Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.

Sono stati combinati diversi metodi di microscopia ottica per ottenere informazioni sulle varie fasi della consegna delle nanoparticelle dalla superficie delle microbolle al mezzo circostante. È stata eseguita l'imaging delle oscillazioni della bolla, così come l'imaging del rilascio delle nanoparticelle dal guscio della bolla, lo stravaso e la penetrazione attraverso la matrice extracellulare dei tumori in vivo. L'imaging in vitro consente lo screening di molti parametri ecografici rispetto alle configurazioni in vivo più complesse. Il vantaggio di combinare questa gamma di modalità di imaging è l'informazione complementare che può essere ottenuta in diverse scale temporali - una caratteristica cruciale per caratterizzare e ottimizzare le microbolle per una consegna di successo e per ottenere l'efficacia terapeutica. Questo approccio è utile per comprendere i meccanismi di consegna per tutte le microbolle allo stesso modo, compresi i costrutti con nanoparticelle e farmaci marcati fluorescentemente.
I passaggi più critici nei metodi di microscopia utilizzati per studiare le singole microbolle sono i seguenti. Per la microscopia a fluorescenza, le nanoparticelle devono essere etichettate fluorescentemente per consentire la visualizzazione del rilascio di particelle. Inoltre, la soluzione campione deve essere diluita abbastanza da isolare singole microbolle per l'analisi in metodi di microscopia confocale, a campo luminoso e a fluorescenza. Inoltre, è importante scegliere una frequenza di guida ad ultrasuoni e una pressione acustica per eccitare le bolle nel modo più efficiente, vale a dire alla loro risonanza. Se la domanda di ricerca riguarda la consegna del carico utile della nanoparticella, i parametri ecografici appropriati dovrebbero far parte dell'indagine. Accanto alla risonanza, queste bolle dovrebbero anche essere guidate a o oltre la loro soglia per il rilascio di nanoparticelle, in genere ad ampiezze di pressione acustica relativamente elevate (MI > 0,3) 51. Per l'imaging al microscopio a campo luminoso, è fondamentale scegliere una telecamera ad alta velocità con un framerate sufficientemente elevato per ridurre al minimo la sfocatura del movimento ed evitare l'aliasing.
La microscopia a campo luminoso è principalmente limitata dal framerate di imaging e dall'intensità delle sorgenti luminose disponibili, poiché un framerate più elevato fornirebbe una visione più dettagliata risolta nel tempo della dinamica delle bolle, ma richiede un'illuminazione più intensa a causa di tempi di esposizione più brevi. Per studiare il rilascio di particelle in modo più dettagliato, il framerate per l'imaging a fluorescenza può, in linea di principio, essere aumentato aumentando l'intensità della luce laser. Tuttavia, l'assorbimento della luce laser ad alta intensità da parte delle microbolle marcate fluorescenti genera calore, anche con coloranti ad alta resa quantistica. Questo calore può interferire con gli esperimenti in gioco e, in casi estremi, indurre la cavitazione fototermica52. Quindi, in pratica, c'è un limite alla fluenza laser applicata. Tuttavia, l'intensa illuminazione laser può anche essere utilizzata deliberatamente per indurre il rilascio di particelle dai liposomi53. La temperatura influenza la dinamica delle bolle e la risposta agli ultrasuoni, a seconda del tipo di bolla54. Pertanto, se i metodi in vitro e intravitali devono essere confrontati obiettivamente, i metodi in vitro discussi nel protocollo devono essere eseguiti a 37 °C. Un'altra limitazione dei metodi in vitro discussi nel presente documento è che le bolle non si trovano in un ambiente a campo libero, poiché le microbolle fluttueranno sotto la membrana portacampioni. Inoltre, c'è un bias di selezione quando si visualizzano singole microbolle. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti ripetuti su singole bolle consente di studiare l'effetto delle dimensioni e la rimozione del fattore confondente, la distribuzione delle dimensioni. Se la risposta della bolla in funzione delle dimensioni può essere compresa mentre la concentrazione non è troppo alta per prevenire interazioni bolla-bolla, è possibile calcolare la risposta di qualsiasi popolazione di bolle arbitraria. Infine, entrambi i metodi di microscopia a campo luminoso e a fluorescenza forniscono informazioni sulle microbolle contorte in un'immagine bidimensionale (2D). Se la domanda di ricerca richiede più dell'imaging 2D, il comportamento 3D delle bolle può essere risolto combinando la configurazione descritta nel protocollo con una configurazione sideview per l'imaging multipiattaforma55.
Un metodo alternativo per studiare le microbolle è la caratterizzazione acustica56. Tuttavia, la misurazione dell'eco di una singola microbolla richiede la localizzazione e l'isolamento di una singola microbolla all'interno del fascio di ultrasuoni56, il che rappresenta una sfida tipicamente affrontata con l'uso di un tubo stretto o di pinzette ottiche o acustiche57,58. Per dimensionare le bolle acusticamente, le microbolle possono essere insonificate nel regime di scattering geometrico a frequenze molto più alte della loro frequenza di risonanza, che non induce oscillazioni volumetriche di microbolle59. L'uso di una "telecamera acustica" è un metodo per visualizzare la dinamica radiale di singole microbolle in risposta agli ultrasuoni, in cui una sonda ad ultrasuoni ad alta frequenza viene utilizzata per determinare la risposta radiale della bolla a un'onda di guida a bassa frequenza60. Lo svantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato solo per determinare il cambiamento relativo del raggio della microbolla; quindi, è necessario un altro metodo per determinare il raggio assoluto della bolla, ad esempio attraverso l'imaging ottico61,62. Lo svantaggio dei metodi in cui le microbolle sono esposte agli ultrasuoni a frequenze superiori alla loro frequenza di risonanza è che a frequenze così elevate, la profondità di penetrazione è diminuita59, limitando l'usabilità per le applicazioni in vivo. Altre forme di microscopia possono anche essere utilizzate per studiare microbolle come la microscopia elettronica a scansione, la microscopia a forza atomica e la microscopia elettronica a trasmissione63. La risoluzione spazio-temporale raggiungibile di queste tecniche di microscopia alternative, tuttavia, è generalmente più limitata e queste tecniche hanno lo svantaggio che l'imaging viene eseguito prima o dopo l'esposizione agli ultrasuoni mediante analisi off-line e in genere presentano un basso rendimento63. Un'altra alternativa è quella di utilizzare un metodo di diffusione della luce, che può essere utilizzato per studiare la dinamica radiale di singole microbolle in tempo reale, ma ha un basso rapporto segnale/rumore rispetto ai metodi di scattering acustico64.
La microscopia intravitale in tempo reale durante l'esposizione agli ultrasuoni è un metodo potente per acquisire nuove informazioni sulla vascolarizzazione, sul comportamento di microbolle, nanoparticelle o altre molecole (come il destro in questo caso) durante l'esposizione agli ultrasuoni. Una limitazione generale quando si esegue la microscopia intravitale in tempo reale è che viene riprodotta solo una piccola area del tessuto e la profondità di penetrazione della luce nel tessuto è limitata. Se i vasi ripresi contengono pochissime microbolle e/o nanoparticelle all'interno del campo visivo, è possibile ottenere poche o nessuna informazione sul comportamento delle nanoparticelle e sullo stravaso. Inoltre, a causa del campo visivo limitato, è fondamentale un corretto allineamento tra i percorsi luminosi e ultrasonici. Se la pressione degli ultrasuoni è abbastanza alta da indurre la distruzione delle bolle, è anche importante scegliere una frequenza di ripetizione degli impulsi che consenta alle bolle fresche di riperfondersi nel campo visivo tra gli impulsi ad ultrasuoni. Inoltre, poiché gli ultrasuoni saranno riflessi dal vetro di copertura nella camera della finestra e dall'obiettivo, posizionare il trasduttore ad angolo è importante per ridurre i riflessi in modo da prevenire la formazione di onde stazionarie, che distorcono il campo di pressione calibrato. Un altro problema pratico è che la configurazione deve avere spazio sufficiente per montare il trasduttore ad ultrasuoni e la guida d'onda sopra o sotto l'obiettivo nella configurazione del microscopio. I tumori nella camera della finestra dorsale avranno uno spessore limitato a causa della camera di confinamento e dello slittamento della copertura; tuttavia, se necessario, potrebbero essere utilizzati altri modelli. Esempi sono i tumori della piega cutanea, ad esempio, nel cuscinetto di grasso mammario65 o l'imaging intravitale addominale dei tumori nei vari organi66. Tali tumori possono essere coltivati ortotopicamente nel microambiente appropriato e, come tali, presentare un caso clinicamente più rilevante.
I metodi descritti in questo lavoro illuminano il potenziale delle microbolle marcate fluorescentemente per studiare i fondamenti delle applicazioni di somministrazione di farmaci utilizzando bolle e ultrasuoni. Questa combinazione di metodi di microscopia fornisce preziose informazioni sulla risposta delle microbolle all'insonazione ad ultrasuoni e sullo spazio dei parametri acustici associato e presenta una visione chiara del comportamento della microbolla e del carico utile su un intervallo rilevante di scale di tempo e lunghezza.

L'ecografia è la tecnica di imaging medico più utilizzata. È non invasivo, veloce, sicuro, economico e portatile1,2,3. Tuttavia, il sangue è uno scarso scatterer di ultrasuoni e il contrasto del pool sanguigno può essere migliorato da un'iniezione endovenosa di agenti di contrasto ad ultrasuoni3. Questo contrasto potenziato tra pool sanguigno consente la quantificazione della perfusione d'organo a fini diagnostici, ad esempio nella rilevazione della malattia coronarica4 e della malattia epatica metastatica5. In effetti, la vascolarizzazione tumorale ha dimostrato di essere un importante fattore prognostico6. Un importante sforzo di ricerca è ora diretto verso l'imaging molecolare mirato assistito da microbolle e gli agenti di contrasto su misura per uso terapeutico.
I mezzi di contrasto ad ultrasuoni disponibili in commercio consistono tipicamente in una sospensione di microbolle rivestite7,8 con diametri che vanno da 1 μm a 10 μm9. Poiché le microbolle con mezzo di contrasto ad ultrasuoni sono leggermente più piccole dei globuli rossi7, le microbolle possono raggiungere in modo sicuro anche i capillari più piccoli senza creare un'occlusione3. Le microbolle hanno un coefficiente di retrodiffusione ad ultrasuoni notevolmente aumentato rispetto al tessuto10, a causa del loro nucleo di gas comprimibile11. Inoltre, l'eco della microbolla è altamente non lineare, cioè il suo spettro contiene armoniche e subarmoniche della frequenza di guida. Inoltre, la forza dell'eco dipende fortemente dalla risposta risonante della bolla12. Mentre il tessuto si disperde solo linearmente, un piccolo numero di microbolle è sufficiente per ottenere un'elevata sensibilità di rilevamento nell'imaging armonico13,14. Questa generazione di contrasto non lineare può anche essere abbastanza forte da tracciare singole bolle nel corpo15.
Il guscio del mezzo di contrasto ad ultrasuoni stabilizza le bolle contro la dissoluzione e la coalescenza, aumentando così il loro tempo di circolazione nel pool sanguigno16. Il guscio può essere costituito da lipidi, polimeri o proteine denaturate3,8. Diminuisce la tensione interfacciale, limitando così l'effetto della dissoluzione guidata dalla pressione di Laplace17 e crea una barriera resistiva contro la diffusione del gas18. Per aumentare ulteriormente la stabilità, le microbolle di contrasto sono tipicamente riempite con un gas ad alto peso molecolare con bassa solubilità nel sangue11. Il guscio di microbolle cambia drasticamente la risposta delle microbolle all'insonazione ad ultrasuoni11. Le bolle di gas non rivestite hanno una frequenza di risonanza caratteristica che è inversamente proporzionale alla loro dimensione e l'aggiunta di un rivestimento lipidico aumenta la frequenza di risonanza rispetto a quella di un buble non rivestito a causa della rigidità intrinseca del guscio3. Inoltre, il guscio dissipa energia attraverso la viscosità dilatazionale, che costituisce la fonte dominante di smorzamento per le bolle rivestite3. Il guscio stabilizzante ha l'ulteriore vantaggio di poter essere funzionalizzato, ad esempio legando i ligandi di puntamento alla superficie delle microbolle. Questo targeting consente molte applicazioni per queste bolle e, in particolare, l'imaging molecolare con ultrasuoni14,19.
Gli agenti di contrasto a microbolle sono molto promettenti per le applicazioni di somministrazione di farmaci con ultrasuoni. Le microbolle oscillanti nel confinamento di un vaso sanguigno possono causare microstreaming e tensioni locali normali e di taglio sulla parete capillare3. A pressioni acustiche elevate, grandi oscillazioni di ampiezza possono portare al collasso di microbolle in un processo violento chiamato cavitazione inerziale, che, a sua volta, può portare alla rottura o all'invaginazione del vaso sanguigno20. Questi fenomeni violenti possono indurre bioeffetti come la sonopermeazione21, migliorando lo stravaso di farmaci terapeutici nell'interstizio attraverso la parete endoteliale, sia paracellulare che transcellulare. Può anche migliorare la penetrazione degli agenti terapeutici attraverso la matrice extracellulare dei tumori ricchi di stroma21,22 e dei biofilm23,24, sebbene questo meccanismo sia ancora poco compreso26.
La somministrazione di farmaci mediata da ultrasuoni ha mostrato risultati promettenti sia preclinicamente27,28 che in studi clinici22. Inoltre, se utilizzate con ultrasuoni a frequenza relativamente bassa (~1 MHz), è stato riportato che le microbolle aumentano localmente e transitoriamente la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo così ai farmaci di entrare nel parenchima cerebrale, sia in studi preclinici che clinici29,30,31,32,33,34.
Esistono generalmente due approcci alla somministrazione di farmaci mediata dagli ultrasuoni: il materiale terapeutico può essere co-somministrato con le bolle, oppure può essere attaccato o caricato nel guscio della bolla28,35,36. Il secondo approccio si è dimostrato più efficiente in termini di somministrazione dei farmaci37. Le microbolle possono essere caricate con farmaci o materiale genetico incapsulato in nanoparticelle (liposomi o nanocostrutture polimeriche) attaccate al guscio o incorporate direttamente nel guscio di microbolle35,36. Le microbolle caricate con nanoparticelle possono essere attivate da ultrasuoni (focalizzati) per rilasciare localmente il carico utile della nanoparticella28,33,38,39,40. Se una tale microbolla è in contatto diretto con una cellula, è stato dimostrato in vitro che il carico utile può anche essere depositato sulla membrana citoplasmatica cellulare in un processo chiamato sonoprinting34,35.
Lo spazio dei parametri ecografici per l'insonazione delle microbolle è ampio e le condizioni biologiche in vivo aggiungono ulteriore complessità. Pertanto, la combinazione di ultrasuoni focalizzati e microbolle caricate con nanoparticelle rappresenta una sfida nel campo delle terapie mirate.
Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire protocolli che possano essere utilizzati per visualizzare, in dettaglio, la risposta delle microbolle in funzione dei parametri ecografici e per studiare i meccanismi che portano alla rottura del guscio e al successivo rilascio del materiale del guscio marcato fluorescentemente. Questo insieme di protocolli è applicabile alle microbolle con gusci che contengono un colorante fluorescente. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica delle microbolle stabilizzate con nanoparticelle e proteine polimeriche sviluppate presso SINTEF (Trondheim, Norvegia). Queste bolle sono riempite con gas perfluoropropano (C3F8) e le nanoparticelle che stabilizzano il guscio contengono NR668, che è un derivato lipofilo del colorante fluorescente rosso nilo38,43. Le nanoparticelle sono costituite da poli(2-etil-butilcianoacrilato) (PEBCA) e sono PEGilate. La funzionalizzazione con glicole polietilenico (PEG) riduce l'opsonizzazione e la fagocitosi da parte del sistema fagocitario mononucleato, estendendo così il tempo di circolazione14,44. Di conseguenza, la PEGilazione aumenta la quantità di nanoparticelle che raggiungono il sito bersaglio, migliorando così l'efficacia del trattamento16. La Figura 2 illustra come l'uso di quattro metodi di microscopia consenta ai ricercatori di coprire tutte le scale di tempo e lunghezza rilevanti. Va notato che la risoluzione spaziale raggiungibile in microscopia ottica è determinata dal limite di diffrazione, che dipende dalla lunghezza d'onda della luce e dall'apertura numerica (NA) dell'obiettivo e da quella della sorgente di illuminazione dell'oggetto45. Per i sistemi in questione, il limite di risoluzione ottica è in genere di 200 nm. Inoltre, la microscopia intravitale può essere utilizzata per l'immagine a livello subcellulare46. Per le microbolle stabilizzate con nanoparticelle e proteine utilizzate in questo lavoro, la scala di lunghezza minima rilevante per la microscopia intravitale è la dimensione dei piccoli capillari (≥10 μm). Gli esperimenti di imaging ottico ad alta velocità in vitro (10 milioni di fotogrammi al secondo) e di imaging a fluorescenza ad alta velocità (500.000 fotogrammi al secondo) sono descritti per singole microbolle. L'imaging a campo luminoso ad alta velocità su scale temporali di nanosecondi è adatto per studiare la dinamica radiale risolta nel tempo delle bolle vibranti. Al contrario, la microscopia a fluorescenza ad alta velocità consente la visualizzazione diretta del rilascio delle nanoparticelle marcate fluorescentemente. Inoltre, la struttura del guscio di microbolle può essere studiata utilizzando la microscopia confocale tridimensionale (3D) Z-stack e la microscopia elettronica a scansione (il protocollo per quest'ultimo non è incluso nel lavoro attuale). La microscopia intravitale consiste nell'utilizzare la microscopia multifotonica per fotografare i tumori che crescono nelle camere delle finestre dorsali per fornire informazioni in tempo reale sul flusso sanguigno locale e sul destino delle nanoparticelle marcate fluorescentemente in vivo47. La combinazione di questi metodi di microscopia fornisce in definitiva una visione dettagliata del comportamento degli agenti di microbolle terapeutici in risposta agli ultrasuoni, sia in vitro che in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Gli agenti di contrasto a microbolle sono molto promettenti per le applicazioni di somministrazione di farmaci con ultrasuoni. L'incapsulamento di farmaci in nanoparticelle riduce la tossicità sistemica e aumenta il tempo di circolazione dei farmaci. In un nuovo approccio alla somministrazione di farmaci assistita da microbolle, le nanoparticelle sono incorporate in o su gusci di microbolle, consentendo il rilascio locale e innescato del carico utile della nanoparticella con ultrasuoni. Una conoscenza approfondita dei meccanismi di rilascio all'interno del vasto spazio dei parametri a ultrasuoni è fondamentale per un rilascio efficiente e controllato. Questo insieme di protocolli presentati è applicabile alle microbolle con un guscio contenente un'etichetta fluorescente. Qui, l'attenzione si concentra sulle microbolle caricate con nanoparticelle polimeriche poli (2-etil-butilici cianoacrilato), drogate con un colorante rosso nilo modificato. Le particelle sono fissate all'interno di un guscio di caseina denaturato. Le microbolle sono prodotte da una vigorosa agitazione, formando una dispersione di gas perfluoropropano nella fase liquida contenente caseina e nanoparticelle, dopo di che il guscio di microbolle si autoassembla. Una varietà di tecniche di microscopia sono necessarie per caratterizzare le microbolle stabilizzate con nanoparticelle in tutte le scale temporali rilevanti del processo di rilascio delle nanoparticelle. La fluorescenza delle nanoparticelle consente l'imaging confocale di singole microbolle, rivelando la distribuzione delle particelle all'interno del guscio. L'imaging in vitro ad altissima velocità utilizzando la microscopia a campo luminoso a 10 milioni di fotogrammi al secondo fornisce informazioni sulla dinamica delle bolle in risposta all'insonazione ad ultrasuoni. Infine, il rilascio di nanoparticelle dal guscio della bolla viene visualizzato al meglio mediante microscopia a fluorescenza, eseguita a 500.000 fotogrammi al secondo. Per caratterizzare la somministrazione di farmaci in vivo, il rilascio innescato di nanoparticelle all'interno della vascolarizzazione e il loro stravaso oltre lo strato endoteliale viene studiato utilizzando la microscopia intravitale in tumori impiantati nelle camere delle finestre dorsali della pelle, in un arco di tempo di diversi minuti. La combinazione di queste tecniche di caratterizzazione complementari fornisce una visione unica del comportamento delle microbolle e del loro rilascio di carico utile in una gamma di scale temporali e di lunghezza, sia in vitro che in vivo.

Le microbolle, prodotte come descritto nel protocollo, sono state analizzate utilizzando vari metodi di microscopia e in varie scale temporali.
La fluorescenza delle nanoparticelle in microscopia confocale (Figura 6A) indica che il guscio ha una distribuzione delle particelle non uniforme. Altri metodi di microscopia possono essere utilizzati per la caratterizzazione delle bolle. Ad esempio, la Figura 6B mostra la struttura complessiva della microbolla utilizzando la microscopia elettronica a scansione, come presentato in lavori precedenti34.
La dinamica radiale e il comportamento fenomenologico delle bolle possono essere studiati utilizzando il metodo di microscopia a campo luminoso in vitro descritto in cui le microbolle sono state fotografate a 10 milioni di fotogrammi al secondo. Il raggio delle singole microbolle è stato estratto nel tempo utilizzando uno script scritto internamente. Un esempio di tale risposta radiale è mostrato nella Figura 7.
Una sequenza di immagini della tipica consegna di nanoparticelle di successo, come descritto nella sezione 2.3.6, è mostrata nella Figura 8A. Le nanoparticelle incorporate nel guscio della microbolla possono essere viste illuminarsi a causa della fluorescenza quando la luce laser raggiunge la bolla. Guidate dall'insonazione ad ultrasuoni, le nanoparticelle fluorescenti si staccano dal nucleo gassoso delle microbolle e si depositano sulla membrana del portacampioni. Infine, il laser viene spento e le nanoparticelle fluorescenti non sono più eccitate. La consegna non riuscita del carico utile marcato fluorescente delle microbolle assomiglia in genere alla sequenza di immagini mostrata nella Figura 8B, in cui le nanoparticelle fluorescenti si illuminano sul guscio della microbolla che rimane intatta durante l'esposizione agli ultrasuoni.
La microscopia multifotonica intravitale in tempo reale durante gli ultrasuoni è stata utilizzata per studiare gli effetti degli ultrasuoni e delle microbolle sul comportamento delle nanoparticelle nel sangue, il miglioramento della permeabilità dei vasi sanguigni tumorali e il miglioramento della consegna delle nanoparticelle. L'estensione e la cinetica della penetrazione nella matrice extracellulare in funzione della pressione acustica, della frequenza e delle lunghezze degli impulsi possono essere caratterizzate. L'effetto del trattamento ad ultrasuoni può variare rispetto alle dimensioni e alla morfologia dei vasi e al conseguente confinamento della bolla. È possibile determinare in che modo il trattamento ecografico influisce sul flusso sanguigno e sulla direzione. Un esperimento di esempio che mostra lo stravaso di nanoparticelle nel tempo è mostrato nella Figura 9 con un indice meccanico (MI) di 0,826. I risultati della microscopia multifotonica intravitale chiariscono lo stravaso spaziale e temporale delle nanoparticelle durante l'esposizione agli ultrasuoni, il che è estremamente utile per la completa comprensione dei meccanismi alla base della somministrazione di nanoparticelle mediata da ultrasuoni e per ottimizzare tali tecnologie26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica di una microbolla con un guscio di nanoparticelle polimeriche marcate fluorescentemente in caseina denaturata. Le microbolle hanno un diametro compreso tra 1 μm e 10 μm. Le nanoparticelle hanno un diametro per lo più compreso tra 100 nm e 200 nm38. Abbreviazione: C3F8 = gas perfluoropropano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica schematica che mostra le scale di tempo e lunghezza rilevanti per la microscopia a campo luminoso, fluorescenza, confocale e intravitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figura 3: Rappresentazione schematica di esperimenti di microscopia a campo luminoso. (A) Configurazione sperimentale, (B) il diagramma temporale e (C) un tipico fotogramma registrato. Barra della scala in (C) = 10 μm. Abbreviazione: fps = fotogrammi al secondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figura 4: Rappresentazione schematica di esperimenti di microscopia a fluorescenza. (A) Configurazione sperimentale, (B) il diagramma di temporizzazione e (C) un tipico fotogramma registrato. Barra della scala in (C) = 10 μm. Abbreviazione: fps = fotogrammi al secondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figura 5: Rappresentazione schematica di esperimenti di microscopia intravitale. (A) Configurazione sperimentale, (B) il diagramma temporale e (C) un tipico fotogramma registrato. Barra della scala in (C) = 50 μm. Il verde corrisponde al destrano-FITC e il rosso alle nanoparticelle. Abbreviazione: GaAsP = fosfuro di arseniuro di gallio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figura 6: Struttura 3D di una singola microbolla stabilizzata con nanoparticelle e proteine. (A) Utilizzo della microscopia confocale per mostrare le nanoparticelle e (B) utilizzo di un microscopio elettronico a scansione per mostrare la struttura 3D. (B) è stato riprodotto con il permesso di34. Barra di scala in (A) = 5 μm; barra della scala in (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figura 7: Oscillazioni sferiche tipiche di una microbolla stabilizzata con nanoparticelle e proteine con raggio di 2,89 μm insonificate a una frequenza ultrasonica di 1 MHz e un'ampiezza di pressione acustica di 142 kPa. (A-D) Immagini dalla registrazione ad alta velocità e dal corrispondente raggio della bolla sulla curva temporale (in basso). Barre di scala = 5 μm e la linea rossa indica il raggio iniziale. Il profilo di illuminazione (unità arbitrarie) è indicato dal giallo. L'ingrandimento è 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figura 8: Sequenza di immagini dalla microscopia a fluorescenza ad alta velocità. (A) Consegna riuscita di nanoparticelle marcate fluorescentemente di una microbolla stabilizzata con nanoparticelle e proteine insonificata a una frequenza ultrasonica di 2 MHz e un'ampiezza di pressione acustica di 600 kPa. (B) Consegna infruttuosa di nanoparticelle marcate fluorescentemente di una microbolla stabilizzata con nanoparticelle e proteine insonificate a una frequenza ultrasonica di 2 MHz e un'ampiezza di pressione acustica di 210 kPa. Barre della scala = 10 μm. L'ingrandimento è 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figura 9: Microscopia intravitale dopo insonazione di microbolle stabilizzate con nanoparticelle e proteine a una frequenza ultrasonica di 1 MHz e un'ampiezza di pressione acustica di 800 kPa. (A) Nanoparticelle all'interno del vaso e (B) una sequenza di immagini dell'area indicata dal quadrato tratteggiato bianco in (A) raffigurante lo stravaso di destrano (verde) e nanoparticelle (rosso). Barre di scala = 50 μm. L'ingrandimento è 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

I protocolli presentati possono essere utilizzati per caratterizzare la risposta di microbolle marcate fluorescenti progettate per applicazioni di somministrazione di farmaci attivate da ultrasuoni, compresi i loro meccanismi di attivazione e i loro bioeffetti. Questo documento copre una serie di tecniche di microscopia in vitro e in vivo eseguite per catturare la lunghezza e le tempistiche pertinenti.

Metodi di microscopia multi-timescale per la caratterizzazione di microbolle marcate fluorescenti per il rilascio di farmaci attivati da ultrasuoni

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Questo protocollo può essere utilizzato per caratterizzare la risposta di microbolle marcate fluorescentemente progettate per applicazioni di somministrazione di farmaci attivate da ultrasuoni che includono i meccanismi di attivazione e i bioeffetti. La chiave sta nella combinazione di tecniche di imaging che ci consente di svelare il problema multi-scala della somministrazione di farmaci innescati da ultrasuoni con bolle, sia a diverse scale spaziali che a diverse scale temporali. Per l'imaging a bolla singola mediante microscopia Brightfield, posizionare un ago di sfiato calibro 19 e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 19 per rimuovere una piccola quantità della sospensione di microbolle dal flaconcino di vetro in un piccolo tubo per un tubo più facile nella fase successiva.Utilizzando una pipetta, diluire la soluzione di microbolle in soluzione salina tamponata con fosfato filtrato. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per iniettare il campione in una presa del portacampioni fino a quando il supporto non è pieno senza creare bolle d'aria, iniettando più del campione se necessario. Chiudere entrambe le valvole del portacampioni e posizionare il portacampioni perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio.Prima dell'analisi del campione, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni desiderata e la pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e, partendo dal campo visivo in un angolo del supporto del campione, utilizzare lo stadio XYZ per spostare il supporto per individuare singole microbolle nel campo visivo del microscopio, quindi collegare una fibra ottica collegata a un bagno d'acqua a una luce stroboscopica e avviare la registrazione. Ripetere l'imaging tutte le volte che si desidera per impostazione ecografica, spostando il portacampioni di almeno due millimetri in un campo visivo contenente microbolle non ioniche per ogni analisi. Per l'imaging microscopico a fluorescenza delle microbolle, dopo aver diluito la soluzione di microbolle in soluzione salina tamponata con fosfato come dimostrato, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni desiderata e la pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e impostare il ritardo di innesco per il laser sul generatore di ritardo dell'impulso per l'eccitazione a fluorescenza delle nanoparticelle dalle microbolle, quindi utilizzare lo stadio XYZ per spostare il portacampioni per individuare singole microbolle e portarle a fuoco di l'obiettivo, quindi attivare la registrazione.Ripetere l'imaging come desiderato modificando le impostazioni ecografiche e spostando il portacampioni nel nuovo campo visivo come dimostrato. Per l'imaging mediante microscopia intravitale, posizionare prima un supporto animale riscaldato sullo stadio di posizionamento XY tra la guida d'onda e l'obiettivo e aggiungere gel di accoppiamento alla guida d'onda. Inserire un catetere della vena della coda nella vena della coda di un topo tumore anestetizzato e posizionare il mouse dotato di una camera della finestra nel supporto riscaldato.Aggiungere una goccia d'acqua alla copertina. Per visualizzare la vascolarizzazione del tessuto tumorale, iniettare per via endovenosa 30 microlitri di quattro milligrammi per millilitro marcati fluorescentemente 2 megadalton destro nel catetere della vena della coda e utilizzare lo stadio di traduzione XY per spostare il topo fino a quando non è possibile individuare un campo visivo con vasi sanguigni adatti. Regola la frequenza dei fotogrammi, il campo visivo e la lunghezza della registrazione in base ai parametri dell'esperimento e registra le immagini di base delle navi.Quando le immagini di base sono state acquisite, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni, la lunghezza dell'impulso e l'ampiezza della pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e iniettare per via endovenosa 50 microlitri di campione di microbolle nella vena della coda. Quindi visualizzare la vascolarizzazione come dimostrato. L'analisi delle microbolle mediante microscopia a fluorescenza confocale rivela una distribuzione non uniforme delle particelle del guscio di microbolle.La struttura complessiva delle microbolle può essere ulteriormente visualizzata mediante microscopia elettronica a scansione. L'analisi della dinamica radiale e del comportamento fenomenologico della microbolla insonificata mediante microscopia Brightfield consente di valutare la variazione relativa del raggio della microbolla nel tempo. Qui, viene mostrata una sequenza di immagini di una tipica consegna di successo di nanoparticelle marcate fluorescentemente.Le nanoparticelle incorporate nel guscio di microbolle possono essere osservate fluorescere quando la luce laser raggiunge la bolla. Come osservato in questa consegna infruttuosa, tuttavia, le nanoparticelle fluorescenti si illuminano sul guscio della microbolla, che rimane intatta durante l'esposizione agli ultrasuoni. L'imaging multi-fotone intravitale può essere utilizzato per determinare lo stravaso spaziale e temporale delle nanoparticelle durante l'esposizione agli ultrasuoni, che può essere utile per comprendere e ottimizzare i meccanismi alla base della somministrazione di nanoparticelle mediata da ultrasuoni.Con il perfetto allineamento dei percorsi ottici e acustici a tutte le scale temporali e di lunghezza, viene fornita una visione completa della somministrazione di farmaci attivata dagli ultrasuoni. Le risposte fornite dai nostri esperimenti multiscala saranno ora tradotte nella pratica clinica. I risultati forniranno preziose informazioni per una serie di applicazioni terapeutiche, compresa la terapia del cancro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Sintesi, assemblaggio e caratterizzazione di film monostrato Protetta delle nanoparticelle d&#39;oro per Elettrochimica proteine ​​monostrato

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Alternando microgel ibrida Gelatina di campo magnetico-Responsive per Controlled Drug uscita

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

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Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

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Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Scansione automatizzata Slide e segmentazione nei tessuti fluorescente-identificati utilizzando un sistema di analisi di Widefield ad alto contenuto

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Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

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Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

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Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...