Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Ulike optiske mikroskopimetoder ble kombinert for å få informasjon om de ulike trinnene i levering av nanopartikler fra overflaten av mikrobobler til det omkringliggende mediet. Avbildning av bobleoscillasjonene ble utført, samt avbildning av frigjøringen av nanopartiklene fra bobleskallet, ekstravasasjonen og penetrasjonen gjennom den ekstracellulære matrisen av svulster in vivo. In vitro-avbildning muliggjør screening av mange ultralydparametere sammenlignet med de mer komplekse in vivo-oppsettene . Fordelen med å kombinere dette spekteret av bildemodaliteter er den komplementære informasjonen som kan oppnås på forskjellige tidsskalaer - en funksjon som er avgjørende for å karakterisere og optimalisere mikroboblene for vellykket levering og for å oppnå terapeutisk effekt. Denne tilnærmingen er nyttig for å forstå leveringsmekanismene for alle mikrobobler, inkludert konstruksjoner med fluorescerende merkede nanopartikler og stoffer.
De mest kritiske trinnene i mikroskopimetodene som brukes til å studere enkle mikrobobler er som følger. For fluorescensmikroskopi bør nanopartiklene være fluorescerende merket for å muliggjøre visualisering av partikkelutløsningen. Videre bør prøveløsningen fortynnes nok til å isolere enkle mikrobobler for analyse i konfiskerings-, lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder. I tillegg er det viktig å velge en ultralyd kjørefrekvens og akustisk trykk for å begeistre boblene mest effektivt, nemlig ved resonans. Hvis forskningsspørsmålet gjelder levering av nanopartikkelnyttelasten, bør de aktuelle ultralydparametrene være en del av undersøkelsen. Ved siden av resonans bør disse boblene også kjøres på eller utenfor terskelen for nanopartikkelutløsning, vanligvis ved relativt høye akustiske trykkamplituder (MI > 0,3)51. For lysfeltmikroskopiavbildning er det viktig å velge et høyhastighetskamera med tilstrekkelig høy bildefrekvens for å minimere bevegelsesuskarphet og for å unngå alias.
Bright-field mikroskopi er hovedsakelig begrenset av bildefrekvensen og intensiteten til lyskilder som er tilgjengelige, da en høyere bildefrekvens vil gi en mer detaljert tids løst innsikt i bobledynamikken, men krever mer intens belysning på grunn av kortere eksponeringstider. For å studere partikkelutgivelse mer detaljert, kan bildefrekvensen for fluorescensavbildning i prinsippet økes ved å øke intensiteten til laserlyset. Imidlertid genererer absorpsjon av høyintensitets laserlyset av de fluorescerende merkede mikroboblene varme, selv med høye kvanteutbyttefarger. Denne varmen kan forstyrre forsøkene som står på spill, og i ekstreme tilfeller indusere foto-termisk kavitasjon52. Dermed er det i praksis en grense for den påførte laserfluensaen. Imidlertid kan intens laserbelysning også bevisst brukes til å indusere partikkelfrigjøring fra liposomer53. Temperatur påvirker bobledynamikk og ultralydrespons, avhengig av bobletype54. Derfor, hvis in vitro og intravitale metoder skal sammenlignes objektivt, bør in vitro-metodene som er diskutert i protokollen utføres ved 37 °C. En annen begrensning ved in vitro-metodene som er omtalt i dagens papir, er at boblene ikke er i et frifeltmiljø, da mikrobobler vil flyte under prøveholdermembranen. Videre er det en utvalgsbias når du ser på enkle mikrobobler. Men å utføre gjentatte eksperimenter på enkeltbobler gjør det mulig å undersøke effekten av størrelse og fjerning av den forvirrende faktoren - størrelsesfordelingen. Hvis bobleresponsen som en funksjon av størrelse kan forstås mens konsentrasjonen ikke er for høy for å forhindre boblebobleinteraksjoner, kan responsen til enhver vilkårlig boblepopulasjon beregnes. Til slutt gir både lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder innsikt i mikrobobler innviklet i et todimensjonalt (2D) bilde. Hvis forskningsspørsmålet krever mer enn 2D-bildebehandling, kan 3D-virkemåten til boblene løses ved å kombinere oppsettet som er beskrevet i protokollen, med et sidevisningsoppsett for flerplanavbildning55.
En alternativ metode for å studere mikrobobler er akustisk karakterisering56. Måling av ekkoet av en enkelt mikroboble krever imidlertid å finne og isolere en enkelt mikroboble i ultralydstrålen56, noe som utgjør en utfordring som vanligvis håndteres ved bruk av et smalt rør eller optisk eller akustisk pinsett57,58. For å størrelsesbobler akustisk, kan mikroboblene insoneres i det geometriske spredningsregimet ved frekvenser mye høyere enn resonansfrekvensen, noe som ikke induserer volumetriske mikrobubble oscillasjoner59. Bruken av et "akustisk kamera" er en slik metode for å avbilde radialdynamikken til enkle mikrobobler som respons på ultralyd, hvor en høyfrekvent ultralydsonde brukes til å bestemme boblens radiale respons på en lavfrekvent kjørebølge60. Ulempen med denne metoden er at den bare kan brukes til å bestemme den relative endringen av mikrobubble radiusen; Derfor er det nødvendig med en annen metode for å bestemme den absolutte bobleradiusen, for eksempel gjennom optisk bildebehandling61,62. Ulempen med metoder der mikrobobler er utsatt for ultralyd ved frekvenser høyere enn resonansfrekvensen, er at ved så høye frekvenser reduseres penetrasjonsdybden59, noe som begrenser brukervennligheten for in vivo-applikasjoner. Andre former for mikroskopi kan også brukes til å studere mikrobobler som skanning av elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi63. Den oppnåelige rom-temporale oppløsningen av disse alternative mikroskopiteknikkene er imidlertid generelt mer begrenset, og disse teknikkene har ulempen at avbildning utføres enten før eller etter ultralydeksponering ved off-line analyse og vanligvis presenterer en lav gjennomstrømning63. Et annet alternativ er å bruke en lett spredningsmetode, som kan brukes til å studere radial dynamikk av enkeltmikrobobler i sanntid, men har et lavt signal-til-støy-forhold sammenlignet med akustiske spredningsmetoder64.
Intravital mikroskopi i sanntid under ultralydeksponering er en kraftig metode for å skaffe seg ny innsikt i vaskulaturen, oppførselen til mikrobobler, nanopartikler eller andre molekyler (som dekstran i dette tilfellet) under ultralydeksponering. En generell begrensning når du utfører intravital mikroskopi i sanntid, er at bare et lite område av vevet er avbildet, og lysets penetrasjonsdybde i vev er begrenset. Hvis de avbildede fartøyene inneholder svært få mikrobobler og/eller nanopartikler innen synsfeltet, kan det innhentes lite eller ingen informasjon om nanopartikkeladferd og ekstravasasjon. I tillegg, på grunn av det begrensede synsfeltet, er en riktig justering mellom lys- og ultralydbanene avgjørende. Hvis ultralydtrykket er høyt nok til å indusere bobleødeleggelse, er det også viktig å velge en pulsrepetisjonsfrekvens som gjør at friske bobler kan reperfuse inn i synsfeltet mellom ultralydpulser. Videre, da ultralydet vil bli reflektert fra dekkglasset i vinduskammeret og målet, er det viktig å plassere svingeren i en vinkel for å redusere refleksjoner for å forhindre dannelse av stående bølger, noe som forvrenger det kalibrerte trykkfeltet. Et annet praktisk problem er at oppsettet må ha tilstrekkelig plass til å montere ultralydtransduseren og bølgelederen over eller under målet i mikroskopoppsettet. Svulstene i dorsal vinduskammeret vil ha en begrenset tykkelse på grunn av innesperringskammeret og dekselslippet; Om nødvendig kan imidlertid andre modeller brukes. Eksempler er hudfoldsvulster, for eksempel i pattedyrfettputen65 eller abdominal intravital avbildning av svulster i de forskjellige organene66. Slike svulster kan dyrkes ortopisk i riktig mikromiljø, og som sådan presentere et mer klinisk relevant tilfelle.
Metodene beskrevet i dette arbeidet opplyser potensialet til fluorescerende merkede mikrobobler for å studere det grunnleggende om legemiddelleveringsapplikasjoner ved hjelp av bobler og ultralyd. Denne kombinasjonen av mikroskopimetoder gir verdifull innsikt i mikrobubble responsen på ultralydinsonasjon og tilhørende akustisk parameterplass og presenterer et klart syn på mikrobubble og nyttelastadferd over et relevant spekter av tids- og lengdeskalaer.

Ultralyd er den mest brukte medisinske bildeteknikken. Det er ikke-invasivt, raskt, trygt, kostnadseffektivt og bærbart1,2,3. Imidlertid er blod en dårlig ultralydspredning, og kontrasten i blodbadet kan forbedres ved en intravenøs injeksjon av ultralydkontrastmidler3. Denne forbedrede blodbassengkontrasten muliggjør kvantifisering av organperfusjon for diagnostiske formål, for eksempel ved påvisning av koronararteriesykdom4 og metastatisk leversykdom5. Faktisk ble tumorvaskulatur vist seg å være en viktig prognostisk faktor6. En stor forskningsinnsats er nå rettet mot mikrobobleassistert, målrettet molekylær avbildning og skreddersømkontrastmidler for terapeutisk bruk.
Kommersielt tilgjengelige ultralydkontrastmidler består vanligvis av en suspensjon av belagte mikrobobler7,8 med diametre fra 1 μm til 10 μm9. Siden ultralydkontrastmiddelmikrobobler er litt mindre enn røde blodlegemer7, kan mikroboblene trygt nå selv de minste kapillærene uten å skape en okklusjon3. Mikrobobler har en dramatisk økt ultralyd backscattering koeffisient sammenlignet med vev10, på grunn av deres kompressible gasskjerne11. Videre er mikrobubble-ekkoet svært ikke-lineært, det vil si at spekteret inneholder harmonikk og subharmoni av kjørefrekvensen. I tillegg er ekkostyrken sterkt avhengig av resonansresponsen til boblen12. Mens vev sprer seg bare lineært, er et lite antall mikrobobler tilstrekkelig til å oppnå høy deteksjonsfølsomhet ved harmonisk avbildning13,14. Denne ikke-lineære kontrastgenerasjonen kan til og med være sterk nok til å spore enkeltbobler i kroppen15.
Skallet av ultralydkontrastmiddelet stabiliserer boblene mot oppløsning og koalescens, og øker dermed sirkulasjonstiden i blodbassenget16. Skallet kan bestå av lipider, polymerer eller denaturerte proteiner3,8. Det reduserer den interfaciale spenningen, og begrenser dermed effekten av Laplace trykkdrevet oppløsning17 og skaper en resistiv barriere mot gassdiffusjon18. For ytterligere å øke stabiliteten er kontrastmikroboblene vanligvis fylt med en høymolekylær gass med lav løselighet i blod11. Mikrobubble skallet dramatisk endrer responsen av mikrobubbles til ultralyd insonasjon11. Ubestrøket gassbobler har en karakteristisk resonansfrekvens som er omvendt proporsjonal med deres størrelse, og tilsetningen av et lipidbelegg øker resonansfrekvensen med hensyn til en ubestrøket buble på grunn av skallets indre stivhet. Videre sprer skallet energi gjennom dilatasjonsviskositet, noe som utgjør den dominerende kilden til demping for belagte bobler3. Det stabiliserende skallet har den ekstra fordelen at det kan funksjonaliseres, for eksempel ved å binde målretting av ligander til overflaten av mikrobobler. Denne målrettingen muliggjør mange bruksområder for disse boblene og spesielt molekylær avbildning med ultralyd14,19.
Mikrobubble kontrastmidler holder stort løfte for legemiddelleveringsapplikasjoner med ultralyd. Mikrobobler som svinger i innesperring av et blodkar kan forårsake mikrostreaming så vel som lokale normale og skjærspenninger på kapillærveggen3. Ved høyt akustisk trykk kan store amplitudeoscillasjoner føre til mikroboblekollaps i en voldelig prosess kalt inertiell kavitasjon, noe som igjen kan føre til brudd eller invaginering av blodkaret20. Disse voldelige fenomenene kan indusere bioeffekter som sonopermeation21, og forbedre ekstravasasjonen av terapeutiske legemidler inn i interstitiumet over endotelveggen, enten paracellulært eller transcellulært. Det kan også forbedre penetrasjonen av terapeutiske midler gjennom den ekstracellulære matrisen av stromarike svulster21,22 og biofilmer23,24, selv om denne mekanismen fortsatt er dårlig forstått26.
Ultralydmediert legemiddellevering har vist lovende resultater både preklinisk27,28 og i kliniske studier22. Videre, når de brukes med relativt lavfrekvent ultralyd (~ 1 MHz), har mikrobobler blitt rapportert å lokalt og forbigående øke blod-hjernebarrierens permeabilitet, og dermed gjøre det mulig for legemidler å komme inn i hjernen parenchyma, både i prekliniske og kliniske studier29,30,31,32,33,34.
Det er generelt to tilnærminger til ultralydmediert legemiddellevering: det terapeutiske materialet kan administreres samtidig med boblene, eller det kan festes til eller lastes i bobleskallet28,35,36. Den andre tilnærmingen har vist seg å være mer effektiv når det gjelder legemiddellevering37. Mikrobobler kan lastes med legemidler eller genetisk materiale innkapslet i nanopartikler (liposomer eller polymere nanokonstrukter) festet til skallet eller innlemmet direkte i mikrobubble skallet35,36. Nanopartikkelbelastede mikrobobler kan aktiveres ved (fokusert) ultralyd for å frigjøre nanopartikkelnyttelasten lokalt28,33,38,39,40. Hvis en slik mikrobubble er i direkte kontakt med en celle, har det vist seg in vitro at nyttelasten til og med kan deponeres på cellen cytoplasmatisk membran i en prosess som kalles sonoprinting34,35.
Ultralydparameterrommet for mikrobubble-insonasjon er omfattende, og de in vivo biologiske forholdene tilfører ytterligere kompleksitet. Dermed utgjør kombinasjonen av fokusert ultralyd og nanopartikkelbelastede mikrobobler en utfordring innen målrettet terapeutisk.
Målet med dette arbeidet er å gi protokoller som kan brukes til å avbilde, i detalj, responsen av mikrobobler som en funksjon av ultralydparametrene og å studere mekanismene som fører til skallbrudd og etterfølgende frigjøring av det fluorescerende merkede skallmaterialet. Dette settet med protokoller gjelder for mikrobobler med skall som inneholder et fluorescerende fargestoff. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av polymer-nanopartikkel-og-proteinstabiliserte mikrobobler utviklet ved SINTEF (Trondheim). Disse boblene er fylt med perfluoropropangass (C3F8) og nanopartiklene som stabiliserer skallet inneholder NR668, som er et lipofilt derivat av Nile Red fluorescerende fargestoff38,43. Nanopartiklene består av poly (2-etyl-butylcyoacrylat) (PEBCA) og er PEGylated. Funksjonalisering med polyetylenglykol (PEG) reduserer opsonisering og fagocytose ved det mononukleære fagocyttsystemet, og forlenger dermed sirkulasjonstiden14,44. Som et resultat øker PEGylation mengden nanopartikler som når målstedet, og forbedrer dermed effekten av behandlingen16. Figur 2 illustrerer hvordan bruk av fire mikroskopimetoder gjør det mulig for forskere å dekke alle relevante tids- og lengdeskalaer. Det skal bemerkes at den romlige oppløsningen som kan oppnås i optisk mikroskopi, bestemmes av diffraksjonsgrensen, som avhenger av bølgelengden til lys- og numerisk blenderåpning (NA) av målet og objektets belysningskilde45. For de aktuelle systemene er grensen for optisk oppløsning vanligvis 200 nm. I tillegg kan intravital mikroskopi brukes til å bilde på subcellulært nivå46. For nanopartikkel- og proteinstabiliserte mikrobobler som brukes i dette arbeidet, er minimumslengdeskalaen som er relevant for intravital mikroskopi, størrelsen på små kapillærer (≥10 μm). In vitro høyhastighets optisk bildebehandling (10 millioner bilder per sekund) og høyhastighets fluorescensavbildning (500 000 bilder per sekund) er beskrevet for enkle mikrobobler. Høyhastighets lysfeltavbildning ved nanosekund tidsskalaer er egnet til å studere den tidsavklarte radialdynamikken til de vibrerende boblene. I motsetning gir høyhastighets fluorescensmikroskopi direkte visualisering av frigjøringen av de fluorescerende merkede nanopartiklene. Videre kan strukturen til mikrobubble-skallet undersøkes ved hjelp av Z-stack tredimensjonal (3D) konfokal mikroskopi, og skanning av elektronmikroskopi (protokollen for sistnevnte er ikke inkludert i det nåværende arbeidet). Intravital mikroskopi består i å bruke multifotonmikroskopi til bildetumorer som vokser i dorsale vinduskamre for å gi sanntidsinformasjon om lokal blodstrøm og om skjebnen til fluorescerende merkede nanopartikler i vivo47. Kombinasjonen av disse mikroskopimetodene gir til slutt detaljert innsikt i oppførselen til terapeutiske mikrobubble-midler som respons på ultralyd, både in vitro og in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Mikrobubble kontrastmidler holder stort løfte for legemiddelleveringsapplikasjoner med ultralyd. Innkapsling av legemidler i nanopartikler reduserer systemisk toksisitet og øker sirkulasjonstiden for stoffene. I en ny tilnærming til mikrobobleassistert legemiddellevering er nanopartikler innlemmet i eller på mikrobubble skall, noe som muliggjør lokal og utløst frigjøring av nanopartikkelnyttelasten med ultralyd. En grundig forståelse av frigjøringsmekanismene i det enorme ultralydparameterrommet er avgjørende for effektiv og kontrollert frigjøring. Dette settet med presenterte protokoller gjelder for mikrobobler med et skall som inneholder en fluorescerende etikett. Her er fokuset på mikrobobler lastet med poly (2-etyl-butylcyoacrylat) polymere nanopartikler, dopet med en modifisert Nil Rød fargestoff. Partiklene er festet i et denaturert kaseinskall. Mikroboblene produseres ved kraftig omrøring, og danner en spredning av perfluoropropangass i væskefasen som inneholder kasein og nanopartikler, hvorpå mikrobubble-skallet selvmonteringer. En rekke mikroskopiteknikker er nødvendig for å karakterisere nanopartikkelstabiliserte mikrobobler på alle relevante tidsskalaer av nanopartikkelutløsningsprosessen. Fluorescens av nanopartiklene muliggjør konfikal avbildning av enkle mikrobobler, og avslører partikkelfordelingen i skallet. In vitro ultra-høyhastighets bildebehandling ved hjelp av lysfeltmikroskopi med 10 millioner bilder per sekund gir innsikt i bobledynamikken som svar på ultralydinsonasjon. Til slutt visualiseres nanopartikkelutløsning fra bobleskallet best ved hjelp av fluorescensmikroskopi, utført ved 500.000 bilder per sekund. For å karakterisere legemiddellevering in vivo studeres den utløste frigjøringen av nanopartikler i vaskulaturen og deres ekstravasasjon utover endotellaget ved hjelp av intravital mikroskopi i svulster implantert i dorsale hudfoldvindukamre, over en tidsskala på flere minutter. Kombinasjonen av disse komplementære karakteriseringsteknikkene gir unik innsikt i oppførselen til mikrobobler og deres nyttelastutgivelse på en rekke tids- og lengdeskalaer, både in vitro og in vivo.

Mikroboblene, produsert som beskrevet i protokollen, ble analysert ved hjelp av ulike mikroskopimetoder og på ulike tidsskalaer.
Nanopartiklenes fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerer at skallet har en ikke-jevn partikkelfordeling. Andre mikroskopimetoder kan brukes til boblekarakterisering. Figur 6B viser for eksempel mikrobubblens overordnede struktur ved hjelp av skanningselektronmikroskopi, som presentert i tidligere work34.
Radial dynamikk og fenomenologisk bobleoppførsel kan studeres ved hjelp av den beskrevne in vitro bright-field mikroskopimetoden der mikrobobler ble avbildet med 10 millioner bilder per sekund. Radiusen til enkle mikrobobler ble hentet ut over tid ved hjelp av et skript skrevet internt. Et eksempel på en slik radial respons er vist i figur 7.
En bildesekvens av typisk vellykket nanopartikkellevering, som beskrevet i pkt. 2.3.6, er vist i figur 8A. Nanopartiklene som er innebygd i mikrobubble-skallet, kan ses for å lyse opp på grunn av fluorescens når laserlyset når boblen. Drevet av ultralydinsonasjon løsner de fluorescerende nanopartiklene fra mikrobubbles gasskjernen og avsettes på membranen til prøveholderen. Til slutt er laseren slått av, og de fluorescerende nanopartiklene er ikke lenger begeistret. Mislykket levering av den fluorescerende merkede nyttelasten til mikrobubbles ser vanligvis ut som bildesekvensen vist i figur 8B, der fluorescerende nanopartikler lyser opp på skallet på mikrobubble som forblir intakt under ultralydeksponering.
Sanntids intravital multifotonmikroskopi under ultralyd ble brukt til å undersøke effekten av ultralyd og mikrobobler på nanopartikkeladferd i blodet, forbedring av permeabiliteten av tumorblodkar og forbedring av levering av nanopartikler. Omfanget og kinetikken til penetrasjon i den ekstracellulære matrisen som en funksjon av akustisk trykk, frekvens og pulslengder kan karakteriseres. Effekten av ultralydbehandlingen kan variere med hensyn til størrelsen og morfologien til karene og resulterende innesperring av boblen. Hvordan ultralydbehandlingen påvirker blodstrømmen og retningen kan bestemmes. Et eksempeleksperiment som viser ekstravasasjon av nanopartikler over tid, vises i figur 9 ved en mekanisk indeks (MI) på 0,826. Resultater av intravital multifotonmikroskopi belyser romlig og tidsmessig ekstravasasjon av nanopartikler under ultralydeksponering, noe som er svært gunstig for fullstendig forståelse av mekanismene som ligger til grunn for ultralydmediert levering av nanopartikler og for å optimalisere slike teknologier26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av en mikrobubble med et skall av fluorescerende merkede polymere nanopartikler i denaturert kasein. Mikroboblene er vanligvis mellom 1 μm og 10 μm i diameter. Nanopartiklene har en diameter på for det meste mellom 100 nm og 200 nm38. Forkortelse: C3F8 = perfluoropropangass. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk oversikt som viser relevante tids- og lengdeskalaer for lysfelt, fluorescens, konfokal og intravital mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figur 3: Skjematisk representasjon av lysfeltmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer per sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figur 4: Skjematisk fremstilling av fluorescensmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer per sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figur 5: Skjematisk representasjon av intravitale mikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 50 μm. Grønn tilsvarer dextran-FITC og rød til nanopartikler. Forkortelse: GaAsP = gallium arsenid fosfid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figur 6: 3D-struktur av en enkelt nanopartikkel- og proteinstabilisert mikroboble. (A) Bruke konfokalmikroskopi til å vise nanopartiklene, og (B) bruke et skanningselektronmikroskop for å vise 3D-strukturen. (B) har blitt reprodusert med tillatelse fra34. Skalastang i (A) = 5 μm; skala bar i (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figur 7: Typiske sfæriske svingninger av en radius på 2,89 μm nanopartikler og proteinstabiliserte mikrobobler som er insonifisert med en ultralydfrekvens på 1 MHz og en akustisk trykkamplitude på 142 kPa. (A-D) Bilder fra høyhastighetsopptaket og den tilsvarende bobleradiusen over tidskurven (bunnen). Skalastolper = 5 μm, og den røde linjen angir den opprinnelige radiusen. Belysningsprofilen (vilkårlige enheter) indikeres med gult. Forstørrelsen er 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figur 8: Bildesekvens fra høyhastighets fluorescensmikroskopi. (A) Vellykket levering av fluorescerende merkede nanopartikler av en nanopartikkel- og proteinstabilisert mikrobubble insonert med en ultralydfrekvens på 2 MHz og en akustisk trykkamplitude på 600 kPa. (B) Mislykket levering av fluorescerende merkede nanopartikler av en nanopartikkel-og-protein-stabilisert mikrobubble insonifisert ved en ultralydfrekvens på 2 MHz og en akustisk trykkamplitude på 210 kPa. Skalastenger = 10 μm. Forstørrelsen er 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figur 9: Intravital mikroskopi etter insonasjon av nanopartikkel- og proteinstabiliserte mikrobobler med en ultralydfrekvens på 1 MHz og en akustisk trykkamplitude på 800 kPa. (A) Nanopartikler i karet, og (B) en bildesekvens av området angitt av den hvite stiplede firkanten i (A) som viser ekstravasasjonen av dekstran (grønn) og nanopartikler (rødpartikler). Skalastenger = 50 μm. Forstørrelsen er 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

De presenterte protokollene kan brukes til å karakterisere responsen til fluorescerende merkede mikrobobler designet for ultralydutløste legemiddelleveringsapplikasjoner, inkludert deres aktiveringsmekanismer så vel som deres bioeffekter. Dette papiret dekker en rekke in vitro - og in vivo-mikroskopiteknikker som utføres for å fange opp relevant lengde og tidsskalaer.

Multi-tidsskala mikroskopi metoder for karakterisering av fluorescerende merket mikrobobler for ultralyd-utløst legemiddel frigjøring

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Denne protokollen kan brukes til å karakterisere responsen til fluorescerende merkede mikrobobler som er designet for ultralydutløste legemiddelleveringsapplikasjoner som inkluderer aktiveringsmekanismer og bioeffekter. Nøkkelen ligger i kombinasjonen av avbildningsteknikker som gjør det mulig for oss å avdekke multiskalaproblemet med ultralydutløst legemiddellevering med bobler, både i forskjellige romlige skalaer og på forskjellige tidsskalaer. For enkel bobleavbildning av Brightfield-mikroskopi, plasser en 19 gauge ventilasjonsnål og bruk en en milliliter sprøyte utstyrt med en 19 gauge nål for å fjerne en liten mengde av mikrobubble suspensjon fra glass hetteglasset inn i et lite rør for enklere pipettering i neste trinn.Bruk en pipette og fortynn mikrobubbleoppløsningen i filtrert fosfatbufret saltvann. Bruk en 10 milliliter sprøyte til å injisere prøven i ett uttak av prøveholderen til holderen er full uten å lage luftbobler, og injisere mer av prøven om nødvendig. Lukk begge ventilene på prøveholderen og plasser prøveholderen vinkelrett på mikroskopets optiske akse.Før prøveanalyse, still inn ønsket ultralydkjøringsfrekvens og akustisk trykk på den vilkårlige bølgeformgeneratoren og start med synsfeltet i det ene hjørnet av prøveholderen, bruk XYZ-scenen til å flytte holderen for å finne enkle mikrobobler i mikroskopets synsfelt, fest deretter en optisk fiber koblet til et vannbad til et strobelys og start opptaket. Gjenta bildet så mange ganger som ønsket per ultralydinnstilling, og flytt prøveholderen minst to millimeter til et synsfelt som inneholder ikke-soniske mikrobobler for hver analyse. For fluorescens mikroskopisk avbildning av mikroboblene, Etter å ha fortynnet mikrobubble-løsningen i fosfatbufret saltvann som demonstrert, still inn ønsket ultralydkjøringsfrekvens og akustisk trykk på den vilkårlige bølgeformgeneratoren og still inn utløserforsinkelsen for laseren på pulsforsinkelsesgeneratoren for fluorescenseksitasjon av nanopartiklene fra mikrobubbles, og bruk deretter XYZ-scenen til å flytte prøveholderen for å finne enkeltmikrobubbles og bringe dem inn i fokus. målet, og deretter utløse innspillingen.Gjenta bildet etter ønske ved å endre ultralydinnstillingene og flytte prøveholderen til det nye synsfeltet som vist. For avbildning ved intravital mikroskopi, plasser først en oppvarmet dyreholder på XY-posisjoneringsstadiet mellom bølgeføringen og målet og legg koblingsgel til bølgelederen. Sett inn et hale venekateter i halevenen til en bedøvet tumorbærende mus og plasser musen utstyrt med et vinduskammer i den oppvarmede holderen.Tilsett en vanndråpe til dekslene. For å visualisere tumorvevsvaskulaturen injiserer intravenøst 30 mikrolitere på fire milligram per milliliter fluorescerende merket 2 megadalton dextran i halevenekateteret og bruker XY-oversettelsesstadiet til å flytte musen til et synsfelt med egnede blodkar kan plasseres. Juster bildefrekvensen, synsfeltet og lengden på opptaket i henhold til parametrene for eksperimentet og registrer grunnlinjebilder av fartøyene.Når grunnlinjebildene er anskaffet, angir du ultralydkjøringsfrekvensen, pulslengden og akustisk trykkamplitude på den vilkårlige bølgeformgeneratoren og injiserer intravenøst 50 mikroliter mikrobobleprøve i halevenen. Deretter kan du se for deg vaskulaturen som demonstrert. Analyse av mikroboblene ved konfokal fluorescensmikroskopi avslører en ikke-jevn partikkelfordeling av mikrobubble-skallet.Den generelle strukturen til mikroboblene kan visualiseres ytterligere ved å skanne elektronmikroskopi. Analyse av radial dynamikk og fenomenologisk oppførsel av insonifisert mikrobubble av Brightfield mikroskopi tillater verdsettelse av den relative endringen i mikrobubble radius over tid. Her vises en bildesekvens av en typisk vellykket levering av fluorescerende merkede nanopartikler.Nanopartiklene som er innebygd i mikrobubble-skallet, kan observeres for fluoresce når laserlyset når boblen. Som observert i denne mislykkede leveransen, lyser imidlertid de fluorescerende nanopartiklene på skallet på mikrobubble, som forblir intakt under ultralydeksponeringen. Intravital multi-photon avbildning kan brukes til å bestemme romlig og tidsmessig ekstravasasjon av nanopartiklene under ultralydeksponering, noe som kan være gunstig for å forstå og optimalisere mekanismene som ligger til grunn for ultralydmediert nanopartikkellevering.Med den perfekte justeringen av de optiske og akustiske veiene i alle lengde- og tidsskalaer, gis et omfattende innblikk i ultralydutløst legemiddellevering. Svarene fra våre flerskalaeksperimenter vil nå bli oversatt til klinisk praksis. Resultatene vil gi verdifull innsikt for en rekke terapeutiske anvendelser, inkludert kreftbehandling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder for å karakterisere Co-utvikling av Biofilm og Habitat Heterogenitet

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Vekslende magnetfelt-Responsive Hybrid Gelatin mikrogeler for kontrollert legemiddeldosering

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Metoder for Self-integrering av Megamolecular Biopolymere på Tørking Air-LC-grensesnitt

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisert lysbildet skanning og segmentering i Fluorescently-merket vev bruker Widefield høyt innhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering av effektiviteten og sikkerheten til morkaken målrettede narkotika-leveranser med tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes og interne membran i Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...