Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Verschiedene optische Mikroskopiemethoden wurden kombiniert, um Informationen über die verschiedenen Schritte bei der Abgabe von Nanopartikeln von der Oberfläche von Mikrobläschen an das umgebende Medium zu erhalten. Es wurde eine Bildgebung der Blasenoszillationen sowie eine Bildgebung der Freisetzung der Nanopartikel aus der Blasenhülle, der Extravasation und des Eindringens von Tumoren durch die extrazelluläre Matrix von Tumoren in vivo durchgeführt. Die In-vitro-Bildgebung ermöglicht das Screening vieler Ultraschallparameter im Vergleich zu komplexeren In-vivo-Setups . Der Vorteil der Kombination dieser Reihe von Bildgebungsmodalitäten ist die komplementäre Information, die auf verschiedenen Zeitskalen erhalten werden kann - ein Merkmal, das entscheidend ist, um die Mikroblasen für eine erfolgreiche Verabreichung zu charakterisieren und zu optimieren und therapeutische Wirksamkeit zu erzielen. Dieser Ansatz ist nützlich, um die Abgabemechanismen für alle Mikrobläschen gleichermaßen zu verstehen, einschließlich Konstrukte mit fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln und Medikamenten.
Die kritischsten Schritte in den Mikroskopiemethoden, die zur Untersuchung einzelner Mikroblasen verwendet werden, sind wie folgt. Für die Fluoreszenzmikroskopie sollten die Nanopartikel fluoreszierend markiert sein, um die Visualisierung der Partikelfreisetzung zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte die Probenlösung ausreichend verdünnt werden, um einzelne Mikrobläschen für die Analyse in konfokalen, Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopiemethoden zu isolieren. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Ultraschall-Fahrfrequenz und einen Schalldruck zu wählen, um die Blasen am effizientesten anzuregen, nämlich bei ihrer Resonanz. Betrifft die Forschungsfrage die Abgabe der Nanopartikel-Nutzlast, sollten die entsprechenden Ultraschallparameter Teil der Untersuchung sein. Neben der Resonanz sollten diese Blasen auch an oder über ihre Schwelle für die Freisetzung von Nanopartikeln getrieben werden, typischerweise bei relativ hohen akustischen Druckamplituden (MI > 0,3)51. Für die Hellfeldmikroskopie-Bildgebung ist es wichtig, eine Hochgeschwindigkeitskamera mit einer ausreichend hohen Bildrate zu wählen, um Bewegungsunschärfe zu minimieren und Aliasing zu vermeiden.
Die Hellfeldmikroskopie ist hauptsächlich durch die bildgebende Bildrate und Intensität der verfügbaren Lichtquellen begrenzt, da eine höhere Bildrate einen detaillierteren zeitaufgelösten Einblick in die Blasendynamik geben würde, aber aufgrund kürzerer Belichtungszeiten eine intensivere Beleuchtung erfordert. Um die Partikelfreisetzung genauer zu untersuchen, kann die Framerate für die Fluoreszenzbildgebung prinzipiell durch Erhöhung der Intensität des Laserlichts erhöht werden. Die Absorption des hochintensiven Laserlichts durch die fluoreszenzmarkierten Mikrobläschen erzeugt jedoch Wärme, selbst bei Farbstoffen mit hoher Quantenausbeute. Diese Wärme kann die anstehenden Experimente stören und im Extremfall eine photothermische Kavitation induzieren52. In der Praxis gibt es also eine Grenze für die angewandte Laserfluenz. Intensive Laserbeleuchtung kann aber auch gezielt eingesetzt werden, um die Partikelfreisetzung aus Liposomen zu induzieren53. Die Temperatur beeinflusst die Blasendynamik und die Ultraschallreaktion, abhängig vom Blasentyp54. Wenn also In-vitro- und intravitale Methoden objektiv verglichen werden sollen, sollten die im Prüfplan erörterten In-vitro-Methoden bei 37 °C durchgeführt werden. Eine weitere Einschränkung der in der aktuellen Arbeit diskutierten In-vitro-Methoden besteht darin, dass sich die Blasen nicht in einer Freifeldumgebung befinden, da Mikrobläschen unter der Probenhaltermembran schweben. Darüber hinaus gibt es eine Selektionsverzerrung bei der Abbildung einzelner Mikroblasen. Die Durchführung wiederholter Experimente an einzelnen Blasen ermöglicht jedoch die Untersuchung des Einflusses der Größe und der Entfernung des Störfaktors - der Größenverteilung. Wenn die Blasenreaktion als Funktion der Größe verstanden werden kann, während die Konzentration nicht zu hoch ist, um Blasen-Blasen-Wechselwirkungen zu verhindern, kann die Reaktion jeder beliebigen Blasenpopulation berechnet werden. Schließlich bieten sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzmikroskopie-Methoden Einblicke in Mikroblasen, die in einem zweidimensionalen (2D) Bild verschachtelt sind. Wenn die Forschungsfrage mehr als 2D-Bildgebung erfordert, kann das 3D-Verhalten der Blasen aufgelöst werden, indem das im Protokoll beschriebene Setup mit einem Sideview-Setup für multiplane imaging55 kombiniert wird.
Eine alternative Methode zur Untersuchung von Mikroblasen ist die akustische Charakterisierung56. Die Messung des Echos einer einzelnen Mikrobläsche erfordert jedoch die Lokalisierung und Isolierung einer einzelnen Mikrobläsche innerhalb des Ultraschallstrahls56, was eine Herausforderung darstellt, die typischerweise durch die Verwendung eines schmalen Tubus oder einer optischen oder akustischen Pinzette bewältigt wird57,58. Um Blasen akustisch zu dimensionieren, können die Mikroblasen im geometrischen Streuregime bei Frequenzen insonifiziert werden, die viel höher sind als ihre Resonanzfrequenz, was keine volumetrischen Mikroblasenschwingungen induziert59. Die Verwendung einer "akustischen Kamera" ist eine solche Methode, um die radiale Dynamik einzelner Mikroblasen als Reaktion auf Ultraschall abzubilden, wobei eine Hochfrequenz-Ultraschallsonde verwendet wird, um die radiale Reaktion der Blase auf eine niederfrequente Antriebswelle zu bestimmen60. Der Nachteil dieser Methode ist, dass sie nur verwendet werden kann, um die relative Änderung des Mikroblasenradius zu bestimmen; Daher wird eine andere Methode benötigt, um den absoluten Blasenradius zu bestimmen, z. B. durch optische Bildgebung61,62. Der Nachteil von Verfahren, bei denen Mikrobläschen Ultraschall bei Frequenzen ausgesetzt werden, die höher als ihre Resonanzfrequenz sind, besteht darin, dass bei solch hohen Frequenzen die Eindringtiefe verringert wird59, was die Verwendbarkeit für In-vivo-Anwendungen einschränkt. Andere Formen der Mikroskopie können auch verwendet werden, um Mikroblasen wie Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie zu untersuchen63. Die erreichbare räumlich-zeitliche Auflösung dieser alternativen Mikroskopietechniken ist jedoch im Allgemeinen begrenzter, und diese Techniken haben den Nachteil, dass die Bildgebung entweder vor oder nach der Ultraschallexposition durch Offline-Analyse durchgeführt wird und typischerweise einen geringen Durchsatz aufweist63. Eine weitere Alternative ist die Verwendung einer Lichtstreumethode, mit der die radiale Dynamik einzelner Mikroblasen in Echtzeit untersucht werden kann, die jedoch im Vergleich zu akustischen Streumethoden ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis aufweist64.
Die intravitale Echtzeitmikroskopie während der Ultraschallexposition ist eine leistungsstarke Methode, um während der Ultraschallexposition neue Erkenntnisse über das Gefäßsystem, das Verhalten von Mikrobläschen, Nanopartikeln oder anderen Molekülen (in diesem Fall Dextran) zu gewinnen. Eine allgemeine Einschränkung bei der Durchführung der Intravitalmikroskopie in Echtzeit besteht darin, dass nur ein kleiner Bereich des Gewebes abgebildet wird und die Eindringtiefe des Lichts in das Gewebe begrenzt ist. Wenn die abgebildeten Gefäße nur sehr wenige Mikrobläschen und/oder Nanopartikel im Sichtfeld enthalten, können nur wenige oder keine Informationen über das Verhalten und die Extravasation von Nanopartikeln erhalten werden. Darüber hinaus ist aufgrund des begrenzten Sichtfeldes eine richtige Ausrichtung zwischen den Licht- und Ultraschallpfaden entscheidend. Wenn der Ultraschalldruck hoch genug ist, um eine Blasenzerstörung zu induzieren, ist es auch wichtig, eine Pulswiederholfrequenz zu wählen, die es ermöglicht, dass frische Blasen in das Sichtfeld zwischen Ultraschallimpulsen zurückkehren. Da der Ultraschall vom Deckglas in der Fensterkammer und dem Objektiv reflektiert wird, ist es außerdem wichtig, den Wandler in einem Winkel zu platzieren, um Reflexionen zu reduzieren und die Bildung von stehenden Wellen zu verhindern, die das kalibrierte Druckfeld verzerren. Ein weiteres praktisches Problem ist, dass das Setup genügend Platz haben muss, um den Ultraschallwandler und den Wellenleiter über oder unter dem Objektiv im Mikroskopaufbau zu montieren. Die Tumoren in der dorsalen Fensterkammer haben aufgrund der einschließenden Kammer und des Abdeckungsschlupfes eine begrenzte Dicke; bei Bedarf könnten jedoch auch andere Modelle verwendet werden. Beispiele sind Hautfaltentumoren, zum Beispiel im Brustfettpolster65 oder die abdominale intravitale Bildgebung von Tumoren in den verschiedenen Organen66. Solche Tumoren können in der entsprechenden Mikroumgebung orthotop gezüchtet werden und stellen daher einen klinisch relevanteren Fall dar.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden beleuchten das Potenzial fluoreszierend markierter Mikroblasen, um die Grundlagen von Arzneimittelabgabeanwendungen mit Blasen und Ultraschall zu untersuchen. Diese Kombination von Mikroskopiemethoden liefert wertvolle Einblicke in die Mikroblasenreaktion auf Ultraschallinsonation und den damit verbundenen akustischen Parameterraum und bietet eine klare Sicht auf das Mikroblasen- und Nutzlastverhalten über einen relevanten Bereich von Zeit- und Längenskalen.

Ultraschall ist die am weitesten verbreitete medizinische Bildgebungstechnik. Es ist nicht-invasiv, schnell, sicher, kostengünstig und tragbar1,2,3. Blut ist jedoch ein schlechter Ultraschallstreuer, und der Kontrast des Blutpools kann durch eine intravenöse Injektion von Ultraschallkontrastmitteln verbessert werden3. Dieser verbesserte Blutpoolkontrast ermöglicht die Quantifizierung der Organperfusion für diagnostische Zwecke, z. B. beim Nachweis der koronaren Herzkrankheit4 und der metastasierenden Lebererkrankung5. Tatsächlich erwies sich das Tumorgefäßsystem als wichtiger prognostischer Faktor6. Eine große Forschungsanstrengung richtet sich nun auf mikroblasengestützte, zielgerichtete molekulare Bildgebung und maßgeschneiderte Kontrastmittel für den therapeutischen Einsatz.
Handelsübliche Ultraschallkontrastmittel bestehen typischerweise aus einer Suspension beschichteter Mikrobläschen7,8 mit Durchmessern von 1 μm bis 10 μm9. Da Ultraschall-Kontrastmittel-Mikrobläschen etwas kleiner sind als rote Blutkörperchen7, können die Mikroblasen selbst die kleinsten Kapillaren sicher erreichen, ohne einen Verschluss zu erzeugen3. Mikroblasen haben aufgrund ihres kompressiblen Gaskerns11 einen dramatisch erhöhten Ultraschall-Rückstreukoeffizienten im Vergleich zu Gewebe10. Darüber hinaus ist das Mikroblasenecho hochgradig nichtlinear, d.h. sein Spektrum enthält Oberschwingungen und Subharmonika der Fahrfrequenz. Darüber hinaus ist die Echostärke stark von der Resonanzreaktion der Blase12 abhängig. Während Gewebe nur linear streut, reicht eine geringe Anzahl von Mikrobläschen aus, um eine hohe Nachweisempfindlichkeit in der harmonischen Bildgebung zu erreichen13,14. Diese nichtlineare Kontrasterzeugung kann sogar stark genug sein, um einzelne Blasen im Körper zu verfolgen15.
Die Hülle des Ultraschallkontrastmittels stabilisiert die Blasen gegen Auflösung und Koaleszenz und erhöht dadurch ihre Durchblutungszeit im Blutpool16. Die Hülle kann aus Lipiden, Polymeren oder denaturierten Proteinen bestehen3,8. Es verringert die Grenzflächenspannung, begrenzt dadurch die Wirkung der druckgetriebenen Laplace-Auflösung17 und bildet eine Widerstandsbarriere gegen Gasdiffusion18. Um die Stabilität weiter zu erhöhen, werden die Kontrastmikrobläschen typischerweise mit einem hochmolekularen Gas mit geringer Löslichkeit im Blut gefüllt11. Die Mikroblasenschale verändert dramatisch die Reaktion der Mikroblasen auf Ultraschallinsonation11. Unbeschichtete Gasblasen haben eine charakteristische Resonanzfrequenz, die umgekehrt proportional zu ihrer Größe ist, und die Zugabe einer Lipidbeschichtung erhöht die Resonanzfrequenz gegenüber der eines unbeschichteten Bubles aufgrund der intrinsischen Steifigkeit der Schale3. Darüber hinaus leitet die Schale Energie durch dilatative Viskosität ab, die die dominierende Dämpfungsquelle für beschichtete Blasen darstellt3. Die stabilisierende Schale hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie funktionalisiert werden kann, z.B. indem Zielliganden an die Oberfläche von Mikroblasen gebunden werden. Dieses Targeting ermöglicht viele Anwendungen für diese Blasen und insbesondere die molekulare Bildgebung mit Ultraschall14,19.
Mikroblasen-Kontrastmittel sind vielversprechend für Anwendungen zur Arzneimittelabgabe mit Ultraschall. Mikroblasen, die im Einschluss eines Blutgefäßes oszillieren, können Microstreaming sowie lokale Normal- und Scherspannungen an der Kapillarwand verursachen3. Bei hohen Schalldrücken können große Amplitudenoszillationen zu einem Mikroblasenkollaps in einem heftigen Prozess führen, der als Trägheitskavitation bezeichnet wird, was wiederum zu einem Bruch oder einer Invagination des Blutgefäßes führen kann20. Diese heftigen Phänomene können Bioeffekte wie die Sonopermeation21 induzieren, wodurch die Extravasation therapeutischer Arzneimittel in das Interstitium über die Endothelwand entweder parazellulär oder transzellulär verstärkt wird. Es kann auch die Penetration von Therapeutika durch die extrazelluläre Matrix von stromareichen Tumoren21,22 und Biofilmen23,24 verbessern, obwohl dieser Mechanismus noch wenig verstanden ist26.
Die ultraschallvermittelte Wirkstoffabgabe hat sowohl präklinisch27,28 als auch in klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt22. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Mikrobläschen bei Verwendung mit relativ niederfrequentem Ultraschall (~ 1 MHz) die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke lokal und vorübergehend erhöhen, wodurch Medikamente sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien in das Hirnparenchym gelangen können29,30,31,32,33,34.
Es gibt im Allgemeinen zwei Ansätze für die ultraschallvermittelte Arzneimittelabgabe: Das therapeutische Material kann zusammen mit den Blasen verabreicht werden, oder es kann an der Blasenhülle befestigt oder in sie geladen werden28,35,36. Der zweite Ansatz hat sich in Bezug auf die Arzneimittelabgabe als effizienter erwiesen37. Mikrobläschen können mit Medikamenten oder genetischem Material beladen sein, das in Nanopartikeln (Liposomen oder polymeren Nanokonstruktionen) eingekapselt ist, die an der Schale befestigt oder direkt in die Mikrobläschenschale eingearbeitet sind35,36. Nanopartikelbeladene Mikrobläschen können durch (fokussierten) Ultraschall aktiviert werden, um die Nanopartikel-Nutzlast lokal freizusetzen28,33,38,39,40. Wenn eine solche Mikrobläsche in direktem Kontakt mit einer Zelle steht, hat sich in vitro gezeigt, dass die Nutzlast sogar in einem Sogenannten Sonoprinting34,35 auf der zytoplasmatischen Zellmembran abgeschieden werden kann.
Der Ultraschallparameterraum für die Mikroblaseninsonation ist umfangreich, und die biologischen In-vivo-Bedingungen erhöhen die Komplexität weiter. Daher stellt die Kombination von fokussiertem Ultraschall und nanopartikelbeladenen Mikroblasen eine Herausforderung im Bereich der zielgerichteten Therapeutika dar.
Ziel dieser Arbeit ist es, Protokolle bereitzustellen, die verwendet werden können, um die Reaktion von Mikrobläschen in Abhängigkeit von den Ultraschallparametern detailliert abzubilden und die Mechanismen zu untersuchen, die zum Bruch der Schale und zur anschließenden Freisetzung des fluoreszierend markierten Schalenmaterials führen. Dieser Satz von Protokollen ist auf Mikrobläschen mit Schalen anwendbar, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthalten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der polymer-nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikroblasen, die am SINTEF (Trondheim, Norwegen) entwickelt wurden. Diese Blasen sind mit Perfluorpropangas (C3F8) gefüllt und die Nanopartikel, die die Schale stabilisieren, enthalten NR668, ein lipophiles Derivat des Nilrot-Fluoreszenzfarbstoffs38,43. Die Nanopartikel bestehen aus Poly(2-ethyl-butylcyanoacrylat) (PEBCA) und sind PEGyliert. Die Funktionalisierung mit Polyethylenglykol (PEG) reduziert die Opsonisierung und Phagozytose durch das mononukleäre Phagozytsystem und verlängert dadurch die Zirkulationszeit14,44. Infolgedessen erhöht die PEGylierung die Menge an Nanopartikeln, die die Zielstelle erreichen, wodurch die Wirksamkeit der Behandlung verbessert wird16. Abbildung 2 zeigt, wie der Einsatz von vier Mikroskopiemethoden es den Forschern ermöglicht, alle relevanten Zeit- und Längenskalen abzudecken. Es ist zu beachten, dass die in der optischen Mikroskopie erreichbare räumliche Auflösung durch die Beugungsgrenze bestimmt wird, die von der Wellenlänge des Lichts und der numerischen Apertur (NA) des Objektivs und der Objektbeleuchtungsquelle45 abhängt. Für die vorliegenden Systeme liegt die optische Auflösungsgrenze typischerweise bei 200 nm. Zusätzlich kann die intravitale Mikroskopie zur Bildgebung auf subzellulärer Ebene verwendet werden46. Für die in dieser Arbeit verwendeten nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikrobläschen ist die für die intravitale Mikroskopie relevante Mindestlängenskala die Größe kleiner Kapillaren (≥10 μm). In-vitro-Hochgeschwindigkeitsexperimente der optischen Hochgeschwindigkeitsbildgebung (10 Millionen Bilder pro Sekunde) und der Hochgeschwindigkeitsfluoreszenzbildgebung (500.000 Bilder pro Sekunde) werden für einzelne Mikrobläschen beschrieben. Hochgeschwindigkeits-Hellfeldbildgebung auf Nanosekunden-Zeitskalen ist geeignet, die zeitaufgelöste radiale Dynamik der vibrierenden Blasen zu untersuchen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie eine direkte Visualisierung der Freisetzung der fluoreszenzmarkierten Nanopartikel. Darüber hinaus kann die Struktur der Mikrobläschenschale mit Hilfe der Z-Stack-dreidimensionalen (3D) konfokalen Mikroskopie und der Rasterelektronenmikroskopie (das Protokoll für letztere ist in der aktuellen Arbeit nicht enthalten) untersucht werden. Die intravitale Mikroskopie besteht darin, mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie Tumore abzubilden, die in dorsalen Fensterkammern wachsen, um Echtzeitinformationen über den lokalen Blutfluss und den Verbleib fluoreszierend markierter Nanopartikel in vivo47 bereitzustellen. Die Kombination dieser Mikroskopiemethoden liefert letztendlich einen detaillierten Einblick in das Verhalten therapeutischer Mikrobläschenmittel als Reaktion auf Ultraschall, sowohl in vitro als auch in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Mikroblasen-Kontrastmittel sind vielversprechend für Anwendungen zur Arzneimittelabgabe mit Ultraschall. Die Verkapselung von Arzneimitteln in Nanopartikeln reduziert die systemische Toxizität und erhöht die Zirkulationszeit der Arzneimittel. In einem neuartigen Ansatz zur mikroblasengestützten Wirkstoffabgabe werden Nanopartikel in oder auf Mikrobläschenschalen eingebaut, was eine lokale und ausgelöste Freisetzung der Nanopartikelnutzlast mit Ultraschall ermöglicht. Ein gründliches Verständnis der Freisetzungsmechanismen innerhalb des riesigen Ultraschallparameterraums ist entscheidend für eine effiziente und kontrollierte Freisetzung. Dieser Satz der vorgestellten Protokolle ist auf Mikrobläschen mit einer Hülle anwendbar, die eine fluoreszierende Markierung enthält. Hier liegt der Fokus auf Mikrobläschen, die mit Polymer-Nanopartikeln aus Poly(2-ethyl-butylcyanoacrylat) beladen sind, die mit einem modifizierten Nilrotfarbstoff dotiert sind. Die Partikel werden in einer denaturierten Kaseinhülle fixiert. Die Mikrobläschen werden durch kräftiges Rühren hergestellt und bilden in der flüssigen Phase eine Dispersion von Perfluorpropangas, die Casein und Nanopartikel enthält, wonach sich die Mikroblasenhülle selbst zusammensetzt. Eine Vielzahl von Mikroskopietechniken ist erforderlich, um die nanopartikelstabilisierten Mikrobläschen auf allen relevanten Zeitskalen des Nanopartikel-Freisetzungsprozesses zu charakterisieren. Die Fluoreszenz der Nanopartikel ermöglicht die konfokale Abbildung einzelner Mikrobläschen und deckt die Partikelverteilung innerhalb der Schale auf. Die In-vitro-Ultrahochgeschwindigkeitsbildgebung mittels Hellfeldmikroskopie bei 10 Millionen Bildern pro Sekunde liefert Einblicke in die Blasendynamik als Reaktion auf Ultraschallinsonation. Schließlich wird die Freisetzung von Nanopartikeln aus der Blasenhülle am besten mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, die mit 500.000 Bildern pro Sekunde durchgeführt wird. Um die Wirkstoffabgabe in vivo zu charakterisieren, wird die ausgelöste Freisetzung von Nanopartikeln innerhalb des Gefäßsystems und ihre Extravasation über die Endothelschicht hinaus mittels intravitaler Mikroskopie bei Tumoren, die in dorsale Hautfaltenfensterkammern implantiert wurden, über einen Zeitraum von mehreren Minuten untersucht. Die Kombination dieser komplementären Charakterisierungstechniken bietet einen einzigartigen Einblick in das Verhalten von Mikrobläschen und ihre Nutzlastfreisetzung auf einer Reihe von Zeit- und Längenskalen, sowohl in vitro als auch in vivo.

Die Mikroblasen, die wie im Protokoll beschrieben hergestellt wurden, wurden mit verschiedenen Mikroskopiemethoden und auf verschiedenen Zeitskalen analysiert.
Die Fluoreszenz der Nanopartikel in der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 6A) zeigt an, dass die Schale eine ungleichmäßige Partikelverteilung aufweist. Andere Mikroskopiemethoden können zur Blasencharakterisierung verwendet werden. Abbildung 6B zeigt beispielsweise die Gesamtstruktur der Mikrobläsche unter Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie, wie sie in früheren Arbeiten34 dargestellt wurde.
Radialdynamik und phänomenologisches Blasenverhalten können mit der beschriebenen in vitro Hellfeldmikroskopiemethode untersucht werden, bei der Mikrobläschen mit 10 Millionen Bildern pro Sekunde abgebildet wurden. Der Radius einzelner Mikroblasen wurde im Laufe der Zeit mit einem intern geschriebenen Skript extrahiert. Ein Beispiel für eine solche radiale Reaktion ist in Abbildung 7 dargestellt.
Eine Bildsequenz der typischen erfolgreichen Nanopartikelabgabe, wie in Abschnitt 2.3.6 beschrieben, ist in Abbildung 8A dargestellt. Die in die Mikroblasenhülle eingebetteten Nanopartikel leuchten aufgrund von Fluoreszenz auf, wenn das Laserlicht die Blase erreicht. Angetrieben durch Ultraschallinsonation lösen sich die fluoreszierenden Nanopartikel vom Gaskern der Mikrobläschen und werden auf der Membran des Probenhalters abgeschieden. Schließlich wird der Laser ausgeschaltet und die fluoreszierenden Nanopartikel werden nicht mehr angeregt. Die erfolglose Abgabe der fluoreszenzmarkierten Nutzlast der Mikrobläschen sieht typischerweise wie die in Abbildung 8B gezeigte Bildsequenz aus, in der die fluoreszierenden Nanopartikel auf der Hülle der Mikrobläsche aufleuchten, die während der Ultraschallbelichtung intakt bleibt.
Die intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit während des Ultraschalls wurde verwendet, um die Auswirkungen von Ultraschall und Mikroblasen auf das Verhalten von Nanopartikeln im Blut, die Verbesserung der Permeabilität von Tumorblutgefäßen und die Verbesserung der Abgabe von Nanopartikeln zu untersuchen. Das Ausmaß und die Kinetik des Eindringens in die extrazelluläre Matrix als Funktion von Schalldruck, Frequenz und Pulslängen können charakterisiert werden. Die Wirkung der Ultraschallbehandlung kann in Bezug auf die Größe und Morphologie der Gefäße und die daraus resultierende Einschließung der Blase variieren. Wie sich die Ultraschallbehandlung auf den Blutfluss und die Richtung auswirkt, kann bestimmt werden. Ein Beispielexperiment, das die Extravasation von Nanopartikeln im Laufe der Zeit zeigt, ist in Abbildung 9 bei einem mechanischen Index (MI) von 0,826 dargestellt. Die Ergebnisse der intravitalen Multiphotonenmikroskopie verdeutlichen die räumliche und zeitliche Extravasation von Nanopartikeln während der Ultraschallexposition, was für das vollständige Verständnis der Mechanismen, die der ultraschallvermittelten Abgabe von Nanopartikeln zugrunde liegen, und für die Optimierung solcher Technologien von großem Nutzen ist26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Mikrobläsche mit einer Hülle aus fluoreszierend markierten polymeren Nanopartikeln in denaturiertem Casein. Die Mikrobläschen haben typischerweise einen Durchmesser zwischen 1 μm und 10 μm. Die Nanopartikel haben einen Durchmesser meist zwischen 100 nm und 200 nm38. Abkürzung: C3F8 = Perfluorpropangas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Übersicht mit den relevanten Zeit- und Längenskalen für die Hellfeld-, Fluoreszenz-, Konfokal- und Intravitalmikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung von Hellfeldmikroskopie-Experimenten. (A) Versuchsaufbau, (B) das Timing-Diagramm und (C) ein typischer aufgezeichneter Rahmen. Maßstabsleiste in (C) = 10 μm. Abkürzung: fps = Bilder pro Sekunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Abbildung 4: Schematische Darstellung von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten. (A) Versuchsaufbau, (B) das Timing-Diagramm und (C) ein typischer aufgezeichneter Frame. Maßstabsleiste in (C) = 10 μm. Abkürzung: fps = Bilder pro Sekunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Abbildung 5: Schematische Darstellung intravitaler Mikroskopieexperimente. (A) Versuchsaufbau, (B) das Zeitdiagramm und (C) ein typischer aufgezeichneter Rahmen. Maßstabsleiste in (C) = 50 μm. Grün entspricht Dextran-FITC und Rot Nanopartikeln. Abkürzung: GaAsP = Galliumarsenidphosphid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Abbildung 6: 3D-Struktur einer einzelnen nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikrobläsche. (A) Verwendung der konfokalen Mikroskopie zur Darstellung der Nanopartikel und (B) Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops zur Darstellung der 3D-Struktur. (B) mit Genehmigung von 34 reproduziert wurde. Maßstabsleiste in (A) = 5 μm; Maßstabsleiste in (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Abbildung 7: Typische sphärische Schwingungen einer nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikrobläsche mit einem Radius von 2,89 μm, insonifiziert bei einer Ultraschallfrequenz von 1 MHz und einer akustischen Druckamplitude von 142 kPa. (A-D) Bilder aus der Hochgeschwindigkeitsaufzeichnung und dem entsprechenden Blasenradius über die Zeitkurve (unten). Maßstabsbalken = 5 μm, und die rote Linie zeigt den Anfangsradius an. Das Beleuchtungsprofil (beliebige Einheiten) ist gelb gekennzeichnet. Die Vergrößerung beträgt das 120-fache. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Abbildung 8: Bildsequenz aus der Hochgeschwindigkeitsfluoreszenzmikroskopie. (A) Erfolgreiche Abgabe fluoreszenzmarkierter Nanopartikel einer nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikrobläsche, die bei einer Ultraschallfrequenz von 2 MHz und einer akustischen Druckamplitude von 600 kPa insonifiziert ist. (B) Erfolglose Abgabe fluoreszenzmarkierter Nanopartikel einer nanopartikel- und proteinstabilisierten Mikrobläsche, die bei einer Ultraschallfrequenz von 2 MHz und einer akustischen Druckamplitude von 210 kPa insonifiziert ist. Maßstabsbalken = 10 μm. Die Vergrößerung beträgt das 120-fache. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Abbildung 9: Intravitale Mikroskopie nach Insonation von Nanopartikel- und Protein-stabilisierten Mikrobläschen bei einer Ultraschallfrequenz von 1 MHz und einer akustischen Druckamplitude von 800 kPa. (A) Nanopartikel im Gefäß und (B) eine Bildsequenz des Bereichs, der durch das weiß gestrichelte Quadrat in (A) angezeigt wird und die Extravasation von Dextran (grün) und Nanopartikeln (rot) darstellt. Maßstabsbalken = 50 μm. Die Vergrößerung beträgt das 20-fache. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Die vorgestellten Protokolle können verwendet werden, um die Reaktion von fluoreszenzmarkierten Mikrobläschen zu charakterisieren, die für ultraschallgesteuerte Arzneimittelabgabeanwendungen entwickelt wurden, einschließlich ihrer Aktivierungsmechanismen sowie ihrer Bioeffekte. Dieser Artikel behandelt eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Mikroskopietechniken , die durchgeführt werden, um die relevanten Längen- und Zeitskalen zu erfassen.

Multi-Timescale-Mikroskopie-Methoden zur Charakterisierung fluoreszenzmarkierter Mikroblasen für die ultraschallgesteuerte Wirkstofffreisetzung

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Reaktion von fluoreszierend markierten Mikrobläschen zu charakterisieren, die für ultraschallgesteuerte Arzneimittelabgabeanwendungen entwickelt wurden, einschließlich der Aktivierungsmechanismen und Bioeffekte. Der Schlüssel liegt in der Kombination von bildgebenden Verfahren, die es uns ermöglicht, das Multiskalenproblem der ultraschallgesteuerten Medikamentenabgabe mit Blasen sowohl auf verschiedenen räumlichen Skalen als auch auf verschiedenen Zeitskalen zu entwirren. Für die Einzelblasenbildgebung durch Hellfeldmikroskopie legen Sie eine 19-Gauge-Entlüftungsnadel und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um eine kleine Menge der Mikroblasensuspension aus der Glasfläschchen in ein kleines Röhrchen zu entfernen, um das Pipettieren im nächsten Schritt zu erleichtern.Verdünnen Sie die Mikrobläschenlösung mit einer Pipette in gefilterter phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, um die Probe in einen Auslass des Probenhalters zu injizieren, bis der Halter voll ist, ohne Luftblasen zu erzeugen, und spritzen Sie bei Bedarf mehr von der Probe. Schließen Sie beide Ventile des Probenhalters und platzieren Sie den Probenhalter senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops.Stellen Sie vor der Probenanalyse die gewünschte Ultraschall-Fahrfrequenz und den akustischen Druck auf den Arbiträrwellenformgenerator ein und beginnen Sie mit dem Sichtfeld in einer Ecke des Probenhalters, verwenden Sie die XYZ-Stufe, um den Halter zu bewegen, um einzelne Mikroblasen im Sichtfeld des Mikroskops zu lokalisieren, befestigen Sie dann eine optische Faser, die mit einem Wasserbad verbunden ist, an ein Stroboskoplicht und starten Sie die Aufzeichnung. Wiederholen Sie die Bildgebung so oft wie gewünscht pro Ultraschalleinstellung und bewegen Sie den Probenhalter mindestens zwei Millimeter in ein Sichtfeld, das für jede Analyse unspezifische Mikrobläschen enthält. Für die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung der Mikrobläschen stellen Sie nach dem Verdünnen der Mikrobläschenlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wie demonstriert die gewünschte Ultraschall-Fahrfrequenz und den akustischen Druck auf den beliebigen Wellenformgenerator ein und stellen Sie die Triggerverzögerung für den Laser auf den Pulsverzögerungsgenerator für die Fluoreszenzanregung der Nanopartikel aus den Mikroblasen ein, verwenden Sie dann die XYZ-Stufe, um den Probenhalter zu bewegen, um einzelne Mikrobläschen zu lokalisieren und sie in den Fokus der das Ziel, dann lösen Sie die Aufnahme aus.Wiederholen Sie die Bildgebung wie gewünscht, indem Sie die Ultraschalleinstellungen ändern und den Probenhalter wie gezeigt in das neue Sichtfeld verschieben. Für die Intravitalmikroskopie positionieren Sie zunächst einen beheizten Tierhalter auf der XY-Positionierstufe zwischen dem Wellenleiter und dem Objektiv und fügen dem Wellenleiter ein Kopplungsgel hinzu. Führen Sie einen Schwanzvenenkatheter in die Schwanzvene einer betäubten tumortragenden Maus ein und legen Sie die Maus mit einer Fensterkammer in den beheizten Halter.Fügen Sie einen Wassertropfen zum Deckglas hinzu. Um das Gefäßsystem des Tumorgewebes sichtbar zu machen, injizieren Sie intravenös 30 Mikroliter à vier Milligramm pro Milliliter fluoreszierend markierte 2 Megadalton-Dextran in den Schwanzvenenkatheter und bewegen die Maus mit dem XY-Translationsstadium, bis ein Sichtfeld mit geeigneten Blutgefäßen lokalisiert werden kann. Passen Sie die Bildrate, das Sichtfeld und die Länge der Aufzeichnung entsprechend den Parametern des Experiments an und zeichnen Sie Basisbilder der Gefäße auf.Wenn die Baseline-Bilder aufgenommen wurden, stellen Sie die Ultraschall-Fahrfrequenz, die Pulslänge und die akustische Druckamplitude auf den Arbiträrwellenformgenerator ein und injizieren Sie intravenös 50 Mikroliter Mikrobläschenprobe in die Schwanzvene. Stellen Sie sich dann das Gefäßsystem wie demonstriert vor. Die Analyse der Mikroblasen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine ungleichmäßige Partikelverteilung der Mikroblasenhülle.Die Gesamtstruktur der Mikrobläschen kann durch Rasterelektronenmikroskopie weiter visualisiert werden. Die Analyse der radialen Dynamik und des phänomenologischen Verhaltens von insonifizierter Mikrobläsche durch Hellfeldmikroskopie ermöglicht die Bewertung der relativen Änderung des Mikroblasenradius im Laufe der Zeit. Hier wird eine Bildsequenz einer typischen erfolgreichen Abgabe von fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln gezeigt.Es kann beobachtet werden, wie die in die Mikrobläschenhülle eingebetteten Nanopartikel fluoreszieren, wenn das Laserlicht die Blase erreicht. Wie bei dieser erfolglosen Abgabe beobachtet, leuchten die fluoreszierenden Nanopartikel jedoch auf die Hülle der Mikrobläsche, die während der Ultraschallexposition intakt bleibt. Die intravitale Multiphotonenbildgebung kann verwendet werden, um die räumliche und zeitliche Extravasation der Nanopartikel während der Ultraschallexposition zu bestimmen, was für das Verständnis und die Optimierung der Mechanismen, die der ultraschallvermittelten Nanopartikelabgabe zugrunde liegen, von Vorteil sein kann.Mit der perfekten Ausrichtung der optischen und akustischen Bahnen auf allen Längen- und Zeitskalen wird ein umfassender Einblick in die ultraschallgesteuerte Wirkstoffabgabe gegeben. Die Antworten unserer Multiskalenexperimente werden nun in die klinische Praxis übersetzt. Die Ergebnisse werden wertvolle Erkenntnisse für eine Reihe von therapeutischen Anwendungen, einschließlich der Krebstherapie, liefern.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Forschung

Biotechnik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetisches Wechselfeld-Responsive Hybrid Gelatine Mikrogele der gezielten Medikamentenapplikation

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...