Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Différentes méthodes de microscopie optique ont été combinées pour obtenir des informations sur les différentes étapes de l’administration de nanoparticules de la surface des microbulles au milieu environnant. L’imagerie des oscillations de bulles a été réalisée, ainsi que l’imagerie de la libération des nanoparticules de la coquille de bulle, de l’extravasation et de la pénétration à travers la matrice extracellulaire des tumeurs in vivo. L’imagerie in vitro permet de dépister de nombreux paramètres échographiques par rapport aux configurations in vivo plus complexes. L’avantage de combiner cette gamme de modalités d’imagerie est l’information complémentaire qui peut être obtenue à différentes échelles de temps - une caractéristique cruciale pour caractériser et optimiser les microbulles pour une livraison réussie et pour obtenir une efficacité thérapeutique. Cette approche est utile pour comprendre les mécanismes d’administration de toutes les microbulles, y compris les constructions avec des nanoparticules et des médicaments marqués par fluorescence.
Les étapes les plus critiques des méthodes de microscopie utilisées pour étudier les microbulles simples sont les suivantes. Pour la microscopie à fluorescence, les nanoparticules doivent être marquées par fluorescence pour permettre la visualisation de la libération de particules. En outre, la solution d’échantillon doit être suffisamment diluée pour isoler des microbulles simples pour analyse dans des méthodes de microscopie confocale, à champ lumineux et à fluorescence. De plus, il est important de choisir une fréquence d’entraînement par ultrasons et une pression acoustique pour exciter les bulles le plus efficacement possible, à savoir à leur résonance. Si la question de recherche concerne la livraison de la charge utile de nanoparticules, les paramètres échographiques appropriés devraient faire partie de l’enquête. Outre la résonance, ces bulles doivent également être entraînées à leur seuil de libération de nanoparticules ou au-delà, généralement à des amplitudes de pression acoustique relativement élevées (MI > 0,3)51. Pour l’imagerie par microscopie en champ lumineux, il est essentiel de choisir une caméra haute vitesse avec une fréquence d’images suffisamment élevée pour minimiser le flou de mouvement et éviter l’aliasing.
La microscopie à champ lumineux est principalement limitée par la fréquence d’images et l’intensité des sources lumineuses disponibles, car une fréquence d’images plus élevée donnerait un aperçu plus détaillé de la dynamique des bulles, mais nécessiterait un éclairage plus intense en raison de temps d’exposition plus courts. Pour étudier plus en détail la libération de particules, la fréquence d’images pour l’imagerie par fluorescence peut, en principe, être augmentée en augmentant l’intensité de la lumière laser. Cependant, l’absorption de la lumière laser de haute intensité par les microbulles marquées par fluorescence génère de la chaleur, même avec des colorants à haut rendement quantique. Cette chaleur peut interférer avec les expériences en jeu et, dans les cas extrêmes, induire une cavitation photothermique52. Ainsi, dans la pratique, il y a une limite à la fluence laser appliquée. Cependant, l’éclairage laser intense peut également être délibérément utilisé pour induire la libération de particules par les liposomes53. La température influence la dynamique des bulles et la réponse des ultrasons, selon le type de bulle54. Par conséquent, si les méthodes in vitro et intravitales doivent être comparées objectivement, les méthodes in vitro décrites dans le protocole doivent être effectuées à 37 °C. Une autre limite des méthodes in vitro discutées dans le présent article est que les bulles ne sont pas dans un environnement de champ libre, car les microbulles flotteront sous la membrane du porte-échantillon. De plus, il existe un biais de sélection lors de l’imagerie de microbulles simples. Cependant, la réalisation d’expériences répétées sur des bulles simples permet d’étudier l’effet de la taille et l’élimination du facteur de confusion - la distribution de la taille. Si la réponse de la bulle en fonction de la taille peut être comprise alors que la concentration n’est pas trop élevée pour empêcher les interactions bulle-bulle, la réponse de toute population de bulles arbitraire peut être calculée. Enfin, les méthodes de microscopie à champ lumineux et à fluorescence donnent un aperçu des microbulles alambiquées dans une image bidimensionnelle (2D). Si la question de recherche nécessite plus que l’imagerie 2D, le comportement 3D des bulles peut être résolu en combinant la configuration décrite dans le protocole avec une configuration de vue latérale pour l’imagerie multiplan55.
Une autre méthode pour étudier les microbulles est la caractérisation acoustique56. Cependant, la mesure de l’écho d’une seule microbulle nécessite de localiser et d’isoler une seule microbulle dans le faisceau d’ultrasons56, ce qui pose un défi généralement relevé par l’utilisation d’un tube étroit ou d’une pince à épiler optique ou acoustique57,58. Pour dimensionner les bulles acoustiquement, les microbulles peuvent être insonifiées dans le régime de diffusion géométrique à des fréquences beaucoup plus élevées que leur fréquence de résonance, ce qui n’induit pas d’oscillations volumétriques de microbulles59. L’utilisation d’une « caméra acoustique » est une telle méthode pour imager la dynamique radiale de microbulles simples en réponse aux ultrasons, dans laquelle une sonde à ultrasons à haute fréquence est utilisée pour déterminer la réponse radiale de la bulle à une onde motrice à basse fréquence60. L’inconvénient de cette méthode est qu’elle ne peut être utilisée que pour déterminer le changement relatif du rayon des microbulles; par conséquent, une autre méthode est nécessaire pour déterminer le rayon absolu de la bulle, par exemple par imagerie optique61,62. L’inconvénient des méthodes dans lesquelles les microbulles sont exposées à des ultrasons à des fréquences supérieures à leur fréquence de résonance est qu’à des fréquences aussi élevées, la profondeur de pénétration est diminuée59, ce qui limite la facilité d’utilisation pour les applications in vivo. D’autres formes de microscopie peuvent également être utilisées pour étudier les microbulles telles que la microscopie électronique à balayage, la microscopie à force atomique et la microscopie électronique à transmission63. La résolution spatio-temporelle réalisable de ces techniques de microscopie alternatives est toutefois généralement plus limitée, et ces techniques présentent l’inconvénient que l’imagerie est effectuée avant ou après l’exposition aux ultrasons par analyse hors ligne et présente généralement un faible débit63. Une autre alternative consiste à utiliser une méthode de diffusion de la lumière, qui peut être utilisée pour étudier la dynamique radiale de microbulles simples en temps réel, mais qui a un faible rapport signal/bruit par rapport aux méthodes de diffusion acoustique64.
La microscopie intravitale en temps réel pendant l’exposition aux ultrasons est une méthode puissante pour acquérir de nouvelles connaissances sur la vascularisation, le comportement des microbulles, des nanoparticules ou d’autres molécules (telles que le dextran dans ce cas) lors de l’exposition aux ultrasons. Une limitation générale lors de la microscopie intravitale en temps réel est que seule une petite zone du tissu est imagée et que la profondeur de pénétration de la lumière dans les tissus est limitée. Si les vaisseaux imagés contiennent très peu de microbulles et/ou de nanoparticules dans le champ de vision, peu ou pas d’informations sur le comportement des nanoparticules et l’extravasation peuvent être obtenues. De plus, en raison du champ de vision limité, un bon alignement entre les chemins de la lumière et des ultrasons est crucial. Si la pression ultrasonore est suffisamment élevée pour induire la destruction des bulles, il est également important de choisir une fréquence de répétition d’impulsions qui permet aux bulles fraîches de se réapparaître dans le champ de vision entre les impulsions ultrasonores. De plus, comme les ultrasons seront réfléchis par le verre de couverture dans la chambre de la fenêtre et l’objectif, il est important de placer le transducteur à un angle afin de réduire les réflexions afin d’éviter la formation d’ondes stationnaires, qui déforment le champ de pression étalonné. Un autre problème pratique est que la configuration doit avoir suffisamment d’espace pour monter le transducteur à ultrasons et le guide d’ondes au-dessus ou au-dessous de l’objectif dans la configuration du microscope. Les tumeurs dans la chambre de la fenêtre dorsale auront une épaisseur limitée en raison de la chambre de confinement et du glissement de couverture; cependant, si nécessaire, d’autres modèles pourraient être utilisés. Des exemples sont les tumeurs du pli cutané, par exemple, dans le coussinet adipeux mammaire65 ou l’imagerie intravitale abdominale des tumeurs dans les différents organes66. De telles tumeurs peuvent être cultivées orthotopiquement dans le microenvironnement approprié et, en tant que telles, présentent un cas plus pertinent sur le plan clinique.
Les méthodes décrites dans ce travail éclairent le potentiel des microbulles marquées par fluorescence pour étudier les principes fondamentaux des applications d’administration de médicaments à l’aide de bulles et d’ultrasons. Cette combinaison de méthodes de microscopie fournit des informations précieuses sur la réponse des microbulles à l’insonation ultrasonore et son espace de paramètres acoustiques associé et présente une vue claire du comportement des microbulles et de la charge utile sur une plage pertinente d’échelles de temps et de longueur.

L’échographie est la technique d’imagerie médicale la plus utilisée. Il est non invasif, rapide, sûr, rentable et portable1,2,3. Cependant, le sang est un mauvais diffuseur d’ultrasons, et le contraste de la mare de sang peut être amélioré par une injection intraveineuse d’agents de contraste à ultrasons3. Ce contraste accru entre le sang et la masse sanguine permet de quantifier la perfusion d’organes à des fins diagnostiques, par exemple dans la détection de la maladie coronarienne4 et de la maladie hépatique métastatique5. En effet, la vascularisation tumorale s’est avérée être un facteur pronostique important6. Un effort de recherche majeur est maintenant orienté vers l’imagerie moléculaire ciblée assistée par microbulles et l’adaptation d’agents de contraste à usage thérapeutique.
Les agents de contraste à ultrasons disponibles dans le commerce consistent généralement en une suspension de microbulles revêtues7,8 de diamètres allant de 1 μm à 10 μm9. Étant donné que les microbulles d’agents de contraste à ultrasons sont légèrement plus petites que les globules rouges7, les microbulles peuvent atteindre en toute sécurité même les plus petits capillaires sans créer d’occlusion3. Les microbulles ont un coefficient de rétrodiffusion échographique considérablement accru par rapport aux tissus10, en raison de leur noyau de gaz compressible11. De plus, l’écho des microbulles est très non linéaire, c’est-à-dire que son spectre contient des harmoniques et des sous-harmoniques de la fréquence d’entraînement. De plus, la force de l’écho dépend fortement de la réponse résonnante de la bulle12. Alors que les tissus ne se dispersent que linéairement, un petit nombre de microbulles est suffisant pour atteindre une sensibilité de détection élevée en imagerie harmonique13,14. Cette génération de contraste non linéaire peut même être assez forte pour suivre les bulles simples dans le corps15.
La coquille de l’agent de contraste à ultrasons stabilise les bulles contre la dissolution et la coalescence, augmentant ainsi leur temps de circulation dans la piscine sanguine16. La coquille peut être constituée de lipides, de polymères ou de protéines dénaturées3,8. Il diminue la tension interfaciale, limitant ainsi l’effet de la dissolution sous pression de Laplace17 et crée une barrière résistive contre la diffusion de gaz18. Pour augmenter encore la stabilité, les microbulles de contraste sont généralement remplies d’un gaz de haut poids moléculaire avec une faible solubilité dans le sang11. La coquille de microbulles modifie radicalement la réponse des microbulles à l’insonation ultrasonore11. Les bulles de gaz non revêtues ont une fréquence de résonance caractéristique inversement proportionnelle à leur taille et l’ajout d’un revêtement lipidique augmente la fréquence de résonance par rapport à celle d’un buble non revêtu en raison de la rigidité intrinsèque de la coquille3. De plus, la coquille dissipe l’énergie par viscosité dilatationnelle, qui constitue la source dominante d’amortissement des bulles revêtues3. La coque stabilisatrice présente l’avantage supplémentaire de pouvoir être fonctionnalisée, par exemple en liant les ligands de ciblage à la surface des microbulles. Ce ciblage permet de nombreuses applications pour ces bulles et, en particulier, l’imagerie moléculaire avec ultrasons14,19.
Les agents de contraste à microbulles sont très prometteurs pour les applications d’administration de médicaments avec ultrasons. Les microbulles oscillant dans le confinement d’un vaisseau sanguin peuvent provoquer une microdiffusion ainsi que des contraintes locales normales et de cisaillement sur la paroi capillaire3. À des pressions acoustiques élevées, des oscillations de grande amplitude peuvent entraîner un effondrement des microbulles dans un processus violent appelé cavitation inertielle, qui, à son tour, peut entraîner une rupture ou une invagination du vaisseau sanguin20. Ces phénomènes violents peuvent induire des bioeffets tels que la sonopération21, améliorant l’extravasation des médicaments thérapeutiques dans l’interstitium à travers la paroi endothéliale, soit paracellulaire ou transcellulaire. Il peut également améliorer la pénétration des agents thérapeutiques à travers la matrice extracellulaire des tumeurs riches en stroma21,22 et des biofilms23,24, bien que ce mécanisme soit encore mal compris26.
L’administration de médicaments par ultrasons a montré des résultats prometteurs à la fois préclinique27,28 et dans les essais cliniques22. De plus, lorsqu’elles sont utilisées avec des ultrasons à relativement basse fréquence (~1 MHz), il a été rapporté que les microbulles augmentent localement et transitoirement la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant ainsi aux médicaments d’entrer dans le parenchyme cérébral, à la fois dans les études précliniques et cliniques29,30,31,32,33,34.
Il existe généralement deux approches de l’administration de médicaments médiés par ultrasons: le matériel thérapeutique peut être co-administré avec les bulles, ou il peut être attaché ou chargé dans la coquille à bulles28,35,36. La deuxième approche s’est avérée plus efficace en termes d’administration de médicaments37. Les microbulles peuvent être chargées de médicaments ou de matériel génétique encapsulés dans des nanoparticules (liposomes ou nanoconstructions polymères) attachées à la coquille ou incorporées directement dans la coquille de microbulles35,36. Les microbulles chargées de nanoparticules peuvent être activées par ultrasons (focalisés) pour libérer localement la charge utile des nanoparticules28,33,38,39,40. Si une telle microbulle est en contact direct avec une cellule, il a été démontré in vitro que la charge utile peut même être déposée sur la membrane cytoplasmique de la cellule dans un processus appelé sonoprinting34,35.
L’espace des paramètres échographiques pour l’insonation par microbulles est vaste et les conditions biologiques in vivo ajoutent encore plus de complexité. Ainsi, la combinaison d’ultrasons focalisés et de microbulles chargées de nanoparticules pose un défi dans le domaine des thérapies ciblées.
L’objectif de ce travail est de fournir des protocoles pouvant être utilisés pour imager, en détail, la réponse des microbulles en fonction des paramètres ultrasonores et d’étudier les mécanismes conduisant à la rupture de la coquille et à la libération ultérieure du matériau de la coquille marqué par fluorescence. Cet ensemble de protocoles est applicable aux microbulles avec des coquilles qui contiennent un colorant fluorescent. La figure 1 montre une représentation schématique des microbulles stabilisées par des nanoparticules polymères et des protéines développées au SINTEF (Trondheim, Norvège). Ces bulles sont remplies de gaz perfluoropropane (C3F8) et les nanoparticules qui stabilisent la coquille contiennent NR668, qui est un dérivé lipophile du colorant fluorescent rouge du Nil38,43. Les nanoparticules sont constituées de poly(2-éthyl-butyl cyanoacrylate) (PEBCA) et sont PEGylated. La fonctionnalisation avec du polyéthylène glycol (PEG) réduit l’opsonisation et la phagocytose par le système phagocytaire mononucléaire, prolongeant ainsi le temps de circulation14,44. En conséquence, la PEGylation augmente la quantité de nanoparticules atteignant le site cible, améliorant ainsi l’efficacité du traitement16. La figure 2 illustre comment l’utilisation de quatre méthodes de microscopie permet aux chercheurs de couvrir toutes les échelles de temps et de longueur pertinentes. Il est à noter que la résolution spatiale réalisable en microscopie optique est déterminée par la limite de diffraction, qui dépend de la longueur d’onde de la lumière et de l’ouverture numérique (NA) de l’objectif et de celle de la source d’éclairage de l’objet45. Pour les systèmes disponibles, la limite de résolution optique est généralement de 200 nm. De plus, la microscopie intravitale peut être utilisée pour imager au niveau subcellulaire46. Pour les microbulles stabilisées aux nanoparticules et aux protéines utilisées dans ce travail, l’échelle de longueur minimale pertinente pour la microscopie intravitale est la taille des petits capillaires (≥10 μm). Des expériences d’imagerie optique in vitro à grande vitesse (10 millions d’images par seconde) et d’imagerie par fluorescence à grande vitesse (500 000 images par seconde) sont décrites pour des microbulles simples. L’imagerie en champ lumineux à grande vitesse à des échelles de temps nanosecondes convient pour étudier la dynamique radiale résolue dans le temps des bulles vibrantes. En revanche, la microscopie à fluorescence à grande vitesse permet une visualisation directe de la libération des nanoparticules marquées par fluorescence. En outre, la structure de la coquille de microbulle peut être étudiée à l’aide de la microscopie confocale tridimensionnelle (3D) Z-stack et de la microscopie électronique à balayage (le protocole de cette dernière n’est pas inclus dans les travaux actuels). La microscopie intravitale consiste à utiliser la microscopie multiphotonique pour imager les tumeurs se développant dans les chambres de fenêtre dorsale afin de fournir des informations en temps réel sur le flux sanguin local et sur le sort des nanoparticules marquées par fluorescence in vivo47. La combinaison de ces méthodes de microscopie fournit finalement un aperçu détaillé du comportement des agents thérapeutiques à microbulles en réponse à l’échographie, à la fois in vitro et in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Les agents de contraste à microbulles sont très prometteurs pour les applications d’administration de médicaments avec ultrasons. L’encapsulation de médicaments dans des nanoparticules réduit la toxicité systémique et augmente le temps de circulation des médicaments. Dans une nouvelle approche de l’administration de médicaments assistée par microbulles, les nanoparticules sont incorporées dans ou sur les coquilles de microbulles, permettant la libération locale et déclenchée de la charge utile des nanoparticules avec des ultrasons. Une compréhension approfondie des mécanismes de libération dans le vaste espace des paramètres ultrasonores est cruciale pour une libération efficace et contrôlée. Cet ensemble de protocoles présentés est applicable aux microbulles avec une coquille contenant une étiquette fluorescente. Ici, l’accent est mis sur les microbulles chargées de nanoparticules polymères poly(2-éthyl-butyl cyanoacrylate), dopées avec un colorant rouge du Nil modifié. Les particules sont fixées dans une coquille de caséine dénaturée. Les microbulles sont produites par agitation vigoureuse, formant une dispersion de gaz perfluoropropane dans la phase liquide contenant de la caséine et des nanoparticules, après quoi la coquille de microbulles s’auto-assemble. Une variété de techniques de microscopie sont nécessaires pour caractériser les microbulles stabilisées par nanoparticules à toutes les échelles de temps pertinentes du processus de libération des nanoparticules. La fluorescence des nanoparticules permet l’imagerie confocale de microbulles simples, révélant la distribution des particules dans la coquille. L’imagerie in vitro à ultra-haute vitesse utilisant la microscopie à champ lumineux à 10 millions d’images par seconde permet de mieux comprendre la dynamique des bulles en réponse à l’insonation ultrasonore. Enfin, la libération de nanoparticules par la coquille à bulles est mieux visualisée au moyen de la microscopie à fluorescence, réalisée à 500 000 images par seconde. Pour caractériser l’administration de médicaments in vivo, la libération déclenchée de nanoparticules dans le système vasculaire et leur extravasation au-delà de la couche endothéliale sont étudiées par microscopie intravitale dans des tumeurs implantées dans des chambres de fenêtre dorsale, sur une échelle de temps de plusieurs minutes. La combinaison de ces techniques de caractérisation complémentaires fournit un aperçu unique du comportement des microbulles et de leur libération de charge utile à diverses échelles de temps et de longueur, à la fois in vitro et in vivo.

Les microbulles, produites comme décrit dans le protocole, ont été analysées à l’aide de diverses méthodes de microscopie et à différentes échelles de temps.
La fluorescence des nanoparticules en microscopie confocale (Figure 6A) indique que la coquille a une distribution de particules non uniforme. D’autres méthodes de microscopie peuvent être utilisées pour la caractérisation des bulles. Par exemple, la figure 6B montre la structure globale de la microbulle à l’aide de la microscopie électronique à balayage, telle que présentée dans les travaux précédents34.
La dynamique radiale et le comportement phénoménologique des bulles peuvent être étudiés à l’aide de la méthode de microscopie à champ lumineux in vitro décrite dans laquelle des microbulles ont été imagées à 10 millions d’images par seconde. Le rayon des microbulles simples a été extrait au fil du temps à l’aide d’un script écrit en interne. Un exemple d’une telle réponse radiale est illustré à la figure 7.
Une séquence d’images de l’administration réussie typique de nanoparticules, telle que décrite à la section 2.3.6, est illustrée à la figure 8A. Les nanoparticules incorporées dans la coquille de microbulle peuvent être vues s’allumer en raison de la fluorescence lorsque la lumière laser atteint la bulle. Entraînées par l’insonation par ultrasons, les nanoparticules fluorescentes se détachent du noyau gazeux des microbulles et se déposent sur la membrane du porte-échantillon. Enfin, le laser est éteint et les nanoparticules fluorescentes ne sont plus excitées. La livraison infructueuse de la charge utile marquée par fluorescence des microbulles ressemble généralement à la séquence d’images illustrée à la figure 8B, où les nanoparticules fluorescentes s’allument sur la coquille de la microbulle qui reste intacte pendant l’exposition aux ultrasons.
La microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pendant l’échographie a été utilisée pour étudier les effets des ultrasons et des microbulles sur le comportement des nanoparticules dans le sang, l’amélioration de la perméabilité des vaisseaux sanguins tumoraux et l’amélioration de l’administration des nanoparticules. L’étendue et la cinétique de pénétration dans la matrice extracellulaire en fonction de la pression acoustique, de la fréquence et de la longueur des impulsions peuvent être caractérisées. L’effet du traitement par ultrasons peut varier en fonction de la taille et de la morphologie des vaisseaux et du confinement de la bulle qui en résulte. La façon dont le traitement par ultrasons affecte le flux sanguin et la direction peut être déterminée. Un exemple d’expérience montrant l’extravasation des nanoparticules au fil du temps est illustré à la figure 9 à un indice mécanique (IM) de 0,826. Les résultats de la microscopie multiphotonique intravitale élucident l’extravasation spatiale et temporelle des nanoparticules lors de l’exposition aux ultrasons, ce qui est très bénéfique pour la compréhension complète des mécanismes sous-jacents à l’administration de nanoparticules par ultrasons et pour optimiser ces technologies26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique d’une microbulle avec une coquille de nanoparticules polymères marquées par fluorescence dans la caséine dénaturée. Les microbulles ont généralement entre 1 μm et 10 μm de diamètre. Les nanoparticules ont un diamètre généralement compris entre 100 nm et 200 nm38. Abréviation : C3F8 = gaz perfluoropropane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble schématique montrant les échelles de temps et de longueur pertinentes pour la microscopie à champ lumineux, à fluorescence, confocale et intravitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figure 3: Représentation schématique des expériences de microscopie en champ lumineux. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) un cadre enregistré typique. Barre d’échelle en (C) = 10 μm. Abréviation : fps = images par seconde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figure 4 : Représentation schématique d’expériences de microscopie à fluorescence. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) une image enregistrée typique. Barre d’échelle en (C) = 10 μm. Abréviation : fps = images par seconde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figure 5: Représentation schématique des expériences de microscopie intravitale. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) une trame enregistrée typique. Barre d’échelle en (C) = 50 μm. Le vert correspond au dextran-FITC et le rouge aux nanoparticules. Abréviation : GaAsP = phosphure d’arséniure de gallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figure 6 : Structure 3D d’une seule microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines. (A) Utilisation de la microscopie confocale pour montrer les nanoparticules, et (B) utilisation d’un microscope électronique à balayage pour montrer la structure 3D. (B) a été reproduit avec l’autorisation de34. Barre d’échelle en (A) = 5 μm; barre d’échelle en (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figure 7 : Oscillations sphériques typiques d’une microbulle stabilisée par des nanoparticules et des protéines d’un rayon de 2,89 μm insonifiée à une fréquence ultrasonore de 1 MHz et une amplitude de pression acoustique de 142 kPa. (A-D) Images de l’enregistrement à grande vitesse et du rayon de bulle correspondant sur la courbe temporelle (en bas). Barres d’échelle = 5 μm, et la ligne rouge indique le rayon initial. Le profil d’éclairage (unités arbitraires) est indiqué par le jaune. Le grossissement est de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figure 8 : Séquence d’images de la microscopie à fluorescence à grande vitesse. (A) Livraison réussie de nanoparticules marquées par fluorescence d’une microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines insonifiée à une fréquence ultrasonore de 2 MHz et une amplitude de pression acoustique de 600 kPa. B) Livraison infructueuse de nanoparticules marquées par fluorescence d’une microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines insonifiée à une fréquence ultrasonore de 2 MHz et à une amplitude de pression acoustique de 210 kPa. Barres d’échelle = 10 μm. Le grossissement est de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figure 9 : Microscopie intravitale après insonation de microbulles stabilisées par des nanoparticules et des protéines à une fréquence ultrasonore de 1 MHz et une amplitude de pression acoustique de 800 kPa. (A) Nanoparticules dans le vaisseau, et (B) une séquence d’images de la zone indiquée par le carré pointillé blanc en (A) représentant l’extravasation du dextran (vert) et des nanoparticules (rouge). Barres d’échelle = 50 μm. Le grossissement est de 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Les protocoles présentés peuvent être utilisés pour caractériser la réponse des microbulles marquées par fluorescence conçues pour les applications d’administration de médicaments déclenchées par ultrasons, y compris leurs mécanismes d’activation ainsi que leurs bioeffets. Cet article couvre une gamme de techniques de microscopie in vitro et in vivo réalisées pour capturer la longueur et les échelles de temps pertinentes.

Méthodes de microscopie multi-temps pour la caractérisation de microbulles marquées par fluorescence pour la libération de médicaments déclenchée par ultrasons

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Ce protocole peut être utilisé pour caractériser la réponse des microbulles marquées par fluorescence qui sont conçues pour les applications d’administration de médicaments déclenchées par ultrasons, y compris les mécanismes d’activation et les bioeffets. La clé réside dans la combinaison de techniques d’imagerie qui nous permet de démêler le problème multi-échelle de l’administration de médicaments déclenchés par ultrasons avec des bulles, à la fois à différentes échelles spatiales et à différentes échelles de temps. Pour l’imagerie à bulle unique par microscopie Brightfield, placez une aiguille de ventilation de calibre 19 et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 19 pour retirer une petite quantité de la suspension de microbulles du flacon en verre dans un petit tube pour faciliter le pipetage à l’étape suivante.À l’aide d’une pipette, diluer la solution de microbulles dans une solution saline tamponnée au phosphate filtré. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour injecter l’échantillon dans une sortie du porte-échantillon jusqu’à ce que le support soit plein sans créer de bulles d’air, en injectant plus d’échantillon si nécessaire. Fermez les deux valves du porte-échantillon et placez le porte-échantillon perpendiculairement à l’axe optique du microscope.Avant l’analyse de l’échantillon, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons et la pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire et en commençant par le champ de vision à un coin du porte-échantillon, utilisez l’étage XYZ pour déplacer le support afin de localiser des microbulles simples dans le champ de vision du microscope, puis fixez une fibre optique connectée à un bain-marie à une lumière stroboscopique et démarrez l’enregistrement. Répétez l’imagerie autant de fois que vous le souhaitez par réglage de l’échographie, en déplaçant le porte-échantillon d’au moins deux millimètres vers un champ de vision contenant des microbulles non coniques pour chaque analyse. Pour l’imagerie microscopique à fluorescence des microbulles, après avoir dilué la solution de microbulles dans une solution saline tamponnée au phosphate comme démontré, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons et la pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire et réglez le délai de déclenchement du laser sur le générateur de retard d’impulsion pour l’excitation de fluorescence des nanoparticules à partir des microbulles, puis utilisez l’étage XYZ pour déplacer le porte-échantillon afin de localiser les microbulles simples et de les mettre au centre de l’objectif, puis déclenchez l’enregistrement.Répétez l’imagerie comme vous le souhaitez en modifiant les paramètres de l’échographie et en déplaçant le porte-échantillon vers le nouveau champ de vision comme illustré. Pour l’imagerie par microscopie intravitale, placez d’abord un support d’animal chauffé sur l’étage de positionnement XY entre le guide d’ondes et l’objectif et ajoutez du gel de couplage au guide d’ondes. Insérez un cathéter de veine caudale dans la veine caudale d’une souris anesthésiée porteuse de tumeur et placez la souris équipée d’une chambre de fenêtre dans le support chauffant.Ajouter une gouttelette d’eau au couvercle. Pour visualiser le système vasculaire du tissu tumoral, injectez par voie intraveineuse 30 microlitres de quatre milligrammes par millilitre marqués par fluorescence 2 mégadaltons dextran dans le cathéter de la veine caudale et utilisez l’étape de traduction XY pour déplacer la souris jusqu’à ce qu’un champ de vision avec des vaisseaux sanguins appropriés puisse être localisé. Ajustez la fréquence d’images, le champ de vision et la durée de l’enregistrement en fonction des paramètres de l’expérience et enregistrez des images de base des navires.Lorsque les images de base ont été acquises, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons, la longueur de l’impulsion et l’amplitude de la pression acoustique sur le générateur de forme d’onde arbitraire et injectez par voie intraveineuse 50 microlitres d’échantillon de microbulles dans la veine caudale. Ensuite, imaginez la vascularisation comme démontré. L’analyse des microbulles par microscopie confocale à fluorescence révèle une distribution de particules non uniforme de la coquille de microbulle.La structure globale des microbulles peut être visualisée davantage par microscopie électronique à balayage. L’analyse de la dynamique radiale et du comportement phénoménologique des microbulles insonifiées par microscopie à fond clair permet d’évaluer le changement relatif du rayon des microbulles au fil du temps. Ici, une séquence d’images d’une livraison réussie typique de nanoparticules marquées par fluorescence est montrée.Les nanoparticules incorporées dans la coquille de microbulles peuvent être observées à fluorescence lorsque la lumière laser atteint la bulle. Comme observé dans cette livraison infructueuse, cependant, les nanoparticules fluorescentes s’allument sur la coquille de la microbulle, qui reste intacte pendant l’exposition aux ultrasons. L’imagerie multiphotonique intravitale peut être utilisée pour déterminer l’extravasation spatiale et temporelle des nanoparticules pendant l’exposition aux ultrasons, ce qui peut être bénéfique pour comprendre et optimiser les mécanismes sous-jacents à l’administration de nanoparticules médiées par ultrasons.Avec l’alignement parfait des voies optiques et acoustiques à toutes les échelles de temps et de longueur, un aperçu complet de l’administration de médicaments déclenchés par ultrasons est fourni. Les réponses apportées par nos expériences multi-échelles seront désormais traduites en pratique clinique. Les résultats fourniront des informations précieuses pour une gamme d’applications thérapeutiques, y compris le traitement du cancer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnétique alternatif microgels de gélatine hybride sensible au champ de libération contrôlée de médicaments

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Méthodes pour l&#39;auto-intégration de Megamolecular biopolymères sur le séchage à l&#39;air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Balayage automatique pour lames et Segmentation en tissus fluorescent marqué à l’aide d’un système d’analyse Widefield haute teneur

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...