Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Diferentes métodos ópticos de microscopia foram combinados para obter informações sobre as várias etapas na entrega de nanopartículas da superfície dos microbolhas para o meio circundante. Foram realizadas imagens das oscilações da bolha, bem como imagens da liberação das nanopartículas da casca de bolha, da extravasação e da penetração através da matriz extracelular dos tumores in vivo. A imagem in vitro permite a triagem de muitos parâmetros de ultrassom em comparação com as configurações in vivo mais complexas. O benefício de combinar essa gama de modalidades de imagem são as informações complementares que podem ser obtidas em diferentes escalas de tempo - característica crucial para caracterizar e otimizar as microbolhas para entrega bem sucedida e para obter eficácia terapêutica. Esta abordagem é útil para entender os mecanismos de entrega de todos os microbolhas, incluindo construções com nanopartículas e drogas fluorescentes.
Os passos mais críticos nos métodos de microscopia utilizados para estudar microbolhas simples são os seguintes. Para microscopia de fluorescência, as nanopartículas devem ser rotuladas fluorescentemente para permitir a visualização da liberação de partículas. Além disso, a solução amostral deve ser diluída o suficiente para isolar microbolhas únicas para análise em métodos de microscopia de confocal, de campo brilhante e fluorescência. Além disso, é importante escolher uma frequência de condução de ultrassom e pressão acústica para excitar as bolhas de forma mais eficiente, ou seja, em sua ressonância. Se a questão da pesquisa diz respeito à entrega da carga de nanopartículas, os parâmetros de ultrassom apropriados devem fazer parte da investigação. Ao lado da ressonância, essas bolhas também devem ser conduzidas a ou além de seu limiar para liberação de nanopartículas, tipicamente em amplitudes de pressão acústica relativamente altas (MI > 0,3)51. Para imagens de microscopia de campo brilhante, é fundamental escolher uma câmera de alta velocidade com uma taxa de quadro suficientemente alta para minimizar o desfoque de movimento e evitar o aliasing.
A microscopia de campo brilhante é limitada principalmente pelo framerate de imagem e intensidade das fontes de luz disponíveis, uma vez que uma taxa de quadros mais alta daria uma visão mais detalhada do tempo resolvido sobre a dinâmica da bolha, mas requer iluminação mais intensa devido a tempos de exposição mais curtos. Para estudar a liberação de partículas com mais detalhes, o framerate para imagens de fluorescência pode, em princípio, ser aumentado aumentando a intensidade da luz laser. No entanto, a absorção da luz laser de alta intensidade pelas microbolhas fluorescentes com rótulos fluorescentes gera calor, mesmo com corantes de alto rendimento quântico. Esse calor pode interferir com os experimentos em jogo e, em casos extremos, induzir cavitação foto-térmica52. Assim, na prática, há um limite para a fluência a laser aplicada. No entanto, a intensa iluminação a laser também pode ser deliberadamente usada para induzir a liberação de partículas de lipossomos53. A temperatura influencia a dinâmica da bolha e a resposta ao ultrassom, dependendo do tipo bolha54. Portanto, se os métodos in vitro e intravital forem comparados objetivamente, os métodos in vitro discutidos no protocolo devem ser realizados a 37 °C. Outra limitação dos métodos in vitro discutidos no artigo atual é que as bolhas não estão em um ambiente de campo livre, pois os microbolhas flutuarão abaixo da membrana do suporte da amostra. Além disso, há um viés de seleção ao fotografar microbolhas únicas. No entanto, a realização de experimentos repetidos em bolhas únicas permite a investigação do efeito do tamanho e remoção do fator de confusão - a distribuição de tamanho. Se a resposta da bolha em função do tamanho puder ser entendida enquanto a concentração não for muito alta para evitar interações bolha-bolha, a resposta de qualquer população de bolhas arbitrárias pode ser calculada. Finalmente, tanto os métodos de microscopia de campo brilhante quanto de fluorescência fornecem insights sobre microbolhas complicadas em uma imagem bidimensional (2D). Se a questão da pesquisa exigir mais de imagens 2D, o comportamento 3D das bolhas pode ser resolvido combinando a configuração descrita no protocolo com uma configuração de visão lateral para imagens multiplanas55.
Um método alternativo para estudar microbolhas é a caracterização acústica56. No entanto, medir o eco de um único microbolhas requer localizar e isolar uma única microbola dentro do feixe de ultrassom56, o que representa um desafio tipicamente enfrentado pelo uso de um tubo estreito ou pinça óptica ou acústica57,58. Para dimensionar bolhas acústicas, os microbolhas podem ser insonificados no regime de dispersão geométrica em frequências muito superiores à sua frequência de ressonância, o que não induz oscilações volumétricas de microbolhas59. O uso de uma "câmera acústica" é um método para imagem da dinâmica radial de microbolhas únicas em resposta ao ultrassom, onde uma sonda de ultrassom de alta frequência é usada para determinar a resposta radial da bolha a uma onda de condução de baixa frequência60. A desvantagem deste método é que ele só pode ser usado para determinar a alteração relativa do raio de microbolhas; portanto, outro método é necessário para determinar o raio de bolha absoluta, por exemplo, através de imagens ópticas61,62. A desvantagem dos métodos em que os microbolhas são expostos ao ultrassom em frequências superiores à sua frequência de ressonância é que, em frequências tão altas, a profundidade de penetração é reduzida59, limitando a usabilidade para aplicações in vivo. Outras formas de microscopia também podem ser usadas para estudar microbolhas como microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de transmissão63. A resolução espátula-temporal alcançável dessas técnicas alternativas de microscopia, no entanto, é geralmente mais limitada, e essas técnicas têm a desvantagem de que a imagem é realizada antes ou depois da exposição ao ultrassom por análise off-line e normalmente apresentam um baixo throughput63. Outra alternativa é usar um método de dispersão de luz, que pode ser usado para estudar a dinâmica radial de microbolhas únicas em tempo real, mas tem uma baixa relação sinal-ruído em comparação com os métodos de dispersão acústica64.
A microscopia intravital em tempo real durante a exposição ao ultrassom é um método poderoso para adquirir uma nova visão sobre a vasculatura, comportamento de microbolhas, nanopartículas ou outras moléculas (como o dextran neste caso) durante a exposição ao ultrassom. Uma limitação geral ao realizar microscopia intravital em tempo real é que apenas uma pequena área do tecido é visualizada, e a profundidade de penetração da luz no tecido é limitada. Se os vasos de imagem contiveram pouquíssimas microbolhas e/ou nanopartículas dentro do campo de visão, pouca ou nenhuma informação sobre o comportamento da nanopartícula e extravasação pode ser obtida. Além disso, devido ao campo de visão limitado, um alinhamento adequado entre os caminhos de luz e ultrassom é crucial. Se a pressão do ultrassom for alta o suficiente para induzir a destruição da bolha, também é importante escolher uma frequência de repetição de pulso que permita que bolhas frescas se reperfusem no campo de visão entre pulsos de ultrassom. Além disso, como o ultrassom será refletido a partir do vidro de cobertura na câmara da janela e do objetivo, colocar o transdutor em um ângulo é importante para reduzir os reflexos, como para evitar a formação de ondas de pé, que distorcem o campo de pressão calibrado. Outra questão prática é que a configuração precisa ter espaço suficiente para montar o transdutor de ultrassom e guia de ondas acima ou abaixo do objetivo na configuração do microscópio. Os tumores na câmara da janela dorsal terão uma espessura limitada devido à câmara de confinamento e ao deslizamento da tampa; no entanto, se necessário, outros modelos poderiam ser usados. Exemplos são tumores de dobras cutâneas, por exemplo, na almofada de gordura mamária 65 ou na imagem intravital abdominal de tumores nos vários órgãos66. Tais tumores podem ser cultivados ortotopicamente no microambiente adequado e, como tal, apresentam um caso mais clinicamente relevante.
Os métodos descritos neste trabalho esclarecem o potencial de microbolhas fluorescentes para estudar os fundamentos das aplicações de entrega de medicamentos utilizando bolhas e ultrassom. Esta combinação de métodos de microscopia fornece uma visão valiosa sobre a resposta de microbolhas à inssonação do ultrassom e seu espaço de parâmetro acústico associado e apresenta uma visão clara do comportamento de microbolhas e cargas ao longo de uma faixa relevante de escalas de tempo e comprimento.

O ultrassom é a técnica de imagem médica mais utilizada. É não invasivo, rápido, seguro, econômico e portátil1,2,3. No entanto, o sangue é um dispersão de ultrassom ruim, e o contraste da poça sanguínea pode ser aumentado por uma injeção intravenosa de agentes de contraste de ultrassom3. Esse contraste aprimorado da poça sanguínea permite a quantificação da perfusão de órgãos para fins diagnósticos, por exemplo, na detecção de doença arterial coronariana4 e doença hepática metastática5. De fato, a vasculatura tumoral foi provada como um importante fator prognóstico6. Um grande esforço de pesquisa agora é direcionado para microbolhas assistidas, imagens moleculares direcionadas e agentes de contraste de alfaiataria para uso terapêutico.
Os agentes de contraste de ultrassom disponíveis comercialmente normalmente consistem em uma suspensão de microbolhas revestidas7,8 com diâmetros que variam de 1 μm a 10 μm9. Uma vez que os microbolhas do agente de contraste de ultrassom são ligeiramente menores que os glóbulos vermelhos7, os microbolhas podem atingir com segurança até mesmo os menores capilares sem criar uma oclusão3. Os microbolhas têm um coeficiente de backscattering de ultrassom dramaticamente aumentado em comparação com o tecido10, devido ao seu núcleo de gás compressível11. Além disso, o eco de microbolhas é altamente não linear, ou seja, seu espectro contém harmônicos e subharmônicos da frequência de condução. Além disso, a força do eco depende fortemente da resposta ressonante da bolha12. Enquanto o tecido se dispersa apenas linearmente, um pequeno número de microbolhas é suficiente para alcançar uma alta sensibilidade de detecção em imagens harmônicas13,14. Esta geração de contraste não linear pode até ser forte o suficiente para rastrear bolhas únicas no corpo15.
A concha do agente de contraste do ultrassom estabiliza as bolhas contra a dissolução e a coalescência, aumentando assim seu tempo de circulação na poça sanguínea16. A casca pode consistir de lipídios, polímeros ou proteínas desnaturadas3,8. Diminui a tensão interfacial, limitando assim o efeito da dissolução movida a pressão de Laplace17 e cria uma barreira resistiva contra a difusão de gás18. Para aumentar ainda mais a estabilidade, os microbolhas de contraste são tipicamente preenchidos com um gás de alto peso molecular com baixa solubilidade no sangue11. A concha de microbolhas altera drasticamente a resposta dos microbolhas à inseção de ultrassom11. Bolhas de gás não revestidas têm uma frequência de ressonância característica que é inversamente proporcional ao seu tamanho e a adição de um revestimento lipídico aumenta a frequência de ressonância em relação à de um buble não revestido devido à rigidez intrínseca da casca3. Além disso, a casca dissipa energia através da viscosidade dilatacional, que constitui a fonte dominante de amortecimento para bolhas revestidas3. A concha estabilizadora tem a vantagem adicional de que pode ser funcionalizada, por exemplo, ligando ligantes de destino à superfície de microbolhas. Esse direcionamento permite muitas aplicações para essas bolhas e, em particular, imagens moleculares com ultrassom14,19.
Os agentes de contraste de microbolhas têm grande promessa para aplicações de entrega de medicamentos com ultrassom. Microbolhas oscilando no confinamento de um vaso sanguíneo podem causar microstreaming, bem como tensões normais e de tesoura locais na parede capilar3. Em altas pressões acústicas, grandes oscilações de amplitude podem levar ao colapso de microbolhas em um processo violento chamado cavitação inercial, que, por sua vez, pode levar à ruptura ou invaginação do vaso sanguíneo20. Esses fenômenos violentos podem induzir efeitos bioefálicos como a sonopermeação21, aumentando a extravasão de drogas terapêuticas no interstício através da parede endotelial, seja paracelularmente ou transcelularmente. Também pode melhorar a penetração de agentes terapêuticos através da matriz extracelular de tumores ricos em estroma21,22 e biofilmes23,24, embora esse mecanismo ainda seja mal compreendido26.
O fornecimento de medicamentos mediados por ultrassom tem mostrado resultados promissores tanto pré-clínicos27,28 quanto em ensaios clínicos22. Além disso, quando usados com ultrassom relativamente de baixa frequência (~1 MHz), microbolhas têm sido relatadas localmente e transitoriamente aumentam a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo assim que as drogas entrem no parenchyma cerebral, tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos29,30,31,32,33,34.
Geralmente há duas abordagens para o fornecimento de medicamentos mediados por ultrassom: o material terapêutico pode ser coadministrado com as bolhas, ou pode ser anexado ou carregado na bolha shell28,35,36. A segunda abordagem mostrou-se mais eficiente em termos de entrega de drogas37. Microbolhas podem ser carregadas com drogas ou material genético encapsulados em nanopartículas (lipossomos ou nanoconstróis poliméricas) anexadas à casca ou incorporadas diretamente na concha de microbolhas35,36. Microbolhas carregadas de nanopartículas podem ser ativadas por ultrassom (focado) para liberar localmente a carga de nanopartículas28,33,38,39,40. Se tal microbolhas estiver em contato direto com uma célula, foi demonstrado in vitro que a carga pode até ser depositada na membrana citoplasmática celular em um processo chamado sonoimplos34,35.
O espaço do parâmetro de ultrassom para insonação de microbolhas é extenso, e as condições biológicas in vivo adicionam ainda mais complexidade. Assim, a combinação de ultrassom focado e microbolhas carregadas de nanopartículas representa um desafio no campo da terapêutica direcionada.
O objetivo deste trabalho é fornecer protocolos que possam ser utilizados para a imagem, em detalhes, a resposta de microbolhas em função dos parâmetros de ultrassom e estudar os mecanismos que levam à ruptura da concha e posterior liberação do material de concha fluorescente. Este conjunto de protocolos é aplicável a microbolhas com conchas que contêm um corante fluorescente. A Figura 1 mostra uma representação esquemática dos microbolhas polimórica-nanopartículas e proteínas estabilizadas desenvolvidas no SINTEF (Trondheim, Noruega). Estas bolhas são preenchidas com gás perfluoropropano (C3F8) e as nanopartículas que estabilizam a casca contêm NR668, que é um derivado lipofílico de corante fluorescente vermelho do Nilo38,43. As nanopartículas consistem em poli (2-ethyl-butyl cyanoacrylate) (PEBCA) e são PEGylated. A funcionalização com polietileno glicol (PEG) reduz a opsonização e a fagocitose pelo sistema de fagocite mononuclear, ampliando assim o tempo de circulação14,44. Como resultado, a PEGylation aumenta a quantidade de nanopartículas atingindo o local alvo, melhorando assim a eficácia do tratamento16. A Figura 2 ilustra como o uso de quatro métodos de microscopia permite que os pesquisadores cubram todas as escalas de tempo e comprimento relevantes. Deve-se notar que a resolução espacial alcançável na microscopia óptica é determinada pelo limite de difração, que depende do comprimento de onda da luz e abertura numérica (NA) do objetivo e da fonte de iluminação do objeto45. Para os sistemas em mãos, o limite de resolução óptica é tipicamente de 200 nm. Além disso, a microscopia intravital pode ser usada para imagem no nível subcelular46. Para os microbolhas estabilizados por nanopartículas e proteínas utilizados neste trabalho, a escala mínima de comprimento relevante para a microscopia intravital é do tamanho de pequenos capilares (≥ 10 μm). Imagens ópticas in vitro de alta velocidade (10 milhões de quadros por segundo) e experimentos de imagens de fluorescência de alta velocidade (500.000 quadros por segundo) são descritos para microbolhas únicas. Imagens de campo brilhante de alta velocidade em escalas de tempo nanossegundos são adequadas para estudar a dinâmica radial resolvida pelo tempo das bolhas vibratórias. Em contraste, a microscopia de fluorescência de alta velocidade permite a visualização direta da liberação das nanopartículas fluorescentes. Além disso, a estrutura da cápsula de microbolhas pode ser investigada usando microscopia confocal tridimensional (3D) de Z-stack (3D) e microscopia eletrônica de varredura (o protocolo para este último não está incluído no trabalho atual). A microscopia intravital consiste em usar microscopia multifotícula para tumores de imagem crescendo em câmaras de janelas dorsais para fornecer informações em tempo real sobre o fluxo sanguíneo local e sobre o destino de nanopartículas fluorescentes rotuladas em vivo47. A combinação desses métodos de microscopia, em última análise, fornece uma visão detalhada do comportamento dos agentes de microbolhas terapêuticas em resposta ao ultrassom, tanto in vitro quanto in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Os agentes de contraste de microbolhas têm grande promessa para aplicações de entrega de medicamentos com ultrassom. Encapsular drogas em nanopartículas reduz a toxicidade sistêmica e aumenta o tempo de circulação das drogas. Em uma nova abordagem para a entrega de medicamentos assistidos por microbolhas, as nanopartículas são incorporadas em ou em conchas de microbolhas, permitindo a liberação local e desencadeada da carga de nanopartículas com ultrassom. Uma compreensão completa dos mecanismos de liberação dentro do vasto espaço de parâmetros de ultrassom é crucial para uma liberação eficiente e controlada. Este conjunto de protocolos apresentados é aplicável a microbolhas com uma concha contendo um rótulo fluorescente. Aqui, o foco está em microbolhas carregadas com nanopartículas poli (2-2-ethyl-butil cyanoacrilato), dopadas com um corante vermelho do Nilo modificado. As partículas são fixadas dentro de uma concha desnaturada. As microbolhas são produzidas por agitação vigorosa, formando uma dispersão de gás perfluoropropano na fase líquida contendo caseína e nanopartículas, após a qual a concha de microbolhas se auto-monta. Uma variedade de técnicas de microscopia são necessárias para caracterizar os microbolhas estabilizados por nanopartículas em todas as escalas de tempo relevantes do processo de liberação de nanopartículas. A fluorescência das nanopartículas permite imagens confocal de microbolhas únicas, revelando a distribuição de partículas dentro da concha. Imagens in vitro de ultra-alta velocidade usando microscopia de campo brilhante a 10 milhões de quadros por segundo fornecem insights sobre a dinâmica da bolha em resposta à inssonação do ultrassom. Finalmente, a liberação de nanopartículas da casca de bolha é melhor visualizada por meio de microscopia de fluorescência, realizada a 500.000 quadros por segundo. Para caracterizar a entrega de medicamentos in vivo, a liberação desencadeada de nanopartículas dentro da vasculatura e sua extravasação além da camada endotelial é estudada utilizando microscopia intravital em tumores implantados em câmaras de janelas de dobra dorsal, ao longo de uma escala de tempo de vários minutos. A combinação dessas técnicas complementares de caracterização fornece uma visão única sobre o comportamento dos microbolhas e sua liberação de carga em uma variedade de escalas de tempo e comprimento, tanto in vitro quanto in vivo.

Os microbolhas, produzidos conforme descrito no protocolo, foram analisados utilizando-se diversos métodos de microscopia e em várias escalas de tempo.
A fluorescência das nanopartículas na microscopia confocal (Figura 6A) indica que a casca tem uma distribuição de partículas não uniformes. Outros métodos de microscopia podem ser usados para caracterização de bolhas. Por exemplo, a Figura 6B mostra a estrutura geral do microbolhas usando microscopia eletrônica de varredura, como apresentado em trabalhos anteriores34.
A dinâmica radial e o comportamento da bolha fenomenológica podem ser estudados usando o método de microscopia de campo brilhante descrito in vitro , onde os microbolhas foram visualizados a 10 milhões de quadros por segundo. O raio de microbolhas individuais foi extraído ao longo do tempo usando um script escrito internamente. Um exemplo de tal resposta radial é mostrado na Figura 7.
Uma sequência de imagem de entrega típica de nanopartículas bem sucedidas, conforme descrito na seção 2.3.6, é mostrada na Figura 8A. As nanopartículas embutidas na concha de microbolhas podem ser vistas para acender devido à fluorescência quando a luz laser atinge a bolha. Impulsionadas pela insanação do ultrassom, as nanopartículas fluorescentes se desprendem do núcleo gasoso dos microbolhas e são depositadas na membrana do suporte da amostra. Finalmente, o laser é desligado, e as nanopartículas fluorescentes não estão mais animadas. A entrega mal sucedida da carga fluorescente dos microbolhas normalmente se parece com a sequência de imagem mostrada na Figura 8B, onde as nanopartículas fluorescentes acendem-se sobre a casca do microbolhas que permanece intacta durante a exposição ao ultrassom.
A microscopia multifotol intravital em tempo real durante o ultrassom foi usada para investigar os efeitos do ultrassom e microbolhas no comportamento de nanopartículas no sangue, melhoria da permeabilidade dos vasos sanguíneos tumorais e melhoria da entrega de nanopartículas. A extensão e cinética da penetração na matriz extracelular em função da pressão acústica, frequência e comprimentos de pulso podem ser caracterizadas. O efeito do tratamento de ultrassom pode variar em relação ao tamanho e morfologia dos vasos e consequente confinamento da bolha. Como o tratamento do ultrassom afeta o fluxo sanguíneo e a direção podem ser determinados. Um experimento de exemplo mostrando a extravasação de nanopartículas ao longo do tempo é mostrado na Figura 9 em um índice mecânico (MI) de 0,826. Os resultados da microscopia multifotílica intravital elucidam a extravasação espacial e temporal de nanopartículas durante a exposição ao ultrassom, o que é altamente benéfico para a compreensão completa dos mecanismos subjacentes à entrega mediada por ultrassom de nanopartículas e para otimizar tais tecnologias26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática de uma microbolhas com uma concha de nanopartículas poliméricas fluorescentes em caseína desnaturada. As microbolhas são tipicamente entre 1 μm e 10 μm de diâmetro. As nanopartículas têm um diâmetro principalmente entre 100 nm e 200 nm38. Abreviação: C3F8 = gás perfluoropropano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figura 2: Visão geral de esquema mostrando as escalas de tempo e comprimento relevantes para microscopia de campo brilhante, fluorescência, confocal e intravital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figura 3: Representação esquemática de experimentos de microscopia de campo brilhante. (A) Configuração experimental, (B) o diagrama de tempo e (C) um quadro típico gravado. Barra de escala em (C) = 10 μm. Abreviação: fps = quadros por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figura 4: Representação esquemática de experimentos de microscopia de fluorescência. (A) Configuração experimental, (B) o diagrama de tempo e (C) um quadro típico gravado. Barra de escala em (C) = 10 μm. Abreviação: fps = quadros por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figura 5: Representação esquemática de experimentos de microscopia intravital. (A) Configuração experimental, (B) o diagrama de tempo e (C) um quadro típico gravado. Barra de escala em (C) = 50 μm. O verde corresponde ao dextran-FITC e vermelho às nanopartículas. Abreviação: GaAsP = gálio arssenida fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figura 6: Estrutura 3D de uma única microbolça estabilizada por nanopartículas e proteínas. (A) Utilizando microscopia confocal para mostrar as nanopartículas, e (B) usando um microscópio eletrônico de varredura para mostrar a estrutura 3D. (B) foi reproduzido com permissão de 34. Barra de escala em (A) = 5 μm; barra de escala em (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figura 7: Oscilações esféricas típicas de um microbolhe de 2,89 μm de raio e proteína estabilizada em uma frequência de ultrassom de 1 MHz e uma amplitude de pressão acústica de 142 kPa. (A-D) Imagens da gravação de alta velocidade e do raio de bolha correspondente ao longo da curva do tempo (inferior). Barras de escala = 5 μm, e a linha vermelha indica o raio inicial. O perfil de iluminação (unidades arbitrárias) é indicado por amarelo. A ampliação é de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figura 8: Sequência de imagem da microscopia de fluorescência de alta velocidade. (A) Entrega bem sucedida de nanopartículas fluorescentes de um microbolesco estabilizado por nanopartículas e proteínas em uma frequência de ultrassom de 2 MHz e uma amplitude de pressão acústica de 600 kPa. (B) Entrega mal sucedida de nanopartículas fluorescentes rotuladas de uma microbola estabilizada por nanopartículas e proteínas insonificada em uma frequência de ultrassom de 2 MHz e uma amplitude de pressão acústica de 210 kPa. Barras de escala = 10 μm. A ampliação é de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figura 9: Microscopia intravital após inssonação de microbolhas estabilizadas por nanopartículas e proteínas a uma frequência de ultrassom de 1 MHz e uma amplitude de pressão acústica de 800 kPa. (A) Nanopartículas dentro do vaso, e (B) uma sequência de imagem da área indicada pelo quadrado branco tracejado em (A) representando a extravasação de dextran (verde) e nanopartículas (vermelho). Barras de escala = 50 μm. A ampliação é 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Os protocolos apresentados podem ser usados para caracterizar a resposta de microbolhas fluorescentes rotuladas projetadas para aplicações de entrega de medicamentos acionados por ultrassom, incluindo seus mecanismos de ativação, bem como seus efeitos biológicos. Este artigo abrange uma gama de técnicas de microscopia in vitro e in vivo realizadas para capturar o comprimento e escalas de tempo relevantes.

Métodos de microscopia em escala de tempo para a caracterização de microbolhas fluorescentes para liberação de medicamentos acionados por ultrassom

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Este protocolo pode ser usado para caracterizar a resposta de microbolhas fluorescentes rotuladas que são projetadas para aplicações de entrega de medicamentos desencadeadas por ultrassom, que inclui os mecanismos de ativação e os biofeitos. A chave está na combinação de técnicas de imagem que nos permite desvendar o problema em várias escalas da entrega de drogas desencadeadas por ultrassom com bolhas, tanto em escalas espaciais diferentes quanto em escalas de tempo diferentes. Para uma única imagem de bolha por microscopia Brightfield, coloque uma agulha de ventilação de calibre 19 e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 19 para remover uma pequena quantidade da suspensão de microbolhas do frasco de vidro em um pequeno tubo para facilitar a tubulação na próxima etapa.Usando uma pipeta, dilui a solução de microbolhas em soro fisco filtrado tamponado. Use uma seringa de 10 mililitros para injetar a amostra em uma saída do suporte de amostra até que o suporte esteja cheio sem criar bolhas de ar, injetando mais da amostra, se necessário. Feche ambas as válvulas do suporte da amostra e coloque o suporte da amostra perpendicular ao eixo óptico do microscópio.Antes da análise da amostra, defina a frequência de condução de ultrassom desejada e a pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e, começando com o campo de visão em um canto do suporte da amostra, use o estágio XYZ para mover o suporte para localizar microbolhas únicas no campo de visão do microscópio, em seguida, anexar uma fibra óptica conectada a um banho de água a uma luz estroboscópica e iniciar a gravação. Repita a imagem quantas vezes desejarem por configuração de ultrassom, movendo o suporte da amostra pelo menos dois milímetros para um campo de visão contendo microbolhas nãoônicas para cada análise. Para imagens microscópicas de fluorescência dos microbolhas, depois de diluir a solução de microboque em salina tamponada de fosfato como demonstrado, defina a frequência de condução de ultrassom desejada e a pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e defina o atraso do gatilho para o laser no gerador de atraso de pulso para excitação de fluorescência das nanopartículas dos microcompletos, em seguida, use o estágio XYZ para mover o suporte de amostra para localizar microcompletos únicos e trazê-los para o foco de microcomplepâncias o objetivo, em seguida, acionar a gravação.Repita a imagem conforme desejado alterando as configurações do ultrassom e movendo o suporte da amostra para o novo campo de visão como demonstrado. Para a imagem por microscopia intravital, posicione primeiro um suporte animal aquecido no estágio de posicionamento XY entre o guia de ondas e o objetivo e adicione gel de acoplamento ao guia de ondas. Insira um cateter da veia da cauda na veia traseira de um rato com rolamento de tumor anestesiado e coloque o mouse equipado com uma câmara de janela no suporte aquecido.Adicione uma gota de água ao deslizamento de cobertura. Para visualizar a vasculatura do tecido tumoral, injete por via intravenosa 30 microlitros de quatro miligramas por mililitro rotulado fluorescentemente 2 megadalton dextran no cateter da veia traseira e use o estágio de tradução XY para mover o rato até que um campo de visão com vasos sanguíneos adequados possa ser localizado. Ajuste a taxa de quadros, o campo de visão e o comprimento da gravação de acordo com os parâmetros do experimento e registo imagens da linha de base dos vasos.Quando as imagens da linha de base tiverem sido adquiridas, defina a frequência de condução do ultrassom, o comprimento do pulso e a amplitude da pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e injete por via intravenosa 50 microlitros de amostra de microbolhas na veia da cauda. Em seguida, imagem a vasculatura como demonstrado. A análise dos microbolhas por microscopia de fluorescência confocal revela uma distribuição de partículas não uniformes da concha de microbolhas.A estrutura geral dos microbolhas pode ser visualizada por meio da microscopia eletrônica de varredura. A análise da dinâmica radial e do comportamento fenomenológico da microbolhas insonizadas pela microscopia brightfield permite a valorização da mudança relativa no raio de microbolhas ao longo do tempo. Aqui, uma sequência de imagem de uma entrega típica bem sucedida de nanopartículas fluorescentes rotuladas é mostrada.As nanopartículas embutidas na concha de microbolhas podem ser observadas para fluoresce quando a luz laser atinge a bolha. Como observado neste parto mal sucedido, no entanto, as nanopartículas fluorescentes acendem sobre a casca da microbolhas, que permanece intacta durante a exposição ao ultrassom. Imagens multifótons intravitais podem ser usadas para determinar a extravasão espacial e temporal das nanopartículas durante a exposição ao ultrassom, o que pode ser benéfico para entender e otimizar os mecanismos subjacentes à entrega de nanopartículas mediadas por ultrassom.Com o alinhamento perfeito das vias ópticas e acústicas em todas as escalas de tempo e tempo, uma visão abrangente sobre o fornecimento de medicamentos desencadeados por ultrassom é fornecida. As respostas entregues por nossos experimentos em várias escalas serão agora traduzidas para a prática clínica. Os resultados fornecerão informações valiosas para uma série de aplicações terapêuticas, incluindo a terapia contra o câncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Bioengenharia

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Alternando microgéis de gelatina híbrido Campo-Responsive magnética para controlada de fármacos de libertação

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Os métodos para a auto-integração da Megamolecular Biopolímeros na secagem ao ar-LC interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Digitalização de slides automatizado e segmentação em tecidos fluorescente-rotulado, usando um sistema de análise de Widefield alto teor

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...