller akustisk pincet57,58. For at størrelse bobler akustisk, mikrobobler kan insonified i den geometriske spredning regime ved frekvenser meget højere end deres resonans frekvens, som ikke fremkalde volumetrisk microbubble svingninger59. Brugen af et "akustisk kamera" er en sådan metode til at afbilde den radiale dynamik af enkelte mikrobubbles som reaktion på ultralyd, hvori en højfrekvent ultralydsonde bruges til at bestemme boblens radiale respons til en lavfrekvent kørselsbølge60. Ulempen ved denne metode er, at den kun kan bruges til at bestemme den relative ændring af mikrobobbleradius; derfor er der behov for en anden metode til at bestemme den absolutte bobleradius, f.eks. Ulempen ved metoder, hvori mikrobubbles udsættes for ultralyd ved frekvenser højere end deres resonansfrekvens, er, at penetrationsdybden ved så høje frekvenser reduceres59, hvilket begrænser anvendeligheden for in vivo-applikationer. Andre former for mikroskopi kan også anvendes til at studere mikrobobler såsom scanning elektronmikroskopi, atomprøvesprængning mikroskopi, og transmission elektron mikroskopi63. Den opnåelige spatio-temporal opløsning af disse alternative mikroskopi teknikker, dog, er generelt mere begrænset, og disse teknikker har den ulempe, at billeddannelse udføres enten før eller efter ultralyd eksponering ved off-line analyse og typisk præsentere en lav gennemløb63. Et andet alternativ er at bruge en let spredningsmetode, som kan bruges til at studere radial dynamik af enkelte mikrobobler i realtid, men har et lavt signal til støjforhold sammenlignet med akustiske spredningsmetoder64.
Real-time intravital mikroskopi under ultralyd eksponering er en kraftfuld metode til at erhverve ny indsigt i vaskulatur, adfærd mikrobobler, nanopartikler, eller andre molekyler (såsom dextran i dette tilfælde) under ultralyd eksponering. En generel begrænsning, når der udføres intravital mikroskopi i realtid, er, at kun et lille område af vævet er afbildet, og lysets indtrængningsdybde i væv er begrænset. Hvis de afbildede fartøjer indeholder meget få mikrobobler og/eller nanopartikler inden for synsfeltet, kan der kun opnås få eller ingen oplysninger om nanopartiklernes adfærd og ekstravasation. Derudover er en korrekt tilpasning mellem lys- og ultralydsstier afgørende på grund af det begrænsede synsfelt. Hvis ultralydstrykket er højt nok til at fremkalde bobledestruktion, er det også vigtigt at vælge en pulsgentagelsesfrekvens, der gør det muligt for friske bobler at reperfuse ind i synsfeltet mellem ultralydsimpulser. Da ultralyden vil blive reflekteret fra dækglasset i vindueskammeret og målet, er det vigtigt at placere transduceren i en vinkel for at reducere refleksioner for at forhindre dannelsen af stående bølger, som forvrænger det kalibrerede trykfelt. Et andet praktisk problem er, at opsætningen skal have tilstrækkelig plads til at montere ultralydtransducer og waveguide over eller under målet i mikroskopopsætningen. Tumorerne i det dorsale vindue kammer vil have en begrænset tykkelse på grund af begrænsende kammer og dækslet slip; Hvis det er nødvendigt, kan der dog anvendes andre modeller. Eksempler er skinfold tumorer, for eksempel i bryst fedt pad65 eller abdominal intravital billeddannelse af tumorer i de forskellige organer66. Sådanne tumorer kan dyrkes orthotopically i passende mikromiljø, og som sådan, præsentere en mere klinisk relevant tilfælde.
De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, oplyser potentialet i fluorescerende mærkede mikrobobler for at studere de grundlæggende elementer i lægemiddelleveringsapplikationer ved hjælp af bobler og ultralyd. Denne kombination af mikroskopi metoder giver værdifuld indsigt i mikrobobble respons på ultralyd insonation og dens tilhørende akustiske parameter plads og præsenterer et klart overblik over mikrobobble og nyttelast adfærd over en relevant række tid og længde skalaer.

Ultralyd er den mest udbredte medicinske billeddannelsesteknik. Det er ikke-invasiv, hurtig, sikker, omkostningseffektiv, og bærbar1,2,3. Men, blod er en dårlig ultralyd scatterer, og kontrasten i blodpuljen kan forbedres ved en intravenøs injektion af ultralyd kontrast agenter3. Denne forbedrede kontrast i blodpølen gør det muligt at kvantificere organperfusion til diagnostiske formål, f.eks. Faktisk tumor vaskulatur viste sig at være en vigtig prognostisk faktor6. En stor forskningsindsats er nu rettet mod mikrobobble-assisteret, målrettet molekylær billeddannelse og skræddersy kontrastmidler til terapeutisk brug.
Kommercielt tilgængelige ultralyd kontrastmidler består typisk af en suspension af coatede mikrobubbles7,8 med diametre fra 1 μm til 10 μm9. Da ultralyd kontrast agent mikrobubbles er lidt mindre end røde blodlegemer7, mikrobobler kan sikkert nå selv de mindste kapillærer uden at skabe en okklusion3. Mikrobubbles har en dramatisk øget ultralyd backscattering koefficient i forhold til væv10, på grund af deres komprimerbare gas kerne11. Desuden er mikrobobble echo meget ikke-lineært, dvs. dets spektrum indeholder harmoniske og underharmonikere af kørefrekvensen. Derudover er ekkostyrken stærkt afhængig af boblens resonante respons12. Mens væv spredes kun lineært, et lille antal mikrobobler er tilstrækkelig til at opnå en høj detektion følsomhed i harmonisk billeddannelse13,14. Denne ikke-lineære kontrast generation kan endda være stærk nok til at spore enkelte bobler i kroppen15.
Skallen af ultralyd kontrast agent stabiliserer boblerne mod opløsning og sammenhold, hvilket øger deres omsætning tid i blodpuljen16. Skallen kan bestå af lipider, polymerer, eller denaturerede proteiner3,8. Det mindsker den interfaciale spænding og begrænser dermed effekten af Laplace trykdrevet opløsning17 og skaber en resistiv barriere mod gasspredning18. For yderligere at øge stabiliteten er kontrastmikrobubblerne typisk fyldt med en høj molekylvægtgas med lav opløselighed i blodet11. Mikrobobble shell dramatisk ændrer reaktionen af mikrobobler til ultralyd insonation11. Ubestrøgne gasbobler har en karakteristisk resonansfrekvens, der er omvendt proportional med deres størrelse, og tilsætning af en lipidbelægning øger resonansfrekvensen i forhold til en ubestrøget buble på grund af skallens indre stivhed3. Desuden spreder skallen energi gennem dilatationsviskositet, som udgør den dominerende kilde til dæmpning for coatede bobler3. Den stabiliserende skal har den ekstra fordel, at den kan funktionaliseres, f.eks. ved at binde målretning ligands til overfladen af mikrobobler. Denne målretning muliggør mange applikationer til disse bobler og især molekylær billeddannelse med ultralyd14,19.
Microbubble kontrast agenter holder store løfte for narkotika levering applikationer med ultralyd. Microbubbles oscillerende i indespærring af et blodkar kan forårsage mikrostreaming samt lokale normale og forskydning understreger på kapillær væg3. Ved høje akustiske tryk kan store amplitudssvingninger føre til mikrobubble kollaps i en voldelig proces kaldet inertiel kavitation, hvilket igen kan føre til brud eller invagination af blodkarret20. Disse voldelige fænomener kan fremkalde bioeffekter såsom sonopermeation21, øge ekstravasation af terapeutiske lægemidler i interstitium på tværs af endotelvæggen, enten paracellulært eller transcellulært. Det kan også forbedre indtrængen af terapeutiske midler gennem den ekstracellulære matrix af stroma-rige tumorer21,22 og biofilm23,24, selv om denne mekanisme er stadig dårligt forstået26.
Ultralyd-medieret lægemiddellevering har vist lovende resultater både præklinisk27,28 og i kliniske forsøg22. Desuden, når de anvendes med relativt lavfrekvente ultralyd (~ 1 MHz), mikrobobler er blevet rapporteret til lokalt og forbigående øge blod - hjerne barriere permeabilitet, hvilket gør det muligt for lægemidler at komme ind i hjernen parenkym, både i prækliniske og kliniske undersøgelser29,30,31,32,33,34.
Der er generelt to tilgange til ultralyd-medieret lægemiddellevering: Det terapeutiske materiale kan administreres sammen med boblerne, eller det kan fastgøres til eller indlæses i bobleskallen28,35,36. Den anden tilgang har vist sig at være mere effektiv med hensyn til narkotikalevering37. Mikrobobler kan lastes med lægemidler eller genetisk materiale indkapslet i nanopartikler (liposomer eller polymere nanokonstruktioner), der er fastgjort til skallen eller indarbejdet direkte i mikrobobbleskallen35,36. Nanopartikler-loaded mikrobubbles kan aktiveres ved (fokuseret) ultralyd til lokalt at frigive nanopartikler nyttelast28,33,38,39,40. Hvis en sådan mikrobobble er i direkte kontakt med en celle, har det vist sig in vitro, at nyttelasten endda kan deponeres på cellen cytoplasmisk membran i en proces kaldet sonoprinting34,35.
Ultralyd parameter plads til microbubble insonation er omfattende, og in vivo biologiske forhold yderligere tilføje kompleksitet. Således udgør kombinationen af fokuseret ultralyd og nanopartikler-loaded mikrobubbles en udfordring inden for målrettet terapi.
Formålet med dette arbejde er at levere protokoller, der kan bruges til at afbilde, i detaljer, respons af mikrobobler som en funktion af ultralydsparametrene og at studere de mekanismer, der fører til shell brud og efterfølgende frigivelse af fluorescerende mærket shell materiale. Dette sæt protokoller gælder for mikrobobler med skaller, der indeholder et fluorescerende farvestof. Figur 1 viser en skematisk repræsentation af de polymer-nanopartikler og protein stabiliserede mikrobobler udviklet på SINTEF (Trondheim, Norge). Disse bobler er fyldt med perfluoropropan gas (C3F8) og nanopartikler, der stabiliserer skallen indeholder NR668, som er en lipophilic derivat af Nile Red fluorescerende dye38,43. Nanopartiklerne består af poly(2-ethyl-butylcyanisacrylat) (PEBCA) og er PEGylated. Funktionalisering med polyethylenglycol (PEG) reducerer opsonisering og fagocytose ved mononuklear phagocytsystemet og forlænger derved cirkulationstiden14,44. Som følge heraf øger PEGylation mængden af nanopartikler, der når målstedet, hvilket forbedrer effekten af behandlingen16. Figur 2 illustrerer, hvordan brugen af fire mikroskopimetoder gør det muligt for forskere at dække alle relevante tids- og længdeskalaer. Det skal bemærkes, at den rumlige opløsning, der kan opnås ved optisk mikroskopi, bestemmes af diffraktionsgrænsen, som afhænger af bølgelængden af den lette og numeriske blænde (NA) af målet og objektbelysningskilden45. For de foreliggende systemer er den optiske opløsningsgrænse typisk 200 nm. Derudover kan intravital mikroskopi bruges til at afbilde på det subcellulære niveau46. For de nanopartikler og proteinstabiliserede mikrobobler, der anvendes i dette arbejde, er den mindste længdeskala, der er relevant for intravital mikroskopi, størrelsen af små kapillærer (≥10 μm). In vitro high-speed optisk billeddannelse (10 millioner billeder i sekundet) og højhastigheds fluorescens imaging (500.000 billeder i sekundet) eksperimenter er beskrevet for enkelt mikrobobler. Højhastigheds lys-felt billeddannelse på nanosekund tidsskalaer er egnet til at studere den tid-løst radiale dynamikken i de vibrerende bobler. I modsætning hertil giver højhastighedsbio fluorescensmikroskopi mulighed for direkte visualisering af frigivelsen af de fluorescerende mærkede nanopartikler. Desuden kan strukturen af mikrobobble shell undersøges ved hjælp af Z-stack tre-dimensionelle (3D) konfokal mikroskopi, og scanning elektronmikroskopi (protokollen for sidstnævnte er ikke inkluderet i det nuværende arbejde). Intravital mikroskopi består i at bruge multiphoton mikroskopi til billede tumorer vokser i dorsale vindueskamre til at give real-time oplysninger om lokal blodgennemstrømning og om skæbnen for fluorescerende-mærket nanopartikler in vivo47. Kombinationen af disse mikroskopi metoder i sidste ende giver detaljeret indsigt i adfærd terapeutiske mikrobubble agenter som reaktion på ultralyd, både in vitro og in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Microbubble kontrast agenter holder store løfte for narkotika levering applikationer med ultralyd. Indkapsling af lægemidler i nanopartikler reducerer systemisk toksicitet og øger cirkulationstiden for stofferne. I en ny tilgang til mikrobubble-assisteret lægemiddellevering er nanopartikler indarbejdet i eller på mikrobubbleskaller, hvilket muliggør lokal og udløst frigivelse af nanopartiklernes nyttelast med ultralyd. En grundig forståelse af frigivelsesmekanismerne inden for det store ultralydsparameterrum er afgørende for effektiv og kontrolleret frigivelse. Dette sæt af præsenterede protokoller gælder for mikrobobler med en skal indeholdende en fluorescerende etiket. Her er der fokus på mikrobobler fyldt med poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylat) polymere nanopartikler, dopet med et modificeret Nilrødt farvestof. Partiklerne er fastgjort i en denatureret kasein shell. Mikroboblerne produceres ved kraftig omrøring, der danner en spredning af perfluoropropan gas i væskefasen, der indeholder kasein og nanopartikler, hvorefter mikrobobbleskallen selv samler sig. En række mikroskopi teknikker er nødvendige for at karakterisere nanopartikler-stabiliseret mikrobobler på alle relevante tidshorisonter af nanopartikler frigivelsesprocessen. Fluorescens af nanopartikler muliggør konfokal billeddannelse af enkelte mikrobobler, der afslører partikelfordelingen i skallen. In vitro ultra-high-speed imaging ved hjælp af bright-field mikroskopi på 10 millioner billeder i sekundet giver indsigt i boblen dynamik som reaktion på ultralyd insonation. Endelig nanopartikler frigivelse fra boblen shell er bedst visualiseret ved hjælp af fluorescens mikroskopi, udført på 500.000 billeder i sekundet. For at karakterisere lægemiddellevering in vivo studeres den udløste frigivelse af nanopartikler i vaskulaturen og deres ekstravasation ud over etdotellaget ved hjælp af intravital mikroskopi i tumorer implanteret i dorsale hudfold vindueskamre over en tidshorisont på flere minutter. Kombinationen af disse komplementære karakteriseringsteknikker giver unik indsigt i mikroboblernes adfærd og deres nyttelastfrigivelse på en række tids- og længdeskalaer, både in vitro og in vivo.

Mikroboblerne, der blev produceret som beskrevet i protokollen, blev analyseret ved hjælp af forskellige mikroskopimetoder og på forskellige tidsskalaer.
Nanopartiklernes fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerer, at skallen har en ikke-ensartet partikelfordeling. Andre mikroskopi metoder kan bruges til boble karakterisering. For eksempel viser figur 6B mikrobubbles overordnede struktur ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, som præsenteret i tidligere arbejde34.
Radial dynamik og fænomenologisk boble adfærd kan studeres ved hjælp af den beskrevne in vitro lyse felt mikroskopi metode, hvori mikrobubbles blev afbildet på 10 millioner billeder i sekundet. Radius af enkelt mikrobobler blev udvundet over tid ved hjælp af et script skrevet in-house. Et eksempel på et sådant radialt respons er vist i figur 7.
En billedsekvens af typisk vellykket nanopartikler, som beskrevet i punkt 2.3.6, er vist i figur 8A. Nanopartiklerne indlejret i mikrobobbleskallen kan ses at lyse op på grund af fluorescens, når laserlyset når boblen. Drevet af ultralydssonation løsner de fluorescerende nanopartikler sig fra mikroboblernes gaskerne og deponeres på prøveholderens membran. Endelig er laseren slukket, og de fluorescerende nanopartikler er ikke længere begejstrede. Mislykket levering af mikroboblernes fluorescerende nyttelast ligner typisk billedsekvensen vist i figur 8B, hvor de fluorescerende nanopartikler lyser op på skallen af mikrobobble, der forbliver intakt under ultralydseksponering.
Real-time intravital multiphoton mikroskopi under ultralyd blev brugt til at undersøge virkningerne af ultralyd og mikrobobler på nanopartikler adfærd i blodet, forbedring af permeabiliteten af tumor blodkar, og forbedring af leveringen af nanopartikler. Omfanget og kinetikken af indtrængning i den ekstracellulære matrix som funktion af akustisk tryk, frekvens og pulslængder kan karakteriseres. Effekten af ultralydsbehandlingen kan variere med hensyn til fartøjernes størrelse og morfologi og deraf følgende indespærring af boblen. Hvordan ultralydsbehandlingen påvirker blodgennemstrømningen og retningen, kan bestemmes. Et eksempelforsøg, der viser ekstravasation af nanopartikler over tid, er vist i figur 9 ved et mekanisk indeks (MI) på 0,826. Resultaterne af intravital multiphotonmikroskopi belyser den rumlige og tidsmæssige ekstravasation af nanopartikler under ultralydseksponering, hvilket er yderst gavnligt for den fuldstændige forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for ultralydmedieret levering af nanopartikler og for at optimere sådanne teknologier26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af en mikrobobble med en skal af fluorescerende mærkede polymere nanopartikler i denatureret kasein. Mikroboblerne er typisk mellem 1 μm og 10 μm i diameter. Nanopartiklerne har en diameter for det meste mellem 100 nm og 200 nm38. Forkortelse: C3F8 = perfluoropropan gas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk oversigt, der viser de relevante tids- og længdeskalaer for lyse felt, fluorescens, konfokal og intravital mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figur 3: Skematisk repræsentation af lysfeltmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer pr. sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figur 4: Skematisk repræsentation af fluorescensmikroskopiforsøg. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer pr. sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figur 5: Skematisk repræsentation af intravitale mikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 50 μm. Grøn svarer til dextran-FITC og rød til nanopartikler. Forkortelse: GaAsP = gallium arsenidfosphid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figur 6: 3D-struktur af en enkelt nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble. (A) Brug af konfokal mikroskopi til at vise nanopartiklerne og (B) ved hjælp af et scanningselektronmikroskop til at vise 3D-strukturen. B) er gengivet med tilladelse fra 34. Vægtstang i (A) = 5 μm; skalalinje i (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figur 7: Typiske sfæriske svingninger af en 2,89 μm radius nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble insonified ved en ultralydsfrekvens på 1 MHz og en akustisk tryk amplitud på 142 kPa. (A-D) Billeder fra højhastighedsoptagelsen og den tilsvarende bobleradius over tidskurven (nederst). Skalastænger = 5 μm, og den røde linje angiver den oprindelige radius. Belysningsprofilen (vilkårlige enheder) er angivet med gul. Forstørrelsen er 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figur 8: Billedsekvens fra højhastighedsstofstofcensmikroskopi. (A) Vellykket levering af fluorescerende mærkede nanopartikler af en nanopartikler og proteinstabiliseret mikrobobble insoneret ved en ultralydsfrekvens på 2 MHz og en akustisk tryk amplitud på 600 kPa. (B) Mislykket levering af fluorescerende mærkede nanopartikler af en nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble insonified ved en ultralydsfrekvens på 2 MHz og en akustisk tryk amplitud på 210 kPa. Skalastænger = 10 μm. Forstørrelsen er 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figur 9: Intravital mikroskopi efter insonation af nanopartikler-og-protein-stabiliserede mikrobobler ved en ultralydsfrekvens på 1 MHz og en akustisk tryk amplitud på 800 kPa. (A) Nanopartikler i fartøjet, og (B) et billede sekvens af det område, der er angivet af den hvide stiplede firkant i (A) skildrer ekstravasation af dextran (grøn) og nanopartikler (rød). Skalastænger = 50 μm. Forstørrelsen er 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

De præsenterede protokoller kan bruges til at karakterisere reaktionen af fluorescerende-mærket mikrobobler designet til ultralyd-udløste lægemiddellevering applikationer, herunder deres aktiveringsmekanismer samt deres biovirkninger. Dette papir dækker en række in vitro - og in vivomikroskopiteknikker , der udføres for at fange de relevante længder og tidshorisonter.

Multi-timescale mikroskopi metoder til karakterisering af fluorescerende-mærket Microbubbles for Ultralyd-udløst Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Denne protokol kan bruges til at karakterisere reaktionen af fluorescerende mærket mikrobobler, der er designet til ultralyd-udløste lægemiddellevering applikationer, som omfatter aktiveringsmekanismer og biovirkninger. Nøglen ligger i kombinationen af billeddannelsesteknikker, som giver os mulighed for at optrævle det multi-skala problem med ultralyds-udløst lægemiddellevering med bobler, både på forskellige rumlige skalaer og på forskellige tidsskalaer. For enkelt boble imaging af Brightfield mikroskopi, placere en 19 gauge udluftning nål og bruge en en milliliter sprøjte udstyret med en 19 gauge nål til at fjerne en lille mængde af mikrokøb suspension fra glas hætteglasset i et lille rør for lettere pipettering i næste trin.Ved hjælp af en pipette fortyndes mikrobubbleopløsningen i filtreret fosfatbufferet saltvand. Brug en sprøjte på 10 milliliter til at injicere prøven i én udgang i prøveholderen, indtil holderen er fuld, uden at der dannes luftbobler, og om nødvendigt injiceres mere af prøven. Luk begge prøveholderens ventiler, og sæt prøveholderen vinkelret på mikroskopets optiske akse.Før prøveanalysen skal du indstille den ønskede ultralydskørselsfrekvens og akustiske tryk på den vilkårlige bølgeformgenerator og starte med synsfeltet i et hjørne af prøveindehaveren, bruge XYZ-stadiet til at flytte holderen til at lokalisere enkelte mikrobubbles i synsfeltet for mikroskopet, derefter vedhæfte en optisk fiber forbundet til et vandbad til et strobelys og starte optagelsen. Gentag billeddannelsen så mange gange som ønsket pr. ultralydsindstilling, og træk prøveindehaveren mindst to millimeter til et synsfelt, der indeholder unsonerede mikrobubbles til hver analyse. For fluorescens mikroskopisk billeddannelse af mikrobobler, efter fortynding af mikrobobbleopløsningen i fosfat buffered saltvand som demonstreret, indstille den ønskede ultralyd kørefrekvens og akustisk tryk på den vilkårlige bølgeform generator og indstille udløser forsinkelsen for laseren på puls forsinkelse generator for fluorescens excitation af nanopartikler fra mikrobobler, derefter bruge XYZ fase til at flytte prøve indehaveren til at lokalisere enkelt mikrobobler og bringe dem i fokus for målet, og udløse derefter optagelsen.Gentag billeddannelsen som ønsket ved at ændre ultralydsindstillingerne og flytte prøveindehaveren til det nye synsfelt som demonstreret. Til billeddannelse ved intravital mikroskopi skal du først placere en opvarmet dyreholder på XY-positioneringsstadiet mellem bølgestyret og målet og tilføje koblingsgel til bølgeguiden. Sæt en hale vene kateter i hale venen af en bedøvet tumor-bærende mus og placere musen udstyret med et vindue kammer i den opvarmede holder.Tilsæt en vanddråbe til dækslet. For at visualisere tumorvæv vaskulatur, intravenøst injicere 30 mikroliter af fire milligram per milliliter fluorescerende mærket 2 megadalton dextran i halen venekateter og bruge XY oversættelse fase til at flytte musen, indtil et synsfelt med egnede blodkar kan lokaliseres. Juster billedhastigheden, synsfeltet og længden af optagelsen i overensstemmelse med parametrene for eksperimentet, og registrer oprindelige billeder af fartøjerne.Når baseline billeder er blevet erhvervet, indstille ultralyd kørefrekvens, puls længde, og akustisk tryk amplitud på den vilkårlige bølgeform generator og intravenøst injicere 50 mikroliters af mikrobobble prøve i halevenen. Så billede vaskulaturen som demonstreret. Analyse af mikrobobler ved konfokal fluorescensmikroskopi afslører en ikke-ensartet partikelfordeling af mikrobubbleskallen.Mikroboblernes overordnede struktur kan visualiseres yderligere ved at scanne elektronmikroskopi. Analyse af den radiale dynamik og fænomenologiske adfærd insonificeret mikrobobble af Brightfield mikroskopi tillader værdiansættelse af den relative ændring i mikrobobble radius over tid. Her vises en billedsekvens af en typisk vellykket levering af fluorescerende mærkede nanopartikler.Nanopartiklerne indlejret i mikrobobbleskallen kan observeres til fluorescens, når laserlyset når boblen. Som observeret i denne mislykkede levering lyser de fluorescerende nanopartikler imidlertid på skallen af mikrobubble, som forbliver intakt under ultralydseksponeringen. Intravital multi-foton imaging kan bruges til at bestemme den rumlige og tidsmæssige ekstravasation af nanopartikler under ultralydseksponering, hvilket kan være gavnligt for at forstå og optimere de mekanismer, der ligger til grund for ultralydmedieret nanopartikler levering.Med den perfekte justering af de optiske og akustiske veje på alle længde- og tidsskalaer gives et omfattende indblik i ultralydsudløst lægemiddellevering. Svarene fra vores multi-skala eksperimenter vil nu blive oversat til klinisk praksis. Resultaterne vil give værdifuld indsigt for en række terapeutiske anvendelser, herunder kræftbehandling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder til karakterisering af fælles udvikling af Biofilm og nye levesteder

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Vekslende magnetfelt-Responsive Hybrid Gelatine Mikrogeler for Controlled Drug frigivelse

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Metoder til Self-integration af Megamolecular Biopolymers på Tørring Air-LC-grænseflade

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatiseret dias Scanning og segmentering i Fluorescently mærket væv ved hjælp af en Widefield høj-indhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering af effektiviteten og sikkerheden af moderkagen-målrettet medicinafgivelse ved hjælp af tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering af Germinosomes og den indre membran i Bacillus subtilis sporer

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...