Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

שיטות מיקרוסקופיה אופטיות שונות שולבו כדי לקבל מידע על השלבים השונים באספקת חלקיקים מפני השטח של microbubbles למדיום שמסביב. הדמיה של תנודות הבועה בוצעה, כמו גם הדמיה של שחרור הננו-חלקיקים מקליפת הבועה, ההפצה והחדירה דרך המטריצה החוץ-תאית של גידולים ב- vivo. הדמיה במבחנה מאפשרת סינון של פרמטרי אולטרסאונד רבים בהשוואה למערכות vivo המורכבות יותר. היתרון של שילוב מגוון זה של שיטות הדמיה הוא המידע המשלים שניתן להשיג בלוחות זמנים שונים - תכונה חיונית לאפיון ולייעול המיקרו-יבלות למסירה מוצלחת ולהשגת יעילות טיפולית. גישה זו שימושית כדי להבין את מנגנוני המסירה עבור כל microbubbles כאחד, כולל מבנים עם חלקיקים ותרופות תווית פלואורסצנטית.
השלבים הקריטיים ביותר בשיטות המיקרוסקופיה המשמשות לחקר מיקרו-יבלים בודדים הם כדלקמן. עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הננו-חלקיקים צריכים להיות מתויגים באופן פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה של שחרור החלקיקים. יתר על כן, הפתרון לדוגמה צריך להיות מדולל מספיק כדי לבודד microbubbles יחיד לניתוח בשיטות קונפוקליות, שדה בהיר, פלואורסצנטיות מיקרוסקופיות. בנוסף, חשוב לבחור תדר נהיגה אולטרסאונד ולחץ אקוסטי כדי לרגש את הבועות בצורה היעילה ביותר, כלומר בתהודה שלהם. אם שאלת המחקר נוגעת למסירת מטען הננו-חלקיקים, הפרמטרים המתאימים של אולטרסאונד צריכים להיות חלק מהחקירה. לצד תהודה, בועות אלה צריכות להיות מונעות גם בסף או מעבר לסף שלהם לשחרור ננו-חלקיקים, בדרך כלל במשבריעת לחץ אקוסטית גבוהה יחסית (MI > 0.3)51. להדמיית מיקרוסקופיה בעלת שדה בהיר, חשוב לבחור מצלמה במהירות גבוהה עם קצב מסגרת גבוה מספיק כדי למזער את טשטוש התנועה ולהימנע מכינוי.
מיקרוסקופיה של שדה בהיר מוגבלת בעיקר על ידי קצב הדמיה ועוצמת מקורות האור הזמינים, שכן קצב מסגרת גבוה יותר ייתן תובנה מפורטת יותר שנפתרה בזמן על דינמיקת הבועה, אך דורש תאורה אינטנסיבית יותר עקב זמני חשיפה קצרים יותר. כדי לחקור שחרור חלקיקים בפירוט רב יותר, מסגרת הדמיית פלואורסצנטית יכול, באופן עקרוני, להיות מוגבר על ידי הגדלת עוצמת אור הלייזר. עם זאת, ספיגת אור הלייזר בעוצמה גבוהה על ידי המיקרו-חלוקים המסומנים בפלואורסצנטיות מייצרת חום, אפילו עם צבעי תפוקה קוונטית גבוהים. חום זה יכול להפריע לניסויים על כף המאזניים, ובמקרים קיצוניים, לגרום cavitation פוטו-תרמי52. לכן, בפועל, יש גבול לשפעת הלייזר המיושמת. עם זאת, תאורת לייזר אינטנסיבית יכולה לשמש גם בכוונה כדי לגרום לשחרור חלקיקים ליפוזומים53. הטמפרטורה משפיעה על דינמיקת בועות ותגובת אולטרסאונד, בהתאם לסוג הבועה54. לכן, אם יש להשוות באופן אובייקטיבי את שיטות ההחמרה והאינטרה , שיטות ההחמרה שנידונו בפרוטוקול צריכות להתבצע ב-37 °C (50 °F). מגבלה נוספת של שיטות ההחצפה הנידונות במאמר הנוכחי היא שהבועות אינן בסביבה של שדה חופשי, שכן מיקרו-בועות יצופו מתחת לממברנה של מחזיק הדגימה. יתר על כן, יש הטיית בחירה בעת הדמיה מיקרו-נבלים בודדים. עם זאת, ביצוע ניסויים חוזרים ונשנים על בועות בודדות מאפשר לחקור את ההשפעה של גודל והסרה של הגורם מבלבל - התפלגות הגודל. אם ניתן להבין את תגובת הבועה כפונקציה בגודל בעוד הריכוז אינו גבוה מדי כדי למנוע אינטראקציות בועת בועה, ניתן לחשב את התגובה של כל אוכלוסיית בועה שרירותית. לבסוף, הן שיטות מיקרוסקופיה של שדה בהיר והן שיטות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות מספקות תובנה על מיקרו-חלוקים מפותלים בתמונה דו-ממדית (דו-ממדית). אם שאלת המחקר דורשת יותר מהדמיה דו-ממדית, ניתן לפתור את אופן הפעולה התלת-ממדי של הבועות על-ידי שילוב ההתקנה המתוארת בפרוטוקול עם הגדרת תצוגה צדדית להדמיה כפולה55.
שיטה חלופית לחקר מיקרו-נבלים היא אפיון אקוסטי56. עם זאת, מדידת ההד של microbubble יחיד דורש איתור ובידוד microbubble יחיד בתוך קרן אולטרסאונד56, אשר מציב אתגר בדרך כלל להתמודד על ידי שימוש בצינור צר או פינצטה אופטית או אקוסטית57,58. כדי להגדיל בועות אקוסטית, microbubbles יכול להיות סבון במשטר פיזור גיאומטרי בתדרים גבוהים בהרבה מתדר התהודה שלהם, אשר אינו גורם תנודות microbubble נפחי59. השימוש ב"מצלמה אקוסטית " היא שיטה כזו לדמיין את הדינמיקה הרדיאלית של מיקרו-בועות בודדות בתגובה לאולטרסאונד, שבה נעשה שימוש בבדיקת אולטרסאונד בתדר גבוה כדי לקבוע את התגובה הרדיאלית של הבועה לגל נהיגה בתדר נמוך60. החיסרון של שיטה זו הוא כי זה יכול לשמש רק כדי לקבוע את השינוי היחסי של רדיוס microbubble; לפיכך, דרושה שיטה אחרת כדי לקבוע את רדיוס הבועה המוחלט, למשל, באמצעות הדמיה אופטית61,62. החיסרון של שיטות שבהן microbubbles חשופים אולטרסאונד בתדרים גבוהים יותר מאשר תדירות התהודה שלהם הוא כי בתדרים גבוהים כאלה, עומק החדירה הוא ירד59, הגבלת השימושיות עבור יישומי vivo. צורות אחרות של מיקרוסקופיה עשויות לשמש גם לחקר מיקרו-חלוקים כגון סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, מיקרוסקופיה של כוח אטומי ומיקרוסקופיה אלקטרונית שידור63. הרזולוציה המרחבית-זמנית ברת השגה של טכניקות מיקרוסקופיות חלופיות אלה, עם זאת, היא בדרך כלל מוגבלת יותר, וטכניקות אלה יש את החיסרון כי הדמיה מבוצעת לפני או אחרי חשיפה אולטרסאונד על ידי ניתוח off-line ובדרך כלל להציג תפוקה נמוכה63. חלופה נוספת היא להשתמש בשיטת פיזור אור, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור דינמיקה רדיאלית של microbubbles יחיד בזמן אמת, אבל יש יחס אות לרעש נמוך בהשוואה לשיטות פיזור אקוסטי64.
מיקרוסקופיה תוך-ויאלית בזמן אמת במהלך חשיפה לאולטרסאונד היא שיטה רבת עוצמה לרכישת תובנה חדשה על כלי היתוך, התנהגות של microbubbles, חלקיקים, או מולקולות אחרות (כגון dextran במקרה זה) במהלך חשיפה אולטרסאונד. מגבלה כללית בעת ביצוע מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בזמן אמת היא שרק שטח קטן של הרקמה הוא בתמונה, ועומק החדירה של האור לרקמה מוגבל. אם כלי הדמיה מכילים מעט מאוד מיקרו-יבלים ו/או חלקיקים בתחום הראייה, ניתן להשיג מעט או ללא מידע על התנהגות הננו-חלקיקים וההפצה. בנוסף, בגלל שדה הראייה המוגבל, יישור נכון בין נתיבי האור לנתיבים אולטרסאונד הוא קריטי. אם לחץ האולטרסאונד גבוה מספיק כדי לגרום להרס בועה, חשוב גם לבחור תדירות חזרה דופק המאפשר בועות טריות reperfuse לתוך שדה הראייה בין פולסים אולטרסאונד. יתר על כן, כמו אולטרסאונד ישתקף מזכוכית הכיסוי בתא החלון ואת המטרה, הצבת המתמר בזווית חשוב להפחית השתקפויות כדי למנוע היווצרות של גלים עומדים, אשר מעוותים את שדה הלחץ מכויל. בעיה מעשית נוספת היא כי ההתקנה צריכה להיות מספיק מקום כדי להרכיב את מתמר אולטרסאונד waveguide מעל או מתחת למטרה במערך המיקרוסקופ. הגידולים בתא החלון הגב יהיה עובי מוגבל בשל תא confining ואת הפתק כיסוי; עם זאת, במידת הצורך, ניתן להשתמש בדגמים אחרים. דוגמאות הן גידולים בגלגלי העור, למשל, בפנקס השומן הממארי65 או הדמיה תוך-וינטלית בבטן של גידולים באיברים השונים66. גידולים כאלה יכולים לגדול באופן אורתופי במיקרו-סביבה המתאימה, וככאלה, מציגים מקרה רלוונטי יותר מבחינה קלינית.
השיטות המתוארות בעבודה זו מאירות את הפוטנציאל של microbubbles תווית פלואורסצנטית ללמוד את היסודות של יישומי משלוח סמים באמצעות בועות ואולטרסאונד. שילוב זה של שיטות מיקרוסקופיה מספק תובנה רבת ערך על תגובת microbubble לאינסונציה של אולטרסאונד ומרחב הפרמטר האקוסטי הקשור לה ומציג תצוגה ברורה של התנהגות המיקרו-חלוק והמטען על פני טווח רלוונטי של סולמות זמן ואורך.

אולטראסאונד היא טכניקת ההדמיה הרפואית הנפוצה ביותר. הוא אינו פולשני, מהיר, בטוח, חסכוני ונייד1,2,3. עם זאת, דם הוא פיזור אולטרסאונד עני, ואת הניגוד של בריכת הדם ניתן לשפר על ידי זריקה תוך ורידי של סוכני ניגוד אולטרסאונד3. ניגודיות משופרת זו של בריכת הדם מאפשרת כימות של זלוף איברים למטרות אבחון, למשל, בגילוי מחלת עורקים כלילית4 ומחלת כבד גרורתית5. ואכן, vasculature הגידול הוכח להיות גורם פרוגנוסטי חשוב6. מאמץ מחקרי גדול מכוון כעת להדמיה מולקולרית ממוקדת בסיוע מיקרו-יבלות ולתפירת חומרי ניגודיות לשימוש טיפולי.
סוכני ניגודיות אולטרסאונד זמין מסחרית בדרך כלל מורכבים השעיה של microbubbles מצופה7,8 עם קטרים הנעים בין 1 מיקרומטר ל 10 μm9. מאז microbubbles סוכן ניגוד אולטרסאונד הם מעט קטנים יותר מאשר תאי דם אדומים7, microbubbles יכול להגיע בבטחה אפילו נימים הקטנים ביותר מבלי ליצור חסימה3. Microbubbles יש מקדם אולטרסאונד מוגבר באופן דרמטי לעומת tissue10, בשל ליבת הגז הדחוס שלהם11. יתר על כן, הד microbubble הוא מאוד לא ליניארי, כלומר, הספקטרום שלה מכיל הרמוניות ותת-הרמוניה של תדר הנהיגה. בנוסף, כוח ההד תלוי מאוד בתגובת ההד של הבועה12. בעוד הרקמה מתפזרת רק באופן ליניארי, מספר קטן של microbubbles מספיק כדי להשיג רגישות גבוהה לזיהוי הדמיה הרמונית13,14. דור ניגודיות לא ליניארי זה יכול אפילו להיות חזק מספיק כדי לעקוב אחר בועות בודדות בגוף15.
הקליפה של סוכן ניגוד אולטרסאונד מייצבת את הבועות נגד פירוק והתמזגות, ובכך מגדילה את זמן זרימת הדם שלהם במאגר הדם16. הקליפה יכולה להיות מורכבת שומנים, פולימרים או חלבונים דנטוריים3,8. זה מקטין את המתח הבין-דתי, ובכך מגביל את ההשפעה של פירוק מונחה לחץ לפלס17 ויוצר מחסום התנגדותי נגד דיפוזיה של גז18. כדי להגביר עוד יותר את היציבות, microbubbles ניגודיות מלאים בדרך כלל בגז במשקל מולקולרי גבוה עם מסיסות נמוכה בדם11. מעטפת microbubble משנה באופן דרמטי את התגובה של microbubbles אינסונציה אולטרסאונד11. בועות גז לא מצופה יש תדר תהודה אופייני כי הוא פרופורציונלי הפוך לגודל שלהם תוספת של ציפוי שומנים מגדיל את תדירות התהודה ביחס לזה של buble לא מצופה בשל נוקשות מהותית של הקליפה3. יתר על כן, הקליפה ממפזרים אנרגיה באמצעות צמיגות מפלגתית, המהווה את המקור הדומיננטי של שיכוך עבור בועות מצופות3. למעטפת המייצבת יש יתרון נוסף שניתן לתפקד, למשל, על ידי כריכת ליגנדים מכוונים לפני השטח של מיקרו-יבלים. פילוח זה מאפשר יישומים רבים עבור בועות אלה, ובמיוחד, הדמיה מולקולרית עם אולטרסאונד14,19.
סוכני ניגוד Microbubble להחזיק הבטחה גדולה עבור יישומי משלוח סמים עם אולטרסאונד. Microbubbles מתנדנד בכליאה של כלי דם יכול לגרום microstreaming, כמו גם נורמלי מקומי גיסת לחצים על הקיר נימי3. בלחצים אקוסטיים גבוהים, תנודות משרעת גדולות עלולות להוביל לקריסת microbubble בתהליך אלים המכונה cavitation אינרציאלי, אשר, בתורו, עלול להוביל לקרע או פולציה של כלי הדם20. תופעות אלימות אלה יכולות לגרום bioeffects כגון sonopermeation21, שיפור הפזרנות של תרופות טיפוליות לתוך interstitium על פני הקיר אנדותל, או באופן צנחני או טרנסקולרי. זה עשוי גם לשפר את החדירה של סוכנים טיפוליים באמצעות מטריצה חוץ תאית של גידולים עשירים סטרומה21,22 ו biofilms23,24, אם כי מנגנון זה עדיין מובן היטב26.
משלוח תרופות בתיווך אולטראסאונד הראה תוצאות מבטיחות הן באופן פרה-קליני27,28 והן בניסויים קליניים22. יתר על כן, כאשר נעשה שימוש עם אולטרסאונד בתדר נמוך יחסית (~ 1 MHz), microbubbles דווחו באופן מקומי חולף מחסום הדם - מוח חדירות, ובכך לאפשר תרופות להיכנס פרנשימה המוח, הן במחקרים פרה קליניים ומחקרים קליניים29,30,31,32,33,34.
ישנן בדרך כלל שתי גישות לאספקת תרופות בתיווך אולטרסאונד: החומר הטיפולי יכול להיות מנוהל במשותף עם הבועות, או שניתן לחבר אותו או לטעון אותו במעטפת הבועה28,35,36. הגישה השנייה הוכח להיות יעיל יותר במונחים של משלוח סמים37. Microbubbles יכול להיות טעון עם תרופות או חומר גנטי encapsulated חלקיקים (ליפוזומים או ננו פולימריים) מחובר למעטפת או משולב ישירות במעטפת microbubble35,36. מיקרו-חלוקים טעונים בננו-חלקיקים יכולים להיות מופעלים על ידי אולטרסאונד (ממוקד) כדי לשחרר באופן מקומי את מטען הננו-חלקיקים28,33,38,39,40. אם microbubble כזה נמצא במגע ישיר עם תא, הוכח במבחנה כי המטען יכול אפילו להיות מופקד על הממברנה הציטופלסמית התא בתהליך שנקרא sonoprinting34,35.
מרחב פרמטר אולטרסאונד עבור אינסונציה microbubble הוא נרחב, ואת התנאים הביולוגיים in vivo להוסיף מורכבות נוספת. לכן, השילוב של אולטרסאונד ממוקד ו microbubbles ננו-חלקיקים מהווה אתגר בתחום של טיפולי ממוקדים.
מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לדמיין, בפירוט, את התגובה של microbubbles כפונקציה של הפרמטרים אולטרסאונד וללמוד את המנגנונים המובילים קרע פגז ושחרור לאחר מכן של חומר פגז תווית פלואורסצנטית. קבוצה זו של פרוטוקולים חלה על מיקרו-שטויות עם פגזים המכילים צבע פלואורסצנטי. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של המיקרו-חלוקים המיוצבים-חלקיקים והחלבון שפותחו ב-SINTEF (טרונדהיים, נורווגיה). בועות אלה מלאות בגז פרפלואורופרופן (C3F8) וננו-חלקיקים המייצבים את הקליפה מכילים NR668, שהיא נגזרת ליפופילית של צבע פלואורסצנטי אדום הנילוס38,43. הננו-חלקיקים מורכבים מפולי (2-אתיל-בוטיל ציאנואקרילט) (PEBCA) והם PEGylated. פונקציונליזציה עם פוליאתילן גליקול (PEG) מפחיתה אופוזוניזציה ופגוציטוזיס על ידי מערכת הפאגוציט המונונוקלארית, ובכך מאריכה את זמן זרימת הדם14,44. כתוצאה מכך, PEGylation מגדיל את כמות הננו-חלקיקים המגיעים לאתר היעד, ובכך משפר את יעילות הטיפול16. איור 2 ממחיש כיצד השימוש בארבע שיטות מיקרוסקופיה מאפשר לחוקרים לכסות את כל סולמות הזמן והאורך הרלוונטיים. יש לציין כי הרזולוציה המרחבית ברת השגה במיקרוסקופיה אופטית נקבעת על ידי מגבלת העקיפה, התלויה באורך הגל של האור והצמצם המספרי (NA) של המטרה ושל מקור תאורת האובייקט45. עבור המערכות בהישג יד, מגבלת הרזולוציה האופטית היא בדרך כלל 200 ננומטר. בנוסף, מיקרוסקופיה תוך-ויאלית יכולה לשמש לתמונה ברמה התת-תאית46. עבור מיקרו-בועות מיקרו-חלקיקים וחלבון המיוצבים המשמשים בעבודה זו, סולם האורך המינימלי הרלוונטי למיקרוסקופיה תוך-וינטלית הוא בגודל של נימים קטנים (≥10 מיקרומטר). בהפריה הדמיה אופטית במהירות גבוהה (10 מיליון פריימים לשנייה) והדמיה פלואורסצנטית במהירות גבוהה (500,000 פריימים לשנייה) מתוארים לניסויים עבור מיקרו-יבלים בודדים. הדמיית שדה בהיר במהירות גבוהה בלוחות זמנים של ננו-שניות מתאימה לחקר הדינמיקה הרדיאלית שנפתרה בזמן של הבועות הרוטפות. לעומת זאת, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות במהירות גבוהה מאפשרת הדמיה ישירה של שחרור הננו-חלקיקים המסומנים בפלואורסצנטיות. יתר על כן, המבנה של מעטפת microbubble ניתן לחקור באמצעות Z-מחסנית תלת מימדי (3D) קונפוקיסקופיה, וסריקה מיקרוסקופיה אלקטרונים (הפרוטוקול עבור האחרון אינו כלול בעבודה הנוכחית). מיקרוסקופיה תוך-וינטלית מורכבת משימוש במיקרוסקופיה רב-photon כדי לדמות גידולים הגדלים בתאי חלונות שריריים כדי לספק מידע בזמן אמת על זרימת הדם המקומית ועל גורלם של חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית ב- vivo47. השילוב של שיטות מיקרוסקופיה אלה מספק בסופו של דבר תובנה מפורטת על ההתנהגות של סוכני microbubble טיפולית בתגובה אולטרסאונד, הן במבחנה והן in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

סוכני ניגוד Microbubble להחזיק הבטחה גדולה עבור יישומי משלוח סמים עם אולטרסאונד. אנקפסולציה תרופות חלקיקים מפחית רעילות מערכתית ומגדיל את זמן זרימת הדם של התרופות. בגישה חדשנית לאספקת תרופות בסיוע microbubble, חלקיקים משולבים או על קליפות microbubble, המאפשר שחרור מקומי מופעל של מטען ננו-חלקיקים עם אולטרסאונד. הבנה מעמיקה של מנגנוני השחרור בתוך מרחב פרמטר אולטרסאונד עצום חיונית לשחרור יעיל ומבוקר. קבוצה זו של פרוטוקולים שהוצגו חלה על מיקרו-שטויות עם קליפה המכילה תווית פלואורסצנטית. כאן, ההתמקדות היא microbubbles טעון פולי (2-אתיל-בוטיל ציאנואקרילט) חלקיקים פולימריים, מסומם עם צבע אדום הנילוס שונה. החלקיקים קבועים בתוך קליפת קזאין דנטורית. המיקרו-יבלים מיוצרים על ידי ערבוב נמרץ, ויוצרים פיזור של גז פרפלואורופרופן בשלב הנוזלי המכיל קזאין וננו-חלקיקים, ולאחר מכן קליפת המיקרו-יבלים מורכבת מעצמה. מגוון טכניקות מיקרוסקופיה נדרשות כדי לאפיין את המיקרו-חלוקים המיוצבים בננו-חלקיקים בכל צירי הזמן הרלוונטיים של תהליך שחרור הננו-חלקיקים. פלואורסצנטיות של הננו-חלקיקים מאפשרת הדמיה קונפוקלית של מיקרו-יבלים בודדים, וחושף את התפלגות החלקיקים בתוך הקליפה. הפריה אולטרה-גבוהה הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה שדה בהיר ב 10 מיליון פריימים לשנייה מספק תובנה על דינמיקת הבועה בתגובה אינסונציה אולטרסאונד. לבסוף, שחרור ננו-חלקיקים מקליפת הבועה מוצג בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המבוצעת ב-500,000 פריימים לשנייה. כדי לאפיין את אספקת התרופה ב vivo, שחרור מופעל של חלקיקים בתוך vasculature ואת ההגזמה שלהם מעבר לשכבת אנדותל נחקר באמצעות מיקרוסקופיה תוך וינטלית בגידולים מושתל בתאי חלון עור אחורי, על פני ציר זמן של מספר דקות. השילוב של טכניקות אפיון משלימות אלה מספק תובנה ייחודית על התנהגותם של מיקרו-נבלים ושחרור המטען שלהם במגוון סולמות זמן ואורך, הן במבחנה והן ב- in vivo.

המיקרו-יבלים, המיוצרים כמתואר בפרוטוקול, נותחו בשיטות מיקרוסקופיות שונות ובלולי זמן שונים.
הפלואורסצנטיות של הננו-חלקיקים במיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 6A) מצביעה על כך שלקליפה יש התפלגות חלקיקים לא אחידה. שיטות מיקרוסקופיה אחרות יכולות לשמש לאפיון בועה. לדוגמה, איור 6B מציג את המבנה הכולל של המיקרו-חלוק באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, כפי שהוצג בעבודה הקודמת34.
דינמיקה רדיאלית והתנהגות בועה פנומנולוגית ניתן ללמוד באמצעות שיטת מיקרוסקופיה שדה בהיר במבחנה המתוארת שבה מיקרו-בועות צולמו ב -10 מיליון פריימים לשנייה. הרדיוס של מיקרו-נבלים בודדים חולץ עם הזמן באמצעות תסריט שנכתב בתוך הבית. דוגמה לתגובה רדיאלית כזו מוצגת באיור 7.
רצף תמונות של מסירת חלקיקים מוצלחת טיפוסית, כמתואר בסעיף 2.3.6, מוצג באיור 8A. ניתן לראות את הננו-חלקיקים המוטבעים במעטפת המיקרו-bblbble נדלקים עקב פלואורסצנטיות כאשר אור הלייזר מגיע לבועה. מונע על ידי אינסונציה אולטרסאונד, חלקיקי פלואורסצנטי לנתק את ליבת הגז של microbubbles והם מופקדים על הממברנה של מחזיק המדגם. לבסוף, הלייזר כבוי, וננו-חלקיקי הפלורסנט כבר לא מתרגשים. משלוח לא מוצלח של המטען בעל התווית הפלואורסצנטית של המיקרו-חלוקים נראה בדרך כלל כמו רצף התמונה המוצג באיור 8B, שבו חלקיקי הפלואורסצנט נדלקים על קליפת המיקרו-חלוק שנשארת שלמה במהלך חשיפה לאולטרה-סאונד.
מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת במהלך אולטרסאונד שימשה כדי לחקור את ההשפעות של אולטרסאונד ומיקרו-יבלים על התנהגות ננו-חלקיקים בדם, שיפור החדרות של כלי הדם הגידוליים ושיפור המסירה של חלקיקים. ניתן לאפיין את היקף וקינטיקה של חדירה לתוך המטריצה החוץ תאית כפונקציה של לחץ אקוסטי, תדירות ואורכי פעימה. ההשפעה של טיפול אולטרסאונד עשוי להשתנות ביחס לגודל ומורפולוגיה של כלי הדם וכתוצאה מכך כליאה של הבועה. כיצד הטיפול באולטרסאונד משפיע על זרימת הדם והכיוון ניתן לקבוע. ניסוי לדוגמה המציג את ההגזמה של חלקיקים לאורך זמן מוצג באיור 9 במדד מכני (MI) של 0.826. תוצאות של מיקרוסקופיה מולטיפוטונית תוך-ויאלית מפארות את ההגזמה המרחבית והטמפורלית של חלקיקים במהלך חשיפה לאולטרסאונד, אשר מועילה מאוד להבנה מלאה של המנגנונים שבבסיס משלוח אולטרסאונד בתיווך של חלקיקים ולייעל טכנולוגיות כאלה26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של מיקרו-חלוק עם קליפה של חלקיקים פולימריים בעלי תווית פלואורסצנטית בקזאין דנטורי. microbubbles הם בדרך כלל בין 1 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר קוטר. הננו-חלקיקים יש קוטר בעיקר בין 100 ננומטר ו 200 nm38. קיצור: C3F8 = גז פרפלואורופרופן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> איור 2: סקירה סכמטית המציגה את סרגלי הזמן והאורך הרלוונטיים עבור מיקרוסקופיה בהירה, פלואורסצנטית, קונפוקלית ומיקרוסקופיה תוך - וינטלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> איור 3: ייצוג סכמטי של ניסויי מיקרוסקופיה בשדה בהיר. (A) התקנה ניסיונית, (B) דיאגרמת התזמון ו-(C) מסגרת מוקלטת טיפוסית. סרגל קנה מידה ב - (C) = 10 מיקרומטר. קיצור: fps = מסגרות לשניה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> איור 4: ייצוג סכמטי של ניסויי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. (A) הגדרה ניסיונית, (B) דיאגרמת התזמון ו- (C) מסגרת מוקלטת טיפוסית. סרגל קנה מידה ב - (C) = 10 מיקרומטר. קיצור: fps = מסגרות לשניה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> איור 5: ייצוג סכמטי של ניסויים מיקרוסקופיים תוך-וינטליים. (A) התקנה ניסיונית, (B) דיאגרמת התזמון ו-(C) מסגרת מוקלטת טיפוסית. סרגל קנה מידה ב - (C) = 50 מיקרומטר. ירוק מתאים לדקסטרן-FITC ואדום לננו-חלקיקים. קיצור: GaAsP = גליום ארסניד פוספיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> איור 6: מבנה תלת-ממדי של מיקרו-חלוק יחיד המיוצב על-ידי חלקיקים וחלבון. (A) שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להציג את הננו-חלקיקים, ו-(B) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להציג את המבנה התלת-ממדי. (B) שוחזר עם הרשאה מ- 34. סרגל קנה מידה ב ( A) = 5 מיקרומטר; סרגל קנה מידה ב - (B) = 2 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> איור 7: תנודות כדוריות אופייניות של מיקרו-חלוק מיקרו-חלקיקים ומיוצב חלבונים ברדיוס של 2.89 מיקרומטר, שהוחלו בתדר אולטרסאונד של 1 מגה-הרץ ומשרעת לחץ אקוסטית של 142 kPa. (A-D) תמונות מההקלטה המהירה ומרדיוס הבועה המתאים בעקומת הזמן (למטה). סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר, והקו האדום מציין את הרדיוס ההתחלתי. פרופיל התאורה (יחידות שרירותיות) מצוין בצהוב. ההגדלה היא 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> איור 8: רצף תמונות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית במהירות גבוהה. (A) אספקה מוצלחת של חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית של מיקרו-חלוק ננו-חלקיקים ומיוצב חלבונים ביזום בתדר אולטרסאונד של 2 מגה-הרץ ומשרעת לחץ אקוסטית של 600 kPa. (B) אספקה לא מוצלחת של חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית של מיקרו-חלוק מיוצב בננו-חלקיקים וחלבון שהוססו בתדר אולטרסאונד של 2 מגה-הרץ ומשרעת לחץ אקוסטית של 210 kPa. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. ההגדלה היא 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> איור 9: מיקרוסקופיה תוך-וינטלית לאחר אינסונציה של מיקרו-חלוקים מיוצבים בננו-חלקיקים וחלבון בתדר אולטרסאונד של 1 מגה-הרץ ומשרעת לחץ אקוסטית של 800 kPa. (A) חלקיקים בתוך הכלי, ו-(B) רצף תמונה של האזור המצוין על ידי הריבוע המקווקו הלבן ב-(A) המתאר את ההפצה של dextran (ירוק) וננו-חלקיקים (אדום). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. ההגדלה היא פי 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

הפרוטוקולים המוצגים יכולים לשמש כדי לאפיין את התגובה של microbubbles תווית פלואורסצנטית המיועדים ליישומי משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד, כולל מנגנוני ההפעלה שלהם, כמו גם bioeffects שלהם. נייר זה מכסה מגוון של טכניקות מיקרוסקופיה במבחנה ו - in vivo המבוצעות כדי ללכוד את האורך ואת לוחות הזמנים הרלוונטיים.

שיטות מיקרוסקופיה מרובות זמן לאפיון של Microbubbles פלואורסצנטרית שכותרתו לשחרור תרופות מופעלות אולטרסאונד

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפיין את התגובה של microbubbles שכותרתו פלואורסצנטית המיועדים ליישומי משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד הכולל את מנגנוני ההפעלה ואת bioeffects. המפתח טמון בשילוב של טכניקות הדמיה המאפשר לנו לפענח את הבעיה הרב-בקנה מידה של משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד עם בועות, הן בקנה מידה מרחבי שונה והן בסקאלות זמן שונות. להדמיית בועה אחת על ידי מיקרוסקופיית ברייטפילד, הניחו מחט אוורור של 19 מד והשתמשו במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 19 מד כדי להסיר כמות קטנה של השעיית המיקרו-יבלים מ בקבוקון הזכוכית לצינור קטן להקטרה קלה יותר בשלב הבא.באמצעות פיפטה, לדלל את פתרון microbubble מלוחים פוספט מסונן. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי להזריק את המדגם לתוך שקע אחד של מחזיק המדגם עד המחזיק מלא מבלי ליצור בועות אוויר, הזרקת יותר של המדגם במידת הצורך. סגור את שני השסתומים של מחזיק המדגם והצב את מחזיק המדגם בניצב לציר האופטי של המיקרוסקופ.לפני ניתוח מדגם, להגדיר את תדר נהיגה אולטרסאונד הרצוי ולחץ אקוסטי על מחולל צורת הגל שרירותי והחל עם שדה הראייה בפינה אחת של מחזיק המדגם, להשתמש בשלב XYZ כדי להזיז את המחזיק כדי לאתר microbubbles יחיד בתחום הראייה של המיקרוסקופ, ולאחר מכן לצרף סיב אופטי מחובר לאמבט מים לאור מהבהב ולהתחיל את ההקלטה. חזור על ההדמיה כמה פעמים ככל הרצוי לכל הגדרת אולטרסאונד, העברת מחזיק המדגם לפחות שני מילימטרים לשדה ראייה המכיל microbubbles לא קולי עבור כל ניתוח. להדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של המיקרו-בובלים, לאחר דילול תמיסת המיקרו-חלוקים מלוחים חוצצים של פוספט כפי שהודגם, קבעו את תדר הנהיגה האולטרה-סאונד הרצוי והלחץ האקוסטי על מחולל צורת הגל השרירותי והגדירו את השהיית ההדק ללייזר במחולל עיכוב הדופק לערעור פלואורסצנטי של הננו-חלקיקים מהמיקרו-ביבובים, ואז השתמשו בשלב XYZ כדי להזיז את מחזיק המדגם כדי לאתר מיקרו-חלוקים בודדים ולהביא אותם למוקד של המטרה, ואז הפעל את ההקלטה.חזור על ההדמיה כרצונך על ידי שינוי הגדרות האולטרסאונד והעברת מחזיק המדגם לשדה הראייה החדש כפי שהודגם. להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית, מקם תחילה בעל חיים מחומם על במת מיקום XY בין מדריך הגל למטרה והוסף ג'ל צימוד למדריך הגלים. הכנס צנתר וריד זנב לתוך הווריד האחורי של עכבר נושא גידולים מרדים והכנס את העכבר מצויד בתא חלון לתוך המחזיק המחומם.מוסיפים טיפת מים לכיסוי. כדי לדמיין את vasculature רקמת הגידול, תוך ורידי להזריק 30 microliters של ארבעה מיליגרם למיליליטר פלואורסצנטרית שכותרתו 2 מגהדלטון dextran לתוך צנתר וריד הזנב ולהשתמש בשלב התרגום XY כדי להזיז את העכבר עד שדה ראייה עם כלי דם מתאימים ניתן לאתר. התאם את קצב הפריימים, שדה הראייה ואורך ההקלטה בהתאם לפרמטרים של הניסוי והקלט תמונות בסיסיות של כלי השיט.כאשר התמונות הבסיסיות נרכשו, להגדיר את תדר נהיגה אולטרסאונד, אורך הדופק, משרעת לחץ אקוסטי על גנרטור צורת גל שרירותי ולהזריק תוך ורידי 50 microliters של דגימת microbubble לתוך הווריד הזנב. לאחר מכן תצלם את כלי היתווה כפי שהודגם. ניתוח המיקרו-נבלים על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית חושף התפלגות חלקיקים לא אחידה של קליפת המיקרו-יבל.ניתן לדמיין עוד יותר את המבנה הכולל של המיקרו-יבלים על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. ניתוח הדינמיקה הרדיאלית וההתנהגות הפנומנולוגית של מיקרו-נבל יזום על ידי מיקרוסקופיית ברייטפילד מאפשר הערכת שווי של השינוי היחסי ברדיוס המיקרו-חלוק לאורך זמן. כאן, מוצג רצף תמונה של משלוח מוצלח טיפוסי של חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית.ניתן להבחין בננו-חלקיקים המוטבעים במעטפת המיקרו-חלוקים לפלורסצ'ה כאשר אור הלייזר מגיע לבועה. כפי שנצפה במשלוח לא מוצלח זה, עם זאת, חלקיקי פלואורסצנטי אור על הקליפה של microbubble, אשר נשאר שלם במהלך החשיפה אולטרסאונד. הדמיה רב-פוטונית תוך-ויאלית יכולה לשמש כדי לקבוע את הפזרנות המרחבית והזמןית של הננו-חלקיקים במהלך חשיפה לאולטרסאונד, אשר יכול להיות מועיל להבנה ואופטימיזציה של המנגנונים הבסיסיים של משלוח ננו-חלקיקים בתיווך אולטרסאונד.עם היישור המושלם של המסלולים האופטיים והאקוסטיקה בכל סולמות אורך וזמן, תובנה מקיפה על משלוח סמים המופעל על ידי אולטרסאונד מסופקת. התשובות שימסרו הניסויים הרב-קנה המידה שלנו יתורגמו כעת לפרקטיקה קלינית. התוצאות יספקו תובנות חשובות למגוון יישומים טיפוליים, כולל טיפול בסרטן.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

מוני Microgels לטין היברידי שדה-Responsive המגנטי לשחרור סמים מבוקר

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...