Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

상이한 광학 현미경법은 마이크로버블 표면으로부터 주변 배지로 나노입자를 전달하는 다양한 단계에 대한 정보를 얻기 위해 결합되었다. 기포 진동의 이미징은 기포 껍질에서 나노 입자의 방출, 사치화 및 생체 내 종양의 세포외 매트릭스를 통한 침투의 이미징뿐만 아니라 수행되었다. 시험관 내 이미징은 생체 내 설정에서 더 복잡한에 비해 많은 초음파 매개 변수의 검사를 가능하게합니다. 이미징 양식의이 범위를 결합의 장점은 다른 시간대에 얻을 수있는 보완 정보입니다 - 성공적인 전달을 위해 마이크로 버블을 특성화하고 최적화하고 치료 효능을 얻기 위해 중요한 기능. 이 접근법은 형광으로 표지된 나노입자 및 약물을 가진 구조를 포함하여 모든 마이크로버블에 대한 전달 메커니즘을 이해하는 데 유용합니다.
단일 마이크로 버블을 연구하는 데 사용되는 현미경 검사법에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다. 형광 현미경 검사법의 경우 나노 입자는 입자 방출의 시각화를 가능하게하기 위해 형광 으로 표시되어야합니다. 또한, 시료 용액은 공초점, 밝은 분야 및 형광 현미경 법에서 분석을 위해 단일 마이크로 버블을 분리할 만큼 충분히 희석되어야 합니다. 또한, 초음파 운전 주파수와 음향 압력을 선택하여 거품을 가장 효율적으로 자극하는 것이 중요합니다. 연구 질문이 나노 입자 탑재하중의 전달에 관한 경우 적절한 초음파 매개 변수는 조사의 일부가되어야합니다. 공명 옆에, 이 거품은 또한 나노 입자 방출을 위한 그들의 임계값 에서 또는 그 이상으로, 일반적으로 상대적으로 높은 음향 압력 진폭에서 (MI > 0.3)51에서 구동되어야 합니다. 밝은 필드 현미경 이미징의 경우 모션 블러를 최소화하고 별칭을 피하기에 충분한 프레임 레이트가 있는 고속 카메라를 선택하는 것이 중요합니다.
밝은 필드 현미경 검사는 주로 사용 가능한 광원의 이미징 프레임 속도와 강도에 의해 제한됩니다, 높은 프레임 레이트 거품 역학에 대한 보다 상세한 시간 해결 통찰력을 줄 것이다, 그러나 짧은 노출 시간으로 인해 더 강렬한 조명이 필요합니다. 입자 방출을 보다 자세하게 연구하기 위해 형광 이미징의 프레임레이트는 원칙적으로 레이저 광의 강도를 증가시킴으로써 증가할 수 있습니다. 그러나 형광 라벨이 부착된 마이크로버블에 의한 고강도 레이저 광의 흡수는 높은 양자 수율 염료로도 열을 생성합니다. 이 열은 위험에 실험을 방해 할 수 있으며, 극단적 인 경우, 사진 열 캐비테이션을 유도52. 따라서 실제로 는 적용된 레이저 연도에 제한이 있습니다. 그러나, 강렬한 레이저 조명은 또한 리포솜53에서 입자 방출을 유도하기 위하여 의도적으로 사용될 수 있다53. 온도는 버블 타입54에 따라 기포 역학 및 초음파 반응에 영향을 미칩니다. 따라서 시험관 내 및 인트라베이티 방법을 객관적으로 비교해야 하는 경우 프로토콜에서 논의된 체외 방법을 37°C에서 수행해야 한다. 현재 논문에서 논의된 시험관 내 방법의 또 다른 제한은 마이크로 버블이 샘플 홀더 멤브레인 아래에 떠 있기 때문에 거품이 자유 필드 환경에 있지 않다는 것입니다. 더욱이, 단일 마이크로버블을 이미징할 때 선택 편향이 있다. 그러나 단일 버블에 대한 반복적인 실험을 수행하면 혼동하는 계수-크기 분포의 크기 및 제거의 효과를 조사할 수 있습니다. 기포의 함수로서 거품 반응이 이해될 수 있는 반면 농도가 너무 높지 않아 기포-버블 상호 작용을 방지할 수 있으며 임의의 거품 집단의 반응을 계산할 수 있다. 마지막으로, 밝은 필드와 형광 현미경 검사법은 모두 2차원 (2D) 이미지로 응축된 마이크로 버블에 대한 통찰력을 제공합니다. 연구 질문이 2D 이미징 이상을 필요로 하는 경우, 프로토콜에 설명된 설정을 멀티플레인 이미징55에 대한 사이드뷰 설정과 결합하여 거품의 3D 동작을 해결할 수 있다.
마이크로 버블을 연구하는 다른 방법은 음향 특성56입니다. 그러나 단일 마이크로버블의 에코를 측정하려면 초음파 빔56 내에서 단일 마이크로버블을 찾아 격리해야 하며, 이는 일반적으로 좁은 튜브 또는 광학 또는 음향 핀셋57,58의 사용에 의해 다루어지는 과제를 제기한다. 음향적으로 거품의 크기를 지정하기 위해, 마이크로 버블은 공진 빈도보다 훨씬 높은 주파수에서 기하학적 산란 정권에서 소음될 수 있으며, 이는 체피 마이크로버블 진동을 유도하지 않는다59. "음향 카메라"의 사용은 초음파에 반응하여 단일 마이크로 버블의 방사형 역학을 이미지화하는 방법이며, 여기서 고주파 초음파 프로브는 저주파 구동 wave60에 버블의 방사형 반응을 결정하는 데 사용된다. 이 방법의 단점은 마이크로 버블 반경의 상대적 변화를 결정하는 데만 사용될 수 있다는 것입니다. 따라서 광학 이미징61,62를 통해 절대 버블 반경(예: 절대 버블 반경)을 결정하기 위한 또 다른 방법이 필요하다. 마이크로버블이 공진 빈도보다 높은 주파수에서 초음파에 노출되는 방법의 단점은 이러한 높은 주파수에서 침투 깊이가 감소하여 생체 내 적용에 대한 유용성을 제한한다는 것이다. 현미경 검사법의 그밖 양식은 또한 전자 현미경 검사법, 원자력 현미경 검사법 및 전송 전자 현미경63와 같은 마이크로 버블을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나 이러한 대체 현미경 기술의 달성 가능한 주걱-측두형 해상도는 일반적으로 더 제한적이며, 이러한 기술은 화상 진찰이 오프 라인 분석에 의해 초음파 노출 전후에 수행되고 전형적으로 낮은 처리량을 제시하는 단점이 있다63. 또 다른 대안은 단일 마이크로 버블의 방사형 역학을 실시간으로 연구하는 데 사용할 수 있지만 음향 산란 방법에 비해 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지는 광 산란 방법을 사용하는 것입니다64.
초음파 노출 중 실시간 내 비생체 현미경 검사는 초음파 노출 시 혈관, 미세 거품, 나노 입자 또는 기타 분자 (예 : 이 경우 dextran)에 대한 새로운 통찰력을 습득하는 강력한 방법입니다. 실시간 인트라비티 현미경 검사를 수행할 때 일반적인 제한은 조직의 작은 영역만 이미지화되고, 조직의 침투 깊이가 제한적이라는 것입니다. 이미지 된 용기가 시야 내에서 거의 또는 나노 입자를 포함하는 경우 나노 입자 거동 및 사치에 대한 정보가 거의 또는 전혀 없습니다. 또한 시야가 제한되어 있기 때문에 빛과 초음파 경로 간의 적절한 정렬이 중요합니다. 초음파 압력이 거품 파괴를 유도할 만큼 충분히 높으면, 신선한 거품이 초음파 펄스 사이의 시야로 재퍼퓨즈할 수 있는 펄스 반복 주파수를 선택하는 것도 중요합니다. 더욱이, 초음파가 창챔버내의 커버글래스로부터 반사되기 때문에, 트랜스듀서를 비스듬히 배치하는 것은 보정된 압력필드를 왜곡하는 서파도의 형성을 방지하는 것으로 반사를 줄이는 것이 중요하다. 또 다른 실질적인 문제는 현미경 설정의 목표 위 또는 아래에 초음파 트랜스듀서와 파도관을 장착할 충분한 공간이 필요하다는 것입니다. 등쪽 창 챔버내의 종양은 수축 챔버 및 커버 슬립으로 인해 제한된 두께를 가질 것이다; 그러나 필요한 경우 다른 모델을 사용할 수 있습니다. 예는 피부 접이식 종양, 예를 들어, 유방 지방 패드65 또는 다양한 기관에서 종양의 복부 내 생명 화상 진찰에 66. 이러한 종양은 적절한 미세 환경에서 정형소적으로 재배될 수 있으며, 따라서 보다 임상적으로 관련된 사례를 제시한다.
이 작품에 설명된 방법은 거품과 초음파를 사용하여 약물 전달 응용 프로그램의 기초를 연구하기 위해 형광 라벨마이크로 버블의 잠재력을 계몽합니다. 현미경 방법의 이 조합은 초음파 음광 및 관련 음향 매개 변수 공간에 대한 마이크로 버블 반응에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 관련 범위의 시간과 길이 스케일에 대한 마이크로 버블 및 페이로드 동작에 대한 명확한 전망을 제공합니다.

초음파는 가장 널리 사용되는 의료 영상 기술입니다. 그것은 비 침습적, 빠른, 안전, 비용 효율적인, 휴대용1,2,3입니다. 그러나, 혈액은 가난한 초음파 산란기이며, 혈액 풀의 대비는 초음파 조영제3의 정맥 주사에 의해 강화 될 수있다3. 이러한 향상된 혈액 풀 콘트라스트는 관상 동맥 질환4 및 전이성 간 질환의 검출과 같은 진단 목적으로 기관 관류의 정량화를 가능하게 합니다5. 실제로, 종양 혈관은 중요한 예후 인자6인것으로 입증되었다6. 주요 연구 노력은 지금 치료 사용을 위한 microbubble 지원, 표적으로 한 분자 화상 진찰 및 조정 대비 에이전트를 향해 지시됩니다.
시판되는 초음파 조영제는 전형적으로 1 μm에서 10 μm9에 이르는 직경을 가진 코팅된 마이크로버블7,8의 현탁액으로 구성됩니다. 초음파 조영제 마이크로 버블은 적혈구보다 약간 작기 때문에7, 마이크로 버블은 폐색을 생성하지 않고 도작은 모세 혈관에도 안전하게 도달 할 수 있습니다3. 마이크로 버블은 압축 가스 코어11로 인해 조직10에 비해 초음파 백스캐터계수를 극적으로 증가시켰습니다. 또한, 마이크로 버블 에코는 매우 비선형, 즉, 그 스펙트럼은 구동 주파수의 고조파 및 하모니를 포함합니다. 또한, 에코 강도는 bubble12의 공명 반응에 크게 의존한다. 조직이 선형으로만 산란하는 동안, 소수의 마이크로 버블은 고조파 이미징13,14에서 높은 검출 감도를 달성하기에 충분합니다. 이 비선형 대비 생성은 신체의 단일 거품을 추적할 만큼 충분히 강할 수 있습니다15.
초음파 조영제의 껍질은 용해 및 결합에 대한 거품을 안정화시켜 혈액 풀16에서의 순환 시간을 증가시다. 껍질은 지질, 폴리머 또는 변성 단백질3,8로 구성될 수 있다. 그것은 얼굴 내 장력을 감소시켜 라플라스 압력 구동 용해17의 효과를 제한하고 가스 확산에 대한 저항 장벽을 만듭니다18. 안정성을 더욱 높이기 위해, 콘트라스트 마이크로버블은 전형적으로 혈중 용해도가 낮은 고분자 가기로 채워진다11. 마이크로 버블 쉘은 초음파 insonation1에 마이크로 버블의 반응을 극적으로 변화시다. 코팅되지 않은 가스 기포는 크기에 반비례하는 특징적인 공명 주파수를 가지며 지질 코팅을 첨가하면 쉘3의 본질적인 강성으로 인해 코팅되지 않은 부블의 공진 빈도가 증가합니다. 또한, 쉘은 팽창 점도를 통해 에너지를 발산하며, 이는 코팅 된 거품3에 대한 감쇠의 지배적 인 소스를 구성합니다. 안정화 쉘은 마이크로버블 표면에 리간드를 결합하여 기능화될 수 있다는 추가적인 이점을 갖는다. 이 표적화는 이러한 거품에 대한 많은 응용 프로그램을 가능하게하고, 특히 초음파14,19를 가진 분자 이미징.
마이크로 버블 조영제는 초음파로 약물 전달 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 혈관의 감금에서 진동하는 마이크로 버블은 모세관 벽에 국소 정상 및 전단 응력을 유발할 뿐만 아니라 마이크로 스트림을 유발할 수 있습니다3. 높은 음향 압력에서, 큰 진폭 진동은 관성 캐비테이션이라고 불리는 폭력적인 과정에서 마이크로 버블 붕괴로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 혈관의 파열 또는 질로 이어질 수 있다20. 이러한 폭력적인 현상은 sonopermeation21과 같은 생체 효과를 유도할 수 있으며, 내피 벽을 가로 질러 중질 비질로 치료 약물의 사치를 향상시킬 수 있습니다. 그것은 또한 stroma 풍부한 종양의 세포외 매트릭스를 통해 치료 약제의 침투를 향상시킬 수 있습니다21,22 및 biofilms23,24, 비록이 메커니즘은 여전히 제대로 이해 26.
초음파 매개 약물 전달은 전임상 27,28 및 임상 시험22모두에서 유망한 결과를 보여주었습니다. 더욱이, 상대적으로 저주파 초음파(~1MHz)와 함께 사용될 경우, 마이크로버블은 국소로 보고되어 혈액-뇌 장벽 투과성을 일시적으로 증가시켜 전임상 및 임상 연구에서 29,31,32,33,34로 뇌 의 반구를 입력할 수 있게 되었다.
초음파 매개 약물 전달에 대한 일반적으로 두 가지 접근법이 있습니다: 치료 물질은 거품과 함께 공동 투여될 수 있거나, 또는 버블 쉘28,35,36에 부착되거나 적재될 수 있다. 두 번째 접근법은 약물 전달37 측면에서 보다 효율적인 것으로 나타났습니다. 마이크로버블은 나노입자(리포솜 또는 중합체 나노구조)에 캡슐화된 약물 또는 유전물질을 포함하거나 쉘에 부착되거나 마이크로버블 쉘35,36에 직접 통합될 수 있다. 나노입자로 적재된 마이크로버블은 (집중) 초음파에 의해 활성화되어 나노입자 페이로드28,33,38,39,40을 국소적으로 방출할 수 있다. 이러한 마이크로버블이 세포와 직접 접촉하는 경우, 탑재하중이 sonoprinting34,35라고 하는 공정에서 세포 세포막에 증착될 수 있다는 것을 시험관내에서 보여 왔다.
마이크로 버블 소네이션을 위한 초음파 매개변수 공간은 광범위하며 생체 내 생물학적 조건은 더욱 복잡성을 더합니다. 따라서, 집중초음파와 나노입자로 적재된 마이크로버블의 조합은 표적 치료제 분야에서 도전과제를 제기한다.
이 작업의 목적은 초음파 매개 변수의 함수로서 마이크로 버블의 반응을 이미지화하고 형광 표지 쉘 재료의 쉘 파열 및 후속 방출로 이어지는 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜 집합은 형광염을 포함하는 쉘이 있는 마이크로버블에 적용됩니다. 도 1은 SINTEF(Trondheim, 노르웨이)에서 개발된 중합체 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블의 회로도 표현을 나타낸다. 이들 기포는 퍼플루오로프로판 가스(C3F8)와 쉘을 안정화시키는 나노입자로 채워져 있으며, 이는 나일홍형염염색제38,43의 지동성 유도체인 NR668을 함유하고 있다. 나노 입자는 폴리 (2-에틸 부틸 시아노아크라이레이트)(PEBCA)로 구성되며 PEGylated된다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 기능화하면 단일 핵 식세포 시스템에 의한 편형성 및 식세포증을 감소시켜 순환 시간을 14,44로 연장시킨다. 그 결과, PEGylation은 표적 부위에 도달하는 나노입자의 양을 증가시켜 치료의 효능을 향상시킨다16. 그림 2는 4개의 현미경 방법의 사용이 연구원이 모든 관련 시간 및 길이 비늘을 커버하는 방법을 보여줍니다. 광학 현미경 검사법에서 달성 가능한 공간 해상도는 목표의 빛및 수치 조리개(NA)의 파장및 개체 조명 소스45의 파장에 의존하는 회절 제한에 의해 결정된다는 점에 유의해야 한다. 현재 시스템의 경우 광학 해상도 제한은 일반적으로 200nm입니다. 추가적으로, 비중요한 현미경 검사는 세포 외 수준46에 심상에 이용될 수 있습니다. 이 작업에 사용되는 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블의 경우, 근위 내 현미경 검사법과 관련된 최소 길이 척도는 작은 모세혈관(≥10 μm)의 크기이다. 시험관 내 고속 광학 이미징(초당 1,000만 프레임) 및 고속 형광 이미징(초당 500,000프레임) 실험은 단일 마이크로버블에 대해 설명되어 있습니다. 나노초 타임스케일의 고속 밝은 필드 이미징은 진동 기포의 시간 해결 된 방사형 역학을 연구하는 데 적합합니다. 대조적으로, 고속 형광 현미경 검사는 형광 표지 나노 입자의 방출의 직접 시각화를 허용합니다. 더욱이, 마이크로버블 쉘의 구조는 Z-스택 3차원(3D) 공초점 현미경검사법을 이용하여 조사될 수 있고, 전자 현미경 검사(후자의 프로토콜은 현재 작업에 포함되지 않음). 인트라바이탈 현미경 검사는 다광광 현미경을 사용하여 등쪽 창 챔버에서 성장하는 종양을 이미지하여 현지 혈류흐름에 대한 실시간 정보와 생체내에서 형광표 나노입자의 운명에 관한 것으로 구성됩니다. 이러한 현미경 검사법의 조합은 궁극적으로 시험관 내 및 생체 내 초음파에 반응하여 치료 마이크로 버블 에이전트의 행동에 대한 상세한 통찰력을 제공합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

마이크로 버블 조영제는 초음파로 약물 전달 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 나노 입자에 약물을 캡슐화하면 전신 독성이 감소하고 약물의 순환 시간이 증가합니다. 마이크로 버블 보조 약물 전달에 대한 새로운 접근 방식에서 나노 입자는 마이크로 버블 쉘에 통합되어 초음파로 나노 입자 페이로드의 로컬 및 트리거 방출을 가능하게합니다. 광대한 초음파 매개 변수 공간 내의 방출 메커니즘에 대한 철저한 이해는 효율적이고 제어된 방출에 매우 중요합니다. 제시된 프로토콜의 이 세트는 형광 라벨을 포함하는 쉘이 있는 마이크로버블에 적용됩니다. 여기서, 초점은 폴리 (2-ethyl-butyl cyanoacrylate) 폴리머나노 입자로로드 된 마이크로 버블에, 수정 된 나일 레드 염료로 도핑. 파티클은 변성 카제인 쉘 내에 고정됩니다. 마이크로 버블은 격렬한 교반에 의해 생성되며, 카제인과 나노 입자를 포함하는 액체 단계에서 퍼플루오로프로판 가스의 분산을 형성하고, 그 후 마이크로 버블 쉘이 자체 조립됩니다. 나노입자 방출 공정의 모든 관련 시간대에 나노입자 안정화 마이크로버블을 특성화하기 위해서는 다양한 현미경 기술이 필요합니다. 나노 입자의 형광은 단일 마이크로 버블의 공초점 이미징을 가능하게하여 쉘 내의 입자 분포를 드러냅니다. 초당 1,000만 프레임의 밝은 필드 현미경 을 사용하여 체외 초고속 이미징은 초음파 발생에 대한 응답으로 거품 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, 버블 쉘에서 나노 입자 방출은 초당 500,000 프레임에서 수행된 형광 현미경 검사법에 의해 가장 잘 시각화됩니다. 생체 내 약물 전달을 특성화하기 위해, 혈관 내 내나노 입자의 트리거방출및 내피층을 넘어 그들의 사치품은 몇 분의 시간 동안 등색 피부 접이식 창방에 이식된 종양에 있는 중요한 현미경 검사를 사용하여 연구된다. 이러한 보완적인 특성화 기술의 조합은 시험관 내 및 생체 내 다양한 시간 및 길이 저울에서 마이크로 버블및 페이로드 방출의 동작 에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜에 설명된 바와 같이 생성된 마이크로버블은 다양한 현미경 법및 다양한 시저에서 분석되었다.
공초점 현미경검사(도 6A)에서 나노입자의 형광은 쉘이 균일하지 않은 입자 분포를 가지고 있음을 나타낸다. 다른 현미경 검사법은 거품 특성화에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 6B 는 이전 작업34에서 제시된 바와 같이 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 마이크로버블의 전체 구조를 나타낸다.
방사형 역학 및 현상학적 버블 거동은 마이크로버블이 초당 1,000만 프레임으로 이미지화된 생체 외 에서 밝은 필드 현미경검사 방법을 사용하여 연구될 수 있다. 단일 마이크로 버블의 반경은 사내에서 작성된 스크립트를 사용하여 시간이 지남에 따라 추출되었습니다. 이러한 방사형 반응의 예는 도 7에 도시된다.
섹션 2.3.6에 설명된 바와 같이 전형적인 성공적인 나노입자 전달의 이미지 시퀀스가 도 8A에 도시된다. 마이크로 버블 쉘에 내장된 나노 입자는 레이저 빛이 거품에 도달하면 형광으로 인해 점등되는 것을 볼 수 있다. 초음파 소네이션에 의해 구동, 형광 나노 입자는 마이크로 버블의 가스 코어에서 분리하고 샘플 홀더의 막에 증착된다. 마지막으로 레이저가 꺼지고 형광 나노 입자가 더 이상 흥분되지 않습니다. 마이크로버블의 형광 표지 페이로드의 실패한 전달은 전형적으로 초음파 노출 중에 그대로 유지되는 마이크로버블의 껍질에 형광 나노입자가 점등되는 도 8B에 표시된 이미지 서열처럼 보입니다.
초음파 중 실시간 인트라비티 다광원 현미경 검사는 혈액내 나노입자 거동에 대한 초음파 및 마이크로버블의 효과, 종양 혈관의 투과성 향상, 나노입자 전달 개선 등을 조사하는 데 사용되었다. 음향 압력, 주파수 및 펄스 길이의 함수로서 세포외 매트릭스내침투의 정도 및 운동도 특징이 될 수 있다. 초음파 치료의 효과는 혈관의 크기 및 형태와 거품의 결과로 감금에 따라 다를 수 있습니다. 초음파 치료가 혈류및 방향에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 나노 입자의 사치를 보여주는 예실험은 0.826의 기계지수(MI)에서 도 9에 도시된다. 중요한 다광자 현미경 검사의 결과는 초음파 노출 시 나노 입자의 공간 및 측두엽 을 해명하며, 이는 나노 입자의 초음파 매개 전달의 메커니즘을 완전히 이해하고 이러한 기술을 최적화하는 데 매우 유용합니다26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> 그림 1: 변성 카제인에 형광 표지 폴리머 나노 입자의 껍질이있는 마이크로 버블의 회로도 표현. 마이크로 버블은 일반적으로 직경 이 1 μm에서 10 μm 사이입니다. 나노 입자는 주로 100 nm와 200 nm38 사이의 직경을 갖는다. 약어: C3F8 = 퍼플루오로프로판 가스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> 그림 2: 밝은 필드, 형광, 공초점 및 내 중요한 현미경 검사법에 대한 관련 시간 및 길이 저울을 보여주는 회로도 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> 그림 3: 밝은 필드 현미경 실험의 회로도 표현. (A) 실험 설정, (B) 타이밍 다이어그램, (C) 전형적인 기록된 프레임. (C) = 10 μm의 배율 막대. 약어: 초당 fps = 프레임. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> 그림 4: 형광 현미경 실험의 회로도 표현. (A) 실험 설정, (B) 타이밍 다이어그램 및 (C) 전형적인 기록된 프레임. (C) = 10 μm의 배율 막대. 약어: 초당 fps = 프레임. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> 그림 5: 중요 내 현미경 실험의 회로도 표현. (A) 실험 설정, (B) 타이밍 다이어그램, 그리고 (C) 전형적인 기록된 프레임. (C) = 50 μm의 배율 막대. 녹색은 나노 입자에 dextran-FITC 및 빨간색에 해당합니다. 약어: GaAsP = 갈륨 아르세니드 포스피더. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> 도 6: 단일 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블의 3D 구조. (A) 공초점 현미경을 사용하여 나노입자를 나타내고, (B) 주사 전자 현미경을 이용하여 3D 구조를 보여준다. (B)는 34로부터의 허가하에 복제되었습니다. (A) = 5 μm의 배율 막대; (B) = 2 μm의 축척 막대. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> 도 7: 1MHz의 초음파 주파수에서 인진화된 2.89 μm 반경 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블의 전형적인 구형 진동및 142kPa의 음향 압력 진폭(A-D) 이미지의 고속 기록 및 시간 곡선(아래쪽)에 따른 해당 버블 반경(아래). 배율 막대 = 5 μm, 빨간색 선은 초기 반지름을 나타냅니다. 조명 프로파일(임의 단위)은 노란색으로 표시됩니다. 배율은 120배입니다<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> 도 8: 고속 형광 현미경검사법에서 의 이미지 서열. (A) 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블의 형광 표지 나노입자의 성공적인 전달은 2MHz의 초음파 주파수에서 발화되고 600 kPa의 음향 압력 진폭. (B) 2MHz의 초음파 주파수와 210 kPa의 음향 압력 진폭에서 인음이 있는 나노 입자 및 단백질 안정화 마이크로 버블의 형광 표지 나노 입자의 전달에 실패하였다. 스케일 바 = 10 μm. 배율은 120배입니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> 도 9: 1MHz의 초음파 주파수에서 나노입자 및 단백질 안정화 마이크로버블을 흡입한 후 의활력 현미경 검사법과 혈관 내 800kPa의 음향 압력 진폭, (B) (B) (A) dextran(greenparticle)의 엑스트라에 대한 엑스트라를 나타내는 백색 대시 사각형으로 표시된 영역의 이미지 서열.. 스케일 바 = 50 μm. 배율은 20배<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">입니다.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

제시된 프로토콜은 그들의 활성화 기계장치 및 그들의 생체 효력을 포함하여 초음파 트리거한 약 납품 응용을 위해 디자인된 형광 표지마이크로버블의 반응을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 백서는 관련 길이및 시간대를 포착하기 위해 수행된 다양한 시험관 내 및 생체 내 현미경 기술을 다룹니다.

초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

이 프로토콜은 활성화 메커니즘 및 생체 효과를 포함하는 초음파 트리거 약물 전달 응용 프로그램을 위해 설계된 형광 표지 마이크로 버블의 반응을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 핵심은 우리가 다른 공간 규모와 다른 시간 규모에서 거품을 가진 초음파 트리거한 약 납품의 다단계 문제점을 해명할 수 있는 화상 진찰 기술의 조합에 있습니다. 브라이트필드 현미경검사법에 의한 단일 버블 이미징의 경우, 19 게이지 환기 바늘을 배치하고 19 게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 유리 바이알에서 소량의 마이크로버블 서스펜션을 제거하여 다음 단계에서 파이프팅을 더 쉽게 할 수 있도록 작은 튜브에 넣습니다.파이펫을 사용하여 여과된 인산염 완충식식에서 마이크로버블 용액을 희석시 희석합니다. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 홀더가 기포를 만들지 않고 가득 차때까지 샘플 홀더의 한 콘센트에 샘플을 주입하고 필요한 경우 더 많은 샘플을 주입하십시오. 샘플 홀더의 두 밸브를 닫고 현미경의 광학 축에 수직으로 샘플 홀더를 배치합니다.시료 분석 전에, 임의파형 발생기에 원하는 초음파 구동 주파수 및 음향 압력을 설정하고 샘플 홀더의 한 구석에서 시야로 시작하여 XYZ 단계를 사용하여 현미경의 시야에서 단일 마이크로 버블을 찾아 홀더를 이동한 다음 수조에 연결된 광섬유를 스트로브 광에 부착하고 기록을 시작합니다. 초음파 설정당 원하는 만큼 이미징을 반복하여 샘플 홀더를 각 분석에 대해 음속없는 마이크로 버블을 포함하는 시야로 적어도 2 밀리미터 를 이동합니다. 마이크로 버블의 형광 현미경 이미징의 경우, 인산염 완충식식염으로 마이크로버블 용액을 희석한 후, 임의파형 발생기에 원하는 초음파 구동 주파수및 음향 압력을 설정하고 마이크로버블에서 나노입자의 형광 발생을 위한 펄스 지연 발생기에 레이저의 트리거 지연을 설정한 다음 XYZ 스테이지를 사용하여 샘플 홀더를 이동시켜 단일 마이크로버블을 찾아서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 기록을 트리거합니다.초음파 설정을 변경하고 샘플 홀더를 새로운 시야로 이동하여 원하는 대로 이미징을 반복합니다. 인트라바이탈 현미경 검사법에 의한 이미징의 경우, 먼저 웨이브 가이드와 목표 사이의 XY 포지셔닝 스테이지에 가열된 동물 홀더를 배치하고 웨이브 가이드에 커플링 젤을 추가합니다. 마취종양 베어링 마우스의 꼬리 정맥 카테터를 꼬리 정맥에 삽입하고 창문 챔버가 장착된 마우스를 가열 홀더에 놓습니다.커버슬립에 물방울을 넣습니다. 종양 조직 혈관을 시각화하기 위해, 정맥 내 30 밀리리터 당 4 밀리그램의 마이크로리터를 형광으로 표시2 메가달톤은 테일 정맥 카테터에 덱을 표시하고 적절한 혈관을 가진 시야가 위치 할 때까지 마우스를 이동XY 번역 단계를 사용합니다. 실험의 매개 변수에 따라 기록의 프레임 속도, 시야 및 길이를 조정하고 용기의 기준선을 기록합니다.기준선 영상을 획득하면 임의파형 발생기에서 초음파 구동 주파수, 펄스 길이 및 음향 압력 진폭을 설정하고 50 마이크로버블 샘플을 꼬리 정맥에 정맥으로 주입한다. 그런 다음 입증된 바와 같이 혈관을 이미지화합니다. 공초점 형광 현미경검사법에 의한 마이크로버블의 분석은 마이크로버블 쉘의 비균일입자 분포를 나타낸다.마이크로 버블의 전체 구조는 전자 현미경 검사를 스캔하여 더 시각화 할 수 있습니다. 브라이트필드 현미경검사법에 의한 음골화된 마이크로버블의 방사형 역학 및 현상학적 거동을 분석하면 시간이 지남에 따라 마이크로버블 반경의 상대적 변화를 평가할 수 있다. 여기서, 형광표지 나노입자의 전형적인 성공적인 전달의 이미지 시퀀스가 도시된다.마이크로 버블 쉘에 내장된 나노 입자는 레이저 빛이 거품에 도달하면 형광을 관찰할 수 있다. 그러나 이러한 실패한 전달에서 관찰된 바와 같이, 형광 나노입자는 초음파 노출 중에 그대로 유지되는 마이크로버블의 껍질에 빛납니다. 인트라바이탈 다광광화상은 초음파 노출 시 나노입자의 공간적 및 측두화 를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 초음파 매개 나노입자 전달의 기전을 이해하고 최적화하는 데 도움이 될 수 있다.모든 길이와 시간 척도에서 광학 및 음향 경로의 완벽한 정렬로 초음파 트리거 약물 전달에 대한 포괄적 인 통찰력이 제공됩니다. 우리의 다중 규모의 실험에 의해 전달된 대답은 이제 임상 사례로 번역될 것입니다. 결과는 암 치료를 포함하여 치료 응용 프로그램의 범위에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

연구

생체공학

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

제어 약물 릴리스에 대한 자기장 응답 하이브리드 젤라틴 마이크로 겔을 교류

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

건조 공기-LC 인터페이스에 Megamolecular 생체 고분자의 자체 통합을위한 방법

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

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Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...