Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Verschillende optische microscopiemethoden werden gecombineerd om informatie te verkrijgen over de verschillende stappen in de afgifte van nanodeeltjes van het oppervlak van microbubbels naar het omringende medium. Beeldvorming van de bellenoscillaties werd uitgevoerd, evenals beeldvorming van de afgifte van de nanodeeltjes uit de bellenschil, de extravasatie en de penetratie door de extracellulaire matrix van tumoren in vivo. In vitro beeldvorming maakt screening van veel ultrasone parameters mogelijk in vergelijking met de meer complexe in vivo opstellingen. Het voordeel van het combineren van deze reeks beeldvormingsmodaliteiten is de aanvullende informatie die op verschillende tijdschalen kan worden verkregen - een functie die cruciaal is om de microbubbels te karakteriseren en te optimaliseren voor een succesvolle bevalling en om therapeutische werkzaamheid te verkrijgen. Deze aanpak is nuttig om de afgiftemechanismen voor alle microbubbels te begrijpen, inclusief constructies met fluorescerend gelabelde nanodeeltjes en medicijnen.
De meest kritieke stappen in de microscopiemethoden die worden gebruikt om enkele microbubbels te bestuderen, zijn als volgt. Voor fluorescentiemicroscopie moeten de nanodeeltjes fluorescerend worden gelabeld om visualisatie van de deeltjesafgifte mogelijk te maken. Bovendien moet de monsteroplossing voldoende worden verdund om afzonderlijke microbubbels te isoleren voor analyse in confocale, helderveld- en fluorescentiemicroscopiemethoden. Daarnaast is het belangrijk om een ultrasone rijfrequentie en akoestische druk te kiezen om de bellen het meest efficiënt te prikkelen, namelijk bij hun resonantie. Als de onderzoeksvraag betrekking heeft op de levering van de nanodeeltjeslading, moeten de juiste ultrasone parameters deel uitmaken van het onderzoek. Naast resonantie moeten deze bellen ook op of boven hun drempel voor het vrijkomen van nanodeeltjes worden aangedreven, meestal bij relatief hoge akoestische drukamplitudes (MI > 0,3)51. Voor bright-field microscopiebeelden is het van cruciaal belang om een hogesnelheidscamera te kiezen met een voldoende hoge framerate om bewegingsonscherpte te minimaliseren en aliasing te voorkomen.
Bright-field microscopie wordt voornamelijk beperkt door de beeldframerate en intensiteit van beschikbare lichtbronnen, omdat een hogere framerate een gedetailleerder tijdsgeoploeteerd inzicht in de beldynamiek zou geven, maar een intensere verlichting vereist vanwege kortere belichtingstijden. Om de afgifte van deeltjes in meer detail te bestuderen, kan de framerate voor fluorescentiebeeldvorming in principe worden verhoogd door de intensiteit van het laserlicht te verhogen. Absorptie van het laserlicht met hoge intensiteit door de fluorescerend gelabelde microbubbels genereert echter warmte, zelfs met kleurstoffen met een hoge kwantumopbrengst. Deze hitte kan de experimenten die op het spel staan verstoren en in extreme gevallen fotothermische cavitatie veroorzaken52. In de praktijk is er dus een limiet aan de toegepaste laserfluence. Intense laserverlichting kan echter ook opzettelijk worden gebruikt om deeltjesafgifte van liposomen te induceren53. Temperatuur beïnvloedt de bubbeldynamiek en ultrasone respons, afhankelijk van het type bubbel54. Als in vitro en intravitale methoden objectief moeten worden vergeleken, moeten de in het protocol besproken in vitro methoden daarom bij 37 °C worden uitgevoerd. Een andere beperking van de in vitro methoden die in het huidige artikel worden besproken, is dat de bellen zich niet in een vrije veldomgeving bevinden, omdat microbubbels onder het membraan van de monsterhouder zullen zweven. Bovendien is er een selectiebias bij het afbeelden van enkele microbubbels. Het uitvoeren van herhaalde experimenten op enkele bellen maakt het echter mogelijk om het effect van grootte en verwijdering van de verstorende factor - de grootteverdeling - te onderzoeken. Als de belrespons als functie van grootte kan worden begrepen terwijl de concentratie niet te hoog is om bubbel-bubbelinteracties te voorkomen, kan de respons van een willekeurige bubbelpopulatie worden berekend. Ten slotte geven zowel bright-field- als fluorescentiemicroscopiemethoden inzicht in microbubbels die ingewikkeld zijn in een tweedimensionaal (2D) beeld. Als de onderzoeksvraag meer dan 2D-beeldvorming vereist, kan het 3D-gedrag van de bellen worden opgelost door de in het protocol beschreven opstelling te combineren met een zijaanzichtopstelling voor multiplane imaging55.
Een alternatieve methode om microbubbels te bestuderen is akoestische karakterisering56. Het meten van de echo van een enkele microbubbel vereist echter het lokaliseren en isoleren van een enkele microbubbel in de ultrasone straal56, wat een uitdaging vormt die meestal wordt aangepakt door het gebruik van een smalle buis of een optisch of akoestisch pincet57,58. Om bubbels akoestisch te dimensioneren, kunnen de microbubbels worden geïnsoneerd in het geometrische verstrooiingsregime op frequenties die veel hoger zijn dan hun resonantiefrequentie, wat geen volumetrische microbubbeloscillaties induceert59. Het gebruik van een "akoestische camera" is zo'n methode om de radiale dynamiek van enkele microbubbels in beeld te brengen als reactie op echografie, waarbij een hoogfrequente ultrasone sonde wordt gebruikt om de radiale respons van de bel op een laagfrequente aandrijfgolf te bepalen60. Het nadeel van deze methode is dat deze alleen kan worden gebruikt om de relatieve verandering van de microbubbelradius te bepalen; daarom is een andere methode nodig om de absolute belstraal te bepalen, bijvoorbeeld door middel van optische beeldvorming61,62. Het nadeel van methoden waarbij microbubbels worden blootgesteld aan echografie bij frequenties hoger dan hun resonantiefrequentie is dat bij dergelijke hoge frequenties de penetratiediepte wordt verminderd59, waardoor de bruikbaarheid voor in vivo toepassingen wordt beperkt. Andere vormen van microscopie kunnen ook worden gebruikt om microbubbels te bestuderen, zoals scanning elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie63. De haalbare spatio-temporele resolutie van deze alternatieve microscopietechnieken is echter over het algemeen beperkter en deze technieken hebben het nadeel dat beeldvorming vóór of na ultrasone blootstelling wordt uitgevoerd door middel van offline analyse en meestal een lage doorvoer vertoont63. Een ander alternatief is om een lichtverstrooiingsmethode te gebruiken, die kan worden gebruikt om de radiale dynamica van enkele microbubbels in realtime te bestuderen, maar een lage signaal-ruisverhouding heeft in vergelijking met akoestische verstrooiingsmethoden64.
Real-time intravitale microscopie tijdens ultrasone blootstelling is een krachtige methode om nieuw inzicht te krijgen in de vasculatuur, het gedrag van microbubbels, nanodeeltjes of andere moleculen (zoals dextran in dit geval) tijdens ultrasone blootstelling. Een algemene beperking bij het uitvoeren van real-time intravitale microscopie is dat slechts een klein deel van het weefsel in beeld wordt gebracht en de penetratiediepte van het licht in het weefsel beperkt is. Als de afgebeelde vaten zeer weinig microbubbels en/of nanodeeltjes binnen het gezichtsveld bevatten, kan weinig of geen informatie over het gedrag en de extravasatie van de nanodeeltjes worden verkregen. Daarnaast is vanwege het beperkte gezichtsveld een goede uitlijning tussen de licht- en echografiepaden cruciaal. Als de ultrasone druk hoog genoeg is om bellenvernietiging te induceren, is het ook belangrijk om een pulsherhalingsfrequentie te kiezen waarmee verse bellen tussen ultrasone pulsen in het gezichtsveld kunnen komen. Bovendien, omdat de echografie wordt gereflecteerd door het afdekglas in de raamkamer en het objectief, is het belangrijk om de transducer onder een hoek te plaatsen om reflecties te verminderen om de vorming van staande golven te voorkomen, die het gekalibreerde drukveld vervormen. Een ander praktisch probleem is dat de opstelling voldoende ruimte moet hebben om de ultrasone transducer en golfgeleider boven of onder het objectief in de microscoopopstelling te monteren. De tumoren in de dorsale vensterkamer hebben een beperkte dikte vanwege de beperkende kamer en de afdekplaat; indien nodig kunnen echter andere modellen worden gebruikt. Voorbeelden zijn huidplooitumoren, bijvoorbeeld in het borstvetkussen65 of abdominale intravitale beeldvorming van tumoren in de verschillende organen66. Dergelijke tumoren kunnen orthotopisch worden gekweekt in de juiste micro-omgeving en als zodanig een meer klinisch relevant geval presenteren.
De methoden die in dit werk worden beschreven, verlichten het potentieel van fluorescerend gelabelde microbubbels om de fundamenten van medicijnafgiftetoepassingen te bestuderen met behulp van bubbels en echografie. Deze combinatie van microscopiemethoden biedt waardevol inzicht in de microbubbelrespons op ultrasone insonatie en de bijbehorende akoestische parameterruimte en geeft een duidelijk beeld van het microbubbel- en payloadgedrag over een relevant bereik van tijd- en lengteschalen.

Echografie is de meest gebruikte medische beeldvormingstechniek. Het is niet-invasief, snel, veilig, kosteneffectief en draagbaar1,2,3. Bloed is echter een slechte ultrasone verstrooier en het contrast van de bloedpool kan worden versterkt door een intraveneuze injectie van ultrasone contrastmiddelen3. Dit verbeterde bloedpoolcontrast maakt de kwantificering van orgaanperfusie voor diagnostische doeleinden mogelijk, bijvoorbeeld bij de detectie van coronaire hartziekte4 en gemetastaseerde leverziekte5. Inderdaad, tumor vasculatuur bleek een belangrijke prognostische factor te zijn6. Een grote onderzoeksinspanning is nu gericht op microbubbel-geassisteerde, gerichte moleculaire beeldvorming en het op maat maken van contrastmiddelen voor therapeutisch gebruik.
In de handel verkrijgbare ultrasone contrastmiddelen bestaan meestal uit een suspensie van gecoate microbubbels7,8 met diameters variërend van 1 μm tot 10 μm9. Omdat microbubbels van ultrasoon contrastmiddel iets kleiner zijn dan rode bloedcellen7, kunnen de microbubbels zelfs de kleinste haarvaten veilig bereiken zonder een occlusie te creëren3. Microbubbels hebben een dramatisch verhoogde ultrasone backscatteringscoëfficiënt in vergelijking met weefsel10, vanwege hun samendrukbare gaskern11. Bovendien is de microbubbelecho zeer niet-lineair, d.w.z. het spectrum bevat harmonischen en subharmonieën van de aandrijffrequentie. Daarnaast is de echosterkte sterk afhankelijk van de resonantierespons van de bubble12. Hoewel weefsel slechts lineair verstrooit, is een klein aantal microbubbels voldoende om een hoge detectiegevoeligheid te bereiken in harmonische beeldvorming13,14. Deze niet-lineaire contrastgeneratie kan zelfs sterk genoeg zijn om enkele bellen in het lichaam te volgen15.
De schil van het ultrasone contrastmiddel stabiliseert de bellen tegen ontbinding en coalescentie, waardoor hun circulatietijd in de bloedpool toeneemt16. De schil kan bestaan uit lipiden, polymeren of gedenatureerde eiwitten3,8. Het vermindert de interfaciale spanning, waardoor het effect van Laplace drukgestuurde oplossing17 wordt beperkt en een resistieve barrière tegen gasdiffusie wordt gecreëerd18. Om de stabiliteit verder te verhogen, worden de contrastmicrobubbels meestal gevuld met een gas met een hoog molecuulgewicht en een lage oplosbaarheid in bloed11. De microbubbelschaal verandert de reactie van de microbubbels op ultrasone insonatie drastisch11. Ongecoate gasbellen hebben een karakteristieke resonantiefrequentie die omgekeerd evenredig is met hun grootte en de toevoeging van een lipidecoating verhoogt de resonantiefrequentie ten opzichte van die van een ongecoate buble vanwege de intrinsieke stijfheid van de schaal3. Bovendien dissipeert de schaal energie door dilatatieviscositeit, die de dominante bron van demping vormt voor gecoate bellen3. De stabiliserende schaal heeft als bijkomend voordeel dat deze kan worden gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld door gerichte liganden aan het oppervlak van microbubbels te binden. Deze targeting maakt vele toepassingen voor deze bubbels mogelijk en in het bijzonder moleculaire beeldvorming met echografie14,19.
Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Microbubbels die oscilleren in de opsluiting van een bloedvat kunnen microstreaming veroorzaken, evenals lokale normale en schuifspanningen op de capillaire wand3. Bij hoge akoestische druk kunnen grote amplitude-oscillaties leiden tot microbubbelinstorting in een gewelddadig proces dat traagheidsholtatie wordt genoemd, wat op zijn beurt kan leiden tot breuk of invaginatie van het bloedvat20. Deze gewelddadige verschijnselen kunnen bio-effecten veroorzaken zoals sonopermeatie21, waardoor de extravasatie van therapeutische geneesmiddelen in het interstitium over de endotheelwand wordt verbeterd, paracellulair of transcellulair. Het kan ook de penetratie van therapeutische middelen verbeteren via de extracellulaire matrix van stromarijke tumoren21,22 en biofilms23,24, hoewel dit mechanisme nog steeds slecht wordt begrepen26.
Echografie-gemedieerde medicijnafgifte heeft veelbelovende resultaten laten zien, zowel preklinisch27,28 als in klinische onderzoeken22. Bovendien is gemeld dat microbubbels bij gebruik met relatief laagfrequente echografie (~ 1 MHz) lokaal en tijdelijk de bloed-hersenbarrièredoorlaatbaarheid verhogen, waardoor geneesmiddelen het hersenparenchym kunnen binnendringen, zowel in preklinische als klinische studies29,30,31,32,33,34.
Er zijn over het algemeen twee benaderingen voor echografie-gemedieerde medicijnafgifte: het therapeutische materiaal kan gelijktijdig met de bubbels worden toegediend, of het kan worden bevestigd aan of geladen in de bubbelschaal28,35,36. De tweede benadering is efficiënter gebleken in termen van medicijnafgifte37. Microbubbels kunnen worden geladen met geneesmiddelen of genetisch materiaal ingekapseld in nanodeeltjes (liposomen of polymere nanoconstructen) die aan de schaal zijn bevestigd of direct in de microbubbelschaal zijn opgenomen35,36. Microbubbels met nanodeeltjes kunnen worden geactiveerd door (gerichte) echografie om de nanodeeltjeslading lokaal vrij te geven28,33,38,39,40. Als zo'n microbubbel in direct contact staat met een cel, is in vitro aangetoond dat de lading zelfs op het cytoplasmatische membraan van de cel kan worden afgezet in een proces dat sonoprinting wordt genoemd34,35.
De ultrasone parameterruimte voor microbubbelinsonatie is uitgebreid en de in vivo biologische omstandigheden voegen de complexiteit verder toe. De combinatie van gerichte echografie en microbubbels met nanodeeltjes vormt dus een uitdaging op het gebied van gerichte therapieën.
Het doel van dit werk is om protocollen te bieden die kunnen worden gebruikt om de respons van microbubbels in detail in beeld te brengen als een functie van de ultrasone parameters en om de mechanismen te bestuderen die leiden tot shell-ruptuur en daaropvolgende afgifte van het fluorescerend gelabelde shell-materiaal. Deze set protocollen is van toepassing op microbubbels met schelpen die een fluorescerende kleurstof bevatten. Figuur 1 toont een schematische weergave van de polymere-nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels ontwikkeld bij SINTEF (Trondheim, Noorwegen). Deze bellen zijn gevuld met perfluorpropaangas (C3F8) en de nanodeeltjes die de schaal stabiliseren bevatten NR668, een lipofiel derivaat van Nijlrood fluorescerende kleurstof38,43. De nanodeeltjes bestaan uit poly(2-ethyl-butylcyanoacrylaat) (PEBCA) en zijn PEGylated. Functionalisatie met polyethyleenglycol (PEG) vermindert opsonisatie en fagocytose door het mononucleaire fagocytensysteem, waardoor de circulatietijd wordt verlengd14,44. Als gevolg hiervan verhoogt PEGylation de hoeveelheid nanodeeltjes die de doellocatie bereiken, waardoor de werkzaamheid van de behandeling wordt verbeterd16. Figuur 2 illustreert hoe het gebruik van vier microscopiemethoden onderzoekers in staat stelt om alle relevante tijd- en lengteschalen te bestrijken. Opgemerkt moet worden dat de ruimtelijke resolutie die haalbaar is in optische microscopie wordt bepaald door de diffractielimiet, die afhankelijk is van de golflengte van het licht en het numerieke diafragma (NA) van het objectief en die van de objectverlichtingsbron45. Voor de systemen bij de hand is de optische resolutielimiet meestal 200 nm. Bovendien kan intravitale microscopie worden gebruikt om op subcellulair niveau in beeld te brengen46. Voor de nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels die in dit werk worden gebruikt, is de minimale lengteschaal die relevant is voor intravitale microscopie de grootte van kleine haarvaten (≥10 μm). In vitro high-speed optische beeldvorming (10 miljoen frames per seconde) en high-speed fluorescentie beeldvorming (500.000 frames per seconde) experimenten worden beschreven voor enkele microbubbels. High-speed bright-field imaging op nanoseconde tijdschalen is geschikt om de tijd-opgeloste radiale dynamiek van de trillende bellen te bestuderen. Daarentegen maakt snelle fluorescentiemicroscopie directe visualisatie mogelijk van de afgifte van de fluorescerend gelabelde nanodeeltjes. Bovendien kan de structuur van de microbubbelschaal worden onderzocht met behulp van Z-stack driedimensionale (3D) confocale microscopie en scanning elektronenmicroscopie (het protocol voor de laatste is niet opgenomen in het huidige werk). Intravitale microscopie bestaat uit het gebruik van multifotonenmicroscopie om tumoren die groeien in dorsale vensterkamers in beeld te brengen om real-time informatie te verstrekken over de lokale bloedstroom en over het lot van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes in vivo47. De combinatie van deze microscopiemethoden geeft uiteindelijk gedetailleerd inzicht in het gedrag van therapeutische microbubbelmiddelen in reactie op echografie, zowel in vitro als in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Het inkapselen van geneesmiddelen in nanodeeltjes vermindert de systemische toxiciteit en verhoogt de circulatietijd van de geneesmiddelen. In een nieuwe benadering van microbubbel-geassisteerde medicijnafgifte worden nanodeeltjes opgenomen in of op microbubbelschalen, waardoor lokale en geactiveerde afgifte van de nanodeeltjeslading met echografie mogelijk is. Een grondig begrip van de afgiftemechanismen binnen de enorme ultrasone parameterruimte is cruciaal voor een efficiënte en gecontroleerde afgifte. Deze set gepresenteerde protocollen is van toepassing op microbubbels met een schaal met een fluorescerend label. Hier ligt de focus op microbubbels geladen met poly (2-ethyl-butylcyanoacrylaat) polymere nanodeeltjes, gedopeerd met een gemodificeerde Nijlrode kleurstof. De deeltjes worden gefixeerd in een gedenatureerde caseïneschil. De microbubbels worden geproduceerd door krachtig roeren, waardoor een dispersie van perfluorpropaangas in de vloeibare fase wordt gevormd die caseïne en nanodeeltjes bevat, waarna de microbubbelschaal zichzelf assembleert. Een verscheidenheid aan microscopietechnieken zijn nodig om de nanodeeltjesgestabiliseerde microbubbels te karakteriseren op alle relevante tijdschalen van het nanodeeltjesafgifteproces. Fluorescentie van de nanodeeltjes maakt confocale beeldvorming van enkele microbubbels mogelijk, waardoor de deeltjesverdeling in de schaal wordt onthuld. In vitro ultrasnelle beeldvorming met behulp van bright-field microscopie met 10 miljoen frames per seconde geeft inzicht in de beldynamiek in reactie op ultrasone insonatie. Ten slotte kan het vrijkomen van nanodeeltjes uit de bellenschil het best worden gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie, uitgevoerd met 500.000 frames per seconde. Om de toediening van geneesmiddelen in vivo te karakteriseren, wordt de geactiveerde afgifte van nanodeeltjes in de vasculatuur en hun extravasatie buiten de endotheellaag bestudeerd met behulp van intravitale microscopie in tumoren die zijn geïmplanteerd in dorsale huidplooivensterkamers, over een tijdschaal van enkele minuten. De combinatie van deze complementaire karakteriseringstechnieken biedt uniek inzicht in het gedrag van microbubbels en hun payload-afgifte op een reeks tijd- en lengteschalen, zowel in vitro als in vivo.

De microbubbels, geproduceerd zoals beschreven in het protocol, werden geanalyseerd met behulp van verschillende microscopiemethoden en op verschillende tijdschalen.
De fluorescentie van de nanodeeltjes in confocale microscopie (figuur 6A) geeft aan dat de schil een niet-uniforme deeltjesverdeling heeft. Andere microscopiemethoden kunnen worden gebruikt voor bubbelkarakterisering. Figuur 6B toont bijvoorbeeld de algemene structuur van de microbubbel met behulp van scanning elektronenmicroscopie, zoals gepresenteerd in eerder werk34.
Radiale dynamica en fenomenologisch bellengedrag kunnen worden bestudeerd met behulp van de beschreven in vitro bright-field microscopiemethode waarbij microbubbels werden afgebeeld met 10 miljoen frames per seconde. De straal van enkele microbubbels werd in de loop van de tijd geëxtraheerd met behulp van een intern geschreven script. Een voorbeeld van een dergelijke radiale respons is weergegeven in figuur 7.
Een beeldreeks van typische succesvolle toediening van nanodeeltjes, zoals beschreven in punt 2.3.6, is weergegeven in figuur 8A. De nanodeeltjes die in de microbubbelschaal zijn ingebed, kunnen worden gezien om op te lichten als gevolg van fluorescentie wanneer het laserlicht de bel bereikt. Aangedreven door ultrasone insonatie komen de fluorescerende nanodeeltjes los van de gaskern van de microbubbels en worden ze afgezet op het membraan van de monsterhouder. Ten slotte wordt de laser uitgeschakeld en worden de fluorescerende nanodeeltjes niet meer opgewonden. Mislukte levering van de fluorescerend gelabelde lading van de microbubbels ziet er meestal uit als de beeldsequentie in figuur 8B, waar de fluorescerende nanodeeltjes oplichten op de schaal van de microbubbel die intact blijft tijdens ultrasone blootstelling.
Real-time intravitale multifotonenmicroscopie tijdens echografie werd gebruikt om de effecten van echografie en microbubbels op het gedrag van nanodeeltjes in het bloed, verbetering van de permeabiliteit van tumorbloedvaten en verbetering van de afgifte van nanodeeltjes te onderzoeken. De mate en kinetiek van penetratie in de extracellulaire matrix als functie van akoestische druk, frequentie en pulslengtes kan worden gekarakteriseerd. Het effect van de ultrasone behandeling kan variëren met betrekking tot de grootte en morfologie van de bloedvaten en de daaruit voortvloeiende opsluiting van de bel. Hoe de ultrasone behandeling de bloedstroom en -richting beïnvloedt, kan worden bepaald. Een voorbeeldexperiment dat de extravasatie van nanodeeltjes in de loop van de tijd laat zien, is weergegeven in figuur 9 met een mechanische index (MI) van 0,826. Resultaten van intravitale multifotonenmicroscopie verduidelijken de ruimtelijke en temporele extravasatie van nanodeeltjes tijdens ultrasone blootstelling, wat zeer gunstig is voor het volledige begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan echogeleide toediening van nanodeeltjes en om dergelijke technologieën te optimaliseren26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van een microbubbel met een schil van fluorescerend gelabelde polymere nanodeeltjes in gedenatureerde caseïne. De microbubbels zijn meestal tussen 1 μm en 10 μm in diameter. De nanodeeltjes hebben een diameter meestal tussen 100 nm en 200 nm38. Afkorting: C3F8 = perfluorpropaangas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figuur 2: Schematisch overzicht met de relevante tijd- en lengteschalen voor bright-field, fluorescentie, confocale en intravitale microscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figuur 3: Schematische weergave van experimenten met bright-field microscopie. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 10 μm. Afkorting: fps = frames per seconde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figuur 4: Schematische weergave van fluorescentiemicroscopie-experimenten. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 10 μm. Afkorting: fps = frames per seconde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figuur 5: Schematische weergave van intravitale microscopie-experimenten. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 50 μm. Groen komt overeen met dextran-FITC en rood met nanodeeltjes. Afkorting: GaAsP = galliumarsenide fosfide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figuur 6: 3D-structuur van een enkele nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel. (A) Confocale microscopie gebruiken om de nanodeeltjes te tonen en (B) een scanning-elektronenmicroscoop gebruiken om de 3D-structuur te tonen. (B) is gereproduceerd met toestemming van34. Schaalbalk in (A) = 5 μm; schaalbalk in (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figuur 7: Typische bolvormige oscillaties van een nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel met een straal van 2,89 μm met een ultrasone frequentie van 1 MHz en een akoestische drukamplitude van 142 kPa. (A-D) Beelden van de opname met hoge snelheid en de bijbehorende belstraal over de tijdcurve (onder). Schaalbalken = 5 μm en de rode lijn geeft de beginradius aan. Het verlichtingsprofiel (willekeurige eenheden) wordt geel aangegeven. De vergroting is 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figuur 8: Beeldsequentie van snelle fluorescentiemicroscopie. (A) Succesvolle levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes van een nanodeeltje-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbel geïnsoneerd bij een ultrasone frequentie van 2 MHz en een akoestische drukamplitude van 600 kPa. (B) Mislukte levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes van een nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel geïnsoneerd bij een ultrasone frequentie van 2 MHz en een akoestische drukamplitude van 210 kPa. Schaalbalken = 10 μm. De vergroting is 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figuur 9: Intravitale microscopie na insonatie van nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbels bij een ultrasone frequentie van 1 MHz en een akoestische drukamplitude van 800 kPa. (A) Nanodeeltjes in het vat, en (B) een beeldsequentie van het gebied aangegeven door het witte streepjesvierkant in (A) met de extravasatie van dextran (groen) en nanodeeltjes (rood). Schaalbalken = 50 μm. De vergroting is 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

De gepresenteerde protocollen kunnen worden gebruikt om de respons van fluorescerend gelabelde microbubbels te karakteriseren die zijn ontworpen voor toepassingen met echografie-geactiveerde medicijnafgifte, inclusief hun activeringsmechanismen en hun bio-effecten. Dit artikel behandelt een reeks in vitro en in vivo microscopietechnieken die worden uitgevoerd om de relevante lengte en tijdschalen vast te leggen.

Multi-timescale microscopiemethoden voor de karakterisering van fluorescerend gelabelde microbubbels voor echografie-getriggerde medicijnafgifte

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Dit protocol kan worden gebruikt om de respons te karakteriseren van fluorescerend gelabelde microbubbels die zijn ontworpen voor echografie-geactiveerde medicijnafgiftetoepassingen die de activeringsmechanismen en bio-effecten omvatten. De sleutel ligt in de combinatie van beeldvormingstechnieken die ons in staat stelt om het multi-schaal probleem van ultrasoon getriggerde medicijnafgifte met bubbels te ontrafelen, zowel op verschillende ruimtelijke schalen als op verschillende tijdschalen. Voor beeldvorming met één bel door Brightfield-microscopie plaatst u een ontluchtingsnaald van 19 gauge en gebruikt u een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 19 gauge om een kleine hoeveelheid van de microbubbelsuspensie uit de glazen injectieflacon in een kleine buis te verwijderen voor gemakkelijker pipetteren in de volgende stap.Verdun met behulp van een pipet de microbubbeloplossing in gefilterde fosfaat gebufferde zoutoplossing. Gebruik een spuit van 10 milliliter om het monster in één uitlaat van de monsterhouder te injecteren totdat de houder vol is zonder luchtbellen te creëren, en injecteer indien nodig meer van het monster. Sluit beide kleppen van de monsterhouder en plaats de monsterhouder loodrecht op de optische as van de microscoop.Stel vóór de monsteranalyse de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in op de willekeurige golfvormgenerator en begin met het gezichtsveld in een hoek van de monsterhouder, gebruik de XYZ-trap om de houder te bewegen om enkele microbubbels in het gezichtsveld van de microscoop te lokaliseren, bevestig vervolgens een optische vezel die is aangesloten op een waterbad op een stroboscooplamp en start de opname. Herhaal de beeldvorming zo vaak als gewenst per ultrasone instelling en verplaats de monsterhouder ten minste twee millimeter naar een gezichtsveld met ongesoniceerde microbubbels voor elke analyse. Voor fluorescentie microscopische beeldvorming van de microbubbels, na het verdunnen van de microbubbeloplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing zoals gedemonstreerd, stelt u de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in op de willekeurige golfvormgenerator en stelt u de triggervertraging voor de laser in op de pulsvertragingsgenerator voor fluorescentie-excitatie van de nanodeeltjes van de microbubbels, en gebruikt u vervolgens de XYZ-fase om de monsterhouder te bewegen om enkele microbubbels te lokaliseren en ze in de focus van het doel en activeer vervolgens de opname.Herhaal de beeldvorming naar wens door de ultrasone instellingen te wijzigen en de monsterhouder naar het nieuwe gezichtsveld te verplaatsen zoals gedemonstreerd. Voor beeldvorming door intravitale microscopie plaatst u eerst een verwarmde dierhouder op de XY-positioneringsfase tussen de golfgeleider en het objectief en voegt u koppelingsgel toe aan de golfgeleider. Plaats een staartaderkatheter in de staartader van een verdoofde tumordragende muis en plaats de muis met een vensterkamer in de verwarmde houder.Voeg een waterdruppel toe aan de deklip. Om de vasculatuur van het tumorweefsel te visualiseren, injecteert u intraveneus 30 microliter van vier milligram per milliliter fluorescerend gelabeld 2 megadalton dextran in de staartaderkatheter en gebruikt u de XY-translatiefase om de muis te bewegen totdat een gezichtsveld met geschikte bloedvaten kan worden gelokaliseerd. Pas de framesnelheid, het gezichtsveld en de lengte van de opname aan volgens de parameters van het experiment en neem basislijnbeelden van de vaten op.Wanneer de basislijnbeelden zijn verkregen, stelt u de ultrasone rijfrequentie, pulslengte en akoestische drukamplitude in op de willekeurige golfvormgenerator en injecteert u intraveneus 50 microliter microbubbelmonster in de staartader. Stel je dan de vasculatuur voor zoals gedemonstreerd. Analyse van de microbubbels door confocale fluorescentiemicroscopie onthult een niet-uniforme deeltjesverdeling van de microbubbelschaal.De totale structuur van de microbubbels kan verder worden gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie. Analyse van de radiale dynamica en het fenomenologische gedrag van geïnsoneerde microbubbel door Brightfield-microscopie maakt de waardering van de relatieve verandering in de microbubbelstraal in de loop van de tijd mogelijk. Hier wordt een beeldsequentie getoond van een typische succesvolle levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes.De nanodeeltjes ingebed in de microbubbelschaal kunnen worden waargenomen om te fluoresceren wanneer het laserlicht de bel bereikt. Zoals waargenomen bij deze mislukte levering, lichten de fluorescerende nanodeeltjes echter op de schaal van de microbubbel, die intact blijft tijdens de ultrasone blootstelling. Intravitale multi-foton beeldvorming kan worden gebruikt om de ruimtelijke en temporele extravasatie van de nanodeeltjes tijdens ultrasone blootstelling te bepalen, wat gunstig kan zijn voor het begrijpen en optimaliseren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan echografie-gemedieerde nanodeeltjesafgifte.Met de perfecte uitlijning van de optische en akoestische paden op alle lengte- en tijdschalen, wordt een uitgebreid inzicht in echografie-getriggerde medicijnafgifte geboden. De antwoorden van onze multi-scale experimenten zullen nu worden vertaald naar de klinische praktijk. De resultaten zullen waardevolle inzichten bieden voor een reeks therapeutische toepassingen, waaronder kankertherapie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Wisselend magneetveld-Responsive Hybrid Gelatine Microgels voor Controlled Drug release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Methoden voor de Self-integratie van Megamolecular Biopolymeren op de drooglucht-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...