Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Различные методы оптической микроскопии были объединены для получения информации о различных этапах доставки наночастиц с поверхности микропузырьков в окружающую среду. Была выполнена визуализация пузырьковых колебаний, а также визуализация высвобождения наночастиц из оболочки пузырька, экстравазации и проникновения через внеклеточный матрикс опухолей in vivo. Визуализация in vitro позволяет проводить скрининг многих ультразвуковых параметров по сравнению с более сложными установками in vivo . Преимуществом объединения этого диапазона методов визуализации является дополнительная информация, которая может быть получена в разных временных масштабах - особенность, которая имеет решающее значение для характеристики и оптимизации микропузырьков для успешной доставки и получения терапевтической эффективности. Этот подход полезен для понимания механизмов доставки для всех микропузырьков, включая конструкции с флуоресцентно мечеными наночастицами и лекарствами.
Наиболее важные этапы в методах микроскопии, используемых для изучения отдельных микропузырьков, заключаются в следующем. Для флуоресцентной микроскопии наночастицы должны быть флуоресцентно помечены, чтобы обеспечить визуализацию высвобождения частиц. Кроме того, раствор образца должен быть достаточно разбавлен, чтобы выделить отдельные микропузырьки для анализа в конфокальных, ярко-полевых и флуоресцентных методах микроскопии. Кроме того, важно выбрать ультразвуковую движущую частоту и акустическое давление, чтобы возбуждать пузырьки наиболее эффективно, а именно при их резонансе. Если исследовательский вопрос касается доставки полезной нагрузки наночастиц, соответствующие параметры ультразвука должны быть частью исследования. Наряду с резонансом, эти пузырьки также должны быть запущены на уровне или выше их порога для высвобождения наночастиц, как правило, при относительно высоких амплитудах акустического давления (MI > 0,3)51. Для визуализации в ярко-полевой микроскопии важно выбрать высокоскоростную камеру с достаточно высокой частотой кадров, чтобы минимизировать размытие движения и избежать сглаживания.
Микроскопия яркого поля в основном ограничена частотой кадров изображения и интенсивностью доступных источников света, поскольку более высокая частота кадров даст более подробное представление о динамике пузырьков с временным разрешением, но требует более интенсивного освещения из-за более короткого времени экспозиции. Чтобы изучить высвобождение частиц более подробно, частота кадров для флуоресцентной визуализации может быть, в принципе, увеличена за счет увеличения интенсивности лазерного света. Однако поглощение лазерного света высокой интенсивности флуоресцентно мечеными микропузырьками генерирует тепло, даже с высококвантовыми красителями. Это тепло может помешать экспериментам, поставленным на карту, и в крайних случаях вызвать фототермическую кавитацию52. Таким образом, на практике существует предел применяемого лазерного флюенса. Однако интенсивное лазерное освещение также может быть преднамеренно использовано для индуцирования высвобождения частиц из липосом53. Температура влияет на динамику пузырьков и ультразвуковой отклик, в зависимости от типа пузырька54. Поэтому, если методы in vitro и intravital должны быть объективно сопоставлены, то методы in vitro , обсуждаемые в протоколе, должны выполняться при 37 °C. Другим ограничением методов in vitro , обсуждаемых в настоящей статье, является то, что пузырьки не находятся в среде свободного поля, поскольку микропузырьки будут плавать под мембраной держателя образца. Кроме того, существует смещение выбора при визуализации одиночных микропузырьков. Однако проведение повторных экспериментов на одиночных пузырьках позволяет исследовать влияние размера и устранить смешанный фактор - распределение размеров. Если реакцию пузыря как функцию размера можно понять, пока концентрация не слишком высока, чтобы предотвратить взаимодействия пузырь-пузырь, можно рассчитать реакцию любой произвольной популяции пузыря. Наконец, методы микроскопии с ярким полем и флуоресцентной микроскопией дают представление о микропузырьках, запутанных в двумерном (2D) изображении. Если исследовательский вопрос требует более чем 2D-изображения, 3D-поведение пузырьков может быть решено путем объединения настройки, описанной в протоколе, с настройкой бокового обзора для многоплоскостной визуализации55.
Альтернативным методом исследования микропузырьков является акустическая характеристика56. Однако измерение эха одного микропузырька требует обнаружения и изоляции одного микропузырька в ультразвуковом луче56, что представляет собой проблему, обычно решаемую с помощью узкой трубки или оптического или акустического пинцета57,58. Для акустического размера пузырьков микропузырьки могут быть озвучены в режиме геометрического рассеяния на частотах, значительно превышающих их резонансную частоту, что не вызывает объемных микропузырьковых колебаний59. Использование «акустической камеры» является таким методом для изображения радиальной динамики одиночных микропузырьков в ответ на ультразвук, при котором высокочастотный ультразвуковой зонд используется для определения радиального отклика пузыря на низкочастотную движущую волну60. Недостатком данного метода является то, что его можно использовать только для определения относительного изменения радиуса микропузырька; следовательно, необходим другой метод для определения абсолютного радиуса пузырька, например, с помощью оптической визуализации61,62. Недостатком методов, в которых микропузырьки подвергаются воздействию ультразвука на частотах, превышающих их резонансную частоту, является то, что на таких высоких частотах глубина проникновения уменьшается59, что ограничивает удобство использования для приложений in vivo. Другие формы микроскопии также могут быть использованы для изучения микропузырьков, таких как сканирующая электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия63. Однако достижимое пространственно-временное разрешение этих альтернативных методов микроскопии, как правило, более ограничено, и эти методы имеют тот недостаток, что визуализация выполняется либо до, либо после ультразвукового воздействия путем автономного анализа и обычно представляет низкую пропускную способность63. Другой альтернативой является использование метода рассеяния света, который может быть использован для изучения радиальной динамики одиночных микропузырьков в режиме реального времени, но имеет низкое отношение сигнал/шум по сравнению с методами акустического рассеяния64.
Прижизненная микроскопия в режиме реального времени во время ультразвукового воздействия является мощным методом для получения нового понимания сосудистой системы, поведения микропузырьков, наночастиц или других молекул (таких как декстран в данном случае) во время ультразвукового воздействия. Общим ограничением при выполнении прижизненной микроскопии в режиме реального времени является то, что визуализируется только небольшая область ткани, а глубина проникновения света в ткань ограничена. Если изображенные сосуды содержат очень мало микропузырьков и/или наночастиц в поле зрения, мало или вообще никакой информации о поведении и экстравазации наночастиц можно получить. Кроме того, из-за ограниченного поля зрения решающее значение имеет правильное выравнивание между световым и ультразвуковым путями. Если ультразвуковое давление достаточно высокое, чтобы вызвать разрушение пузырьков, также важно выбрать частоту повторения импульса, которая позволяет свежим пузырькам репертифицироваться в поле зрения между ультразвуковыми импульсами. Кроме того, поскольку ультразвук будет отражаться от покровного стекла в оконной камере и объектива, размещение преобразователя под углом важно для уменьшения отражений, чтобы предотвратить образование стоячих волн, которые искажают калиброванное поле давления. Другая практическая проблема заключается в том, что установка должна иметь достаточно места для установки ультразвукового преобразователя и волновода выше или ниже объектива в установке микроскопа. Опухоли в дорсальной оконной камере будут иметь ограниченную толщину из-за ограничивающей камеры и скольжения крышки; однако при необходимости можно использовать и другие модели. Примерами являются опухоли кожной складки, например, в жировой подушке молочной железы65 или абдоминальная прижизненная визуализация опухолей в различных органах66. Такие опухоли могут быть выращены ортотопически в соответствующей микросреде и, как таковые, представляют собой более клинически значимый случай.
Методы, описанные в этой работе, раскрывают потенциал флуоресцентно меченых микропузырьков для изучения основ применения доставки лекарств с использованием пузырьков и ультразвука. Эта комбинация методов микроскопии дает ценную информацию о реакции микропузырька на ультразвуковую инсонацию и связанное с ней пространство акустических параметров и представляет четкое представление о поведении микропузырьков и полезной нагрузки в соответствующем диапазоне временных и длинных масштабов.

Ультразвук является наиболее широко используемым методом медицинской визуализации. Он неинвазивный, быстрый, безопасный, экономичный и портативный1,2,3. Однако кровь является плохим ультразвуковым рассеивателем, и контрастность кровотока может быть усилена внутривенной инъекцией ультразвуковых контрастных веществ3. Этот улучшенный контраст между пулом крови позволяет количественно оценить перфузию органов в диагностических целях, например, при выявлении ишемической болезни сердца4 и метастатической болезни печени5. Действительно, было доказано, что опухолевая сосудистая система является важным прогностическим фактором6. Основные исследовательские усилия в настоящее время направлены на микропузырьковую, целевую молекулярную визуализацию и адаптацию контрастных агентов для терапевтического использования.
Коммерчески доступные ультразвуковые контрастные вещества обычно состоят из суспензии покрытых микропузырьков7,8 диаметром от 1 мкм до 10 мкм9. Поскольку микропузырьки ультразвукового контрастного вещества немного меньше, чем эритроциты7, микропузырьки могут безопасно достигать даже самых маленьких капилляров, не создавая окклюзии3. Микропузырьки имеют резко повышенный коэффициент обратного рассеяния ультразвука по сравнению с тканью10 из-за их сжимаемого газового ядра11. Кроме того, микропузырьковое эхо очень нелинейно, т.е. его спектр содержит гармоники и субгармоники движущей частоты. Кроме того, сила эха сильно зависит от резонансной реакции пузыря12. В то время как ткань рассеивается только линейно, небольшого количества микропузырьков достаточно для достижения высокой чувствительности обнаружения в гармонической визуализации13,14. Эта нелинейная генерация контраста может быть даже достаточно сильной, чтобы отслеживать одиночные пузырьки в теле15.
Оболочка ультразвукового контрастного вещества стабилизирует пузырьки против растворения и слияния, тем самым увеличивая время их циркуляции в бассейне крови16. Оболочка может состоять из липидов, полимеров или денатурированных белков3,8. Он уменьшает межфазное напряжение, тем самым ограничивая эффект растворения, управляемого давлением Лапласа17, и создает резистивный барьер против диффузии газа18. Для дальнейшего повышения стабильности контрастные микропузырьки обычно заполняются высокомолекулярным газом с низкой растворимостью в крови11. Оболочка микропузырька резко изменяет реакцию микропузырьков на ультразвуковую инсонацию11. Пузырьки газа без покрытия имеют характерную резонансную частоту, которая обратно пропорциональна их размеру, и добавление липидного покрытия увеличивает резонансную частоту по отношению к частоте непокрытого пузырька из-за внутренней жесткости оболочки3. Кроме того, оболочка рассеивает энергию через дилатационную вязкость, которая является доминирующим источником демпфирования для покрытых пузырьков3. Стабилизирующая оболочка имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что она может быть функционализирована, например, путем связывания целевых лигандов с поверхностью микропузырьков. Это нацеливание позволяет использовать множество применений для этих пузырьков и, в частности, молекулярную визуализацию с помощью ультразвука14,19.
Микропузырьковые контрастные вещества имеют большие перспективы для доставки лекарств с ультразвуком. Микропузырьки, колеблющиеся в замкнутости кровеносного сосуда, могут вызывать микропоток, а также локальные нормальные и сдвиговые нагрузки на стенку капилляра3. При высоких акустических давлениях колебания большой амплитуды могут привести к коллапсу микропузырьков в бурном процессе, называемом инерционной кавитацией, что, в свою очередь, может привести к разрыву или инвагинации кровеносного сосуда20. Эти насильственные явления могут вызывать биоэффекты, такие как сонопермеация21, усиливая экстравазацию терапевтических препаратов в интерстиций через эндотелиальную стенку, либо параклеточную, либо трансклеточную. Он также может улучшить проникновение терапевтических агентов через внеклеточный матрикс богатых стромой опухолей21,22 и биопленок23,24, хотя этот механизм все еще плохо изучен26.
Ультразвукопосредованная доставка лекарств показала многообещающие результаты как доклинически27,28, так и в клинических испытаниях22. Кроме того, при использовании с относительно низкочастотным ультразвуком (~ 1 МГц) сообщалось, что микропузырьки локально и временно увеличивают проницаемость гематоэнцефалического барьера, тем самым позволяя препаратам проникать в паренхиму головного мозга, как в доклинических, так и в клинических исследованиях29,30,31,32,33,34.
Как правило, существует два подхода к доставке лекарственного средства, опосредованной ультразвуком: терапевтический материал можно вводить совместно с пузырьками, или он может быть прикреплен или загружен в оболочку пузыря28,35,36. Было показано, что второй подход более эффективен с точки зрения доставки лекарств37. Микропузырьки могут быть загружены лекарственными средствами или генетическим материалом, инкапсулированным в наночастицы (липосомы или полимерные наноконструкции), прикрепленные к оболочке или включенные непосредственно в микропузырьковую оболочку35,36. Микропузырьки, нагруженные наночастицами, могут быть активированы (сфокусированным) ультразвуком для локального высвобождения полезной нагрузки наночастиц28,33,38,39,40. Если такой микропузырь находится в прямом контакте с клеткой, было показано in vitro, что полезная нагрузка может быть даже нанесена на цитоплазматическую мембрану клетки в процессе, называемом сонопечатью34,35.
Пространство параметров ультразвука для микропузырьковой инсонации обширно, а биологические условия in vivo еще больше усложняют. Таким образом, сочетание сфокусированного ультразвука и микропузырьков, нагруженных наночастицами, представляет собой проблему в области таргетной терапии.
Целью этой работы является предоставление протоколов, которые могут быть использованы для детального изображения реакции микропузырьков в зависимости от параметров ультразвука и изучения механизмов, приводящих к разрыву оболочки и последующему высвобождению флуоресцентно меченого материала оболочки. Этот набор протоколов применим к микропузырькам с оболочками, которые содержат флуоресцентный краситель. На рисунке 1 показано схематическое изображение полимерно-наночастиц-и-белково-стабилизированных микропузырьков, разработанных в SINTEF (Тронхейм, Норвегия). Эти пузырьки заполнены газообразным перфторпропаном (C3F8), а наночастицы, стабилизирующие оболочку, содержат NR668, который является липофильным производным флуоресцентного красителя Nile Red38,43. Наночастицы состоят из поли(2-этил-бутилцианоакрилата) (PEBCA) и являются PEGylated. Функционализация полиэтиленгликолем (ПЭГ) уменьшает опсонизацию и фагоцитоз мононуклеарной фагоцитарной системой, тем самым продлевая время циркуляции14,44. В результате ПЭГилирование увеличивает количество наночастиц, достигающих целевого участка, тем самым повышая эффективность лечения16. Рисунок 2 иллюстрирует, как использование четырех методов микроскопии позволяет исследователям охватить все соответствующие шкалы времени и длины. Следует отметить, что пространственное разрешение, достижимое в оптической микроскопии, определяется дифракционным пределом, который зависит от длины волны света и числовой апертуры (NA) объектива и источника освещения объекта45. Для имеющихся систем предел оптического разрешения обычно составляет 200 нм. Кроме того, прижизненная микроскопия может быть использована для изображения на субклеточном уровне46. Для микропузырьков, стабилизированных наночастицами и белками, используемых в этой работе, минимальной шкалой длины, относящейся к прижизненной микроскопии, является размер малых капилляров (≥10 мкм). Эксперименты in vitro с высокоскоростной оптической визуализацией (10 миллионов кадров в секунду) и высокоскоростной флуоресцентной визуализацией (500 000 кадров в секунду) описаны для одиночных микропузырьков. Высокоскоростная визуализация яркого поля на наносекундных временных масштабах подходит для изучения радиальной динамики вибрирующих пузырьков с временным разрешением. Напротив, высокоскоростная флуоресцентная микроскопия позволяет непосредственно визуализировать высвобождение флуоресцентно меченых наночастиц. Кроме того, структура микропузырьковой оболочки может быть исследована с помощью Z-стековой трехмерной (3D) конфокальной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (протокол для последней не включен в текущую работу). Прижизненная микроскопия заключается в использовании многофотонной микроскопии для изображения опухолей, растущих в дорсальных оконных камерах, для предоставления информации в режиме реального времени о местном кровотоке и о судьбе флуоресцентно меченых наночастиц in vivo47. Комбинация этих методов микроскопии в конечном итоге дает подробное представление о поведении терапевтических микропузырьковых агентов в ответ на ультразвук, как in vitro, так и in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Микропузырьковые контрастные вещества имеют большие перспективы для доставки лекарств с ультразвуком. Инкапсуляция препаратов в наночастицы снижает системную токсичность и увеличивает время циркуляции препаратов. В новом подходе к доставке лекарств с помощью микропузырьков наночастицы включаются в или на микропузырьковых оболочках, что обеспечивает локальное и триггерное высвобождение полезной нагрузки наночастиц с помощью ультразвука. Глубокое понимание механизмов высвобождения в обширном пространстве параметров ультразвука имеет решающее значение для эффективного и контролируемого высвобождения. Данный набор представленных протоколов применим к микропузырькам с оболочкой, содержащей флуоресцентную метку. Здесь основное внимание уделяется микропузырькам, нагруженным поли(2-этил-бутилцианоакрилатом) полимерными наночастицами, легированными модифицированным красителем Nile Red. Частицы фиксируются внутри денатурированной казеиновой оболочки. Микропузырьки получают путем энергичного перемешивания, образуя дисперсию газа перфторпропана в жидкой фазе, содержащей казеин и наночастицы, после чего оболочка микропузырька самосборется. Различные методы микроскопии необходимы для характеристики стабилизированных наночастицами микропузырьков во всех соответствующих временных масштабах процесса высвобождения наночастиц. Флуоресценция наночастиц позволяет конфокальной визуализации отдельных микропузырьков, выявляя распределение частиц внутри оболочки. Сверхскоростная визуализация in vitro с использованием микроскопии яркого поля со скоростью 10 миллионов кадров в секунду дает представление о динамике пузырьков в ответ на ультразвуковое инсонирование. Наконец, высвобождение наночастиц из оболочки пузыря лучше всего визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии, выполняемой со скоростью 500 000 кадров в секунду. Чтобы охарактеризовать доставку лекарств in vivo, триггерное высвобождение наночастиц в сосудистой системе и их экстравазацию за пределы эндотелиального слоя изучают с помощью прижизненной микроскопии в опухолях, имплантированных в дорсальные оконные камеры кожи, в течение нескольких минут. Сочетание этих дополнительных методов характеризации дает уникальное представление о поведении микропузырьков и высвобождении их полезной нагрузки в диапазоне временных и длинных масштабов, как in vitro , так и in vivo.

Микропузырьки, полученные, как описано в протоколе, анализировали с использованием различных методов микроскопии и в различных временных масштабах.
Флуоресценция наночастиц в конфокальной микроскопии (рисунок 6А) указывает на то, что оболочка имеет неравномерное распределение частиц. Другие методы микроскопии могут быть использованы для характеристики пузырьков. Например, на рисунке 6B показана общая структура микропузырька с использованием сканирующей электронной микроскопии, как представлено в предыдущей работе34.
Радиальная динамика и феноменологическое поведение пузырьков могут быть изучены с использованием описанного метода микроскопии яркого поля in vitro, в котором микропузырьки были изображены со скоростью 10 миллионов кадров в секунду. Радиус одиночных микропузырьков был извлечен с течением времени с помощью сценария, написанного собственными силами. Пример такого радиального отклика показан на рисунке 7.
Последовательность изображений типичной успешной доставки наночастиц, как описано в разделе 2.3.6, показана на рисунке 8А. Можно увидеть, как наночастицы, встроенные в микропузырьковую оболочку, загораются из-за флуоресценции, когда лазерный свет достигает пузыря. Приводимые в действие ультразвуковым инсонацией, флуоресцентные наночастицы отделяются от газового ядра микропузырьков и оседают на мембране держателя образца. Наконец, лазер отключается, и флуоресцентные наночастицы больше не возбуждаются. Неудачная доставка флуоресцентно меченой полезной нагрузки микропузырьков обычно выглядит как последовательность изображений, показанная на рисунке 8B, где флуоресцентные наночастицы загораются на оболочке микропузырька, который остается нетронутым во время ультразвукового воздействия.
Прижизненная многофотонная микроскопия в режиме реального времени во время УЗИ использовалась для исследования влияния ультразвука и микропузырьков на поведение наночастиц в крови, повышение проницаемости опухолевых кровеносных сосудов и улучшение доставки наночастиц. Можно охарактеризовать степень и кинетику проникновения во внеклеточный матрикс в зависимости от акустического давления, частоты и длины импульсов. Эффект ультразвукового лечения может варьироваться в зависимости от размера и морфологии сосудов и последующего удержания пузыря. Как ультразвуковое лечение влияет на кровоток и направление может быть определено. Пример эксперимента, показывающий экстравазацию наночастиц с течением времени, показан на рисунке 9 при механическом индексе (MI) 0,826. Результаты прижизненной многофотонной микроскопии проясняют пространственную и временную экстравазацию наночастиц при ультразвуковом воздействии, что очень полезно для полного понимания механизмов, лежащих в основе ультразвуковой опосредованной доставки наночастиц, и для оптимизации таких технологий26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение микропузырька с оболочкой флуоресцентно меченых полимерных наночастиц в денатурированном казеине. Микропузырьки обычно имеют диаметр от 1 мкм до 10 мкм. Наночастицы имеют диаметр в основном от 100 нм до 200 нм38. Аббревиатура: C3F8 = газ перфторпропан. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематический обзор, показывающий соответствующие шкалы времени и длины для ярко-полевой, флуоресцентной, конфокальной и прижизненной микроскопии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Рисунок 3: Схематическое представление экспериментов с микроскопией яркого поля. (A) Экспериментальная установка, (B) временная диаграмма и (C) типичный записанный кадр. Шкала в (C) = 10 мкм. Аббревиатура: fps = кадров в секунду. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Рисунок 4: Схематическое изображение экспериментов флуоресцентной микроскопии. (A) Экспериментальная установка, (B) временная диаграмма и (C) типичный записанный кадр. Шкала в (C) = 10 мкм. Аббревиатура: fps = кадров в секунду. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Рисунок 5: Схематическое изображение экспериментов по прижизненной микроскопии. (А) Экспериментальная установка, (Б) временная диаграмма и (В) типичный записанный кадр. Шкала в (C) = 50 мкм. Зеленый соответствует декстран-ФИТК, а красный – наночастицам. Аббревиатура: GaAsP = арсенид галлия фосфид. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Рисунок 6: 3D-структура одного микропузырька, стабилизированного наночастицами и белками. (A) Использование конфокальной микроскопии для отображения наночастиц и (B) использование сканирующего электронного микроскопа для отображения 3D-структуры. (B) был воспроизведен с разрешения от34. Шкала в (A) = 5 мкм; шкала в (B) = 2 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Рисунок 7: Типичные сферические колебания микропузырьков радиусом 2,89 мкм, стабилизированные наночастицами и белками, озвученные на ультразвуковой частоте 1 МГц и амплитуде акустического давления 142 кПа (A-D) Изображения из высокоскоростной записи и соответствующей кривой радиуса пузырька во времени (дно). Шкала = 5 мкм, а красная линия указывает на начальный радиус. Профиль освещения (произвольные единицы) обозначается желтым цветом. Увеличение 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Рисунок 8: Последовательность изображений из высокоскоростной флуоресцентной микроскопии. (A) Успешная доставка флуоресцентно меченых наночастиц стабилизированного наночастицами и белками микропузырька, озвученного на ультразвуковой частоте 2 МГц и амплитуде акустического давления 600 кПа. (B) Неудачная доставка флуоресцентно меченых наночастиц стабилизированного наночастицами и белками микропузырька, инсонифицированного на ультразвуковой частоте 2 МГц и амплитуде акустического давления 210 кПа. Шкала стержней = 10 мкм. Увеличение 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Рисунок 9: Прижизненная микроскопия после инсонации стабилизированных наночастицами и белками микропузырьков на частоте ультразвука 1 МГц и амплитуде акустического давления 800 кПа. (А) Наночастицы внутри сосуда и (В) последовательность изображений области, обозначенной белым пунктирным квадратом в (А), изображающая экстравазацию декстрана (зеленый) и наночастиц (красный). Шкала стержней = 50 мкм. Увеличение 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Представленные протоколы могут быть использованы для характеристики реакции флуоресцентно меченых микропузырьков, предназначенных для применения в ультразвуковой доставке лекарств, включая их механизмы активации, а также их биоэффекты. В этой статье рассматривается ряд методов микроскопии in vitro и in vivo , выполняемых для захвата соответствующей длины и временных масштабов.

Многовременные методы микроскопии для характеристики флуоресцентно меченых микропузырьков для ультразвукового высвобождения лекарственных средств

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Этот протокол может быть использован для характеристики реакции флуоресцентно меченых микропузырьков, которые предназначены для ультразвуковых приложений доставки лекарств, которые включают механизмы активации и биоэффекты. Ключ заключается в сочетании методов визуализации, которые позволяют нам разгадать многомасштабную проблему ультразвуковой доставки лекарств с пузырьками, как в разных пространственных масштабах, так и в разных временных масштабах. Для однопузырьковой визуализации с помощью микроскопии Brightfield поместите вентиляционную иглу 19 калибра и используйте один миллилитровый шприц, оснащенный иглой 19 калибра, чтобы удалить небольшое количество микропузырчатой суспензии из стеклянного флакона в небольшую трубку для облегчения пипетки на следующем этапе.Используя пипетку, разбавьте микропузырьковый раствор в фильтрованном фосфатном буферном физиологическом растворе. Используйте 10-миллилитровый шприц для введения образца в одно выходное отверстие держателя образца до тех пор, пока держатель не заполнится без создания пузырьков воздуха, впрыскивая больше образца, если это необходимо. Закройте оба клапана держателя образца и поместите держатель образца перпендикулярно оптической оси микроскопа.Перед анализом образца установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и, начиная с поля зрения в одном углу держателя образца, используйте ступень XYZ для перемещения держателя, чтобы найти отдельные микропузырьки в поле зрения микроскопа, затем присоедините оптическое волокно, подключенное к водяной бане, к стробоскопическому свету и начните запись. Повторите визуализацию столько раз, сколько необходимо для каждой настройки ультразвука, перемещая держатель образца по крайней мере на два миллиметра в поле зрения, содержащее микропузырьки без звука для каждого анализа. Для флуоресцентной микроскопической визуализации микропузырьков, после разбавления микропузырька в фосфатно-буферном физиологическом растворе, как показано, установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и установите триггерную задержку для лазера на генераторе задержки импульсов для флуоресцентного возбуждения наночастиц из микропузырьков, затем используйте стадию XYZ для перемещения держателя образца для обнаружения одиночных микропузырьков и приведения их в фокус цель, затем запустите запись.Повторите визуализацию по своему усмотрению, изменив настройки ультразвука и переместив держатель образца в новое поле зрения, как показано на рисунке. Для визуализации с помощью прижизненной микроскопии сначала поместите нагретый держатель животного на ступень позиционирования XY между волноводом и объективом и добавьте соединительный гель к волноводу. Вставьте катетер хвостовой вены в хвостовую вену анестезируемой опухоленосной мыши и поместите мышь, оснащенную оконной камерой, в нагретый держатель.Добавьте каплю воды в крышку. Чтобы визуализировать сосудистую ткань опухоли, внутривенно вводят 30 микролитров по четыре миллиграмма на миллилитр флуоресцентно меченого 2 мегадальтонного декстрана в катетер хвостовой вены и используют стадию трансляции XY для перемещения мыши до тех пор, пока не будет найдено поле зрения с подходящими кровеносными сосудами. Отрегулируйте частоту кадров, поле зрения и длину записи в соответствии с параметрами эксперимента и запишите базовые изображения сосудов.После получения исходных изображений установите частоту ультразвукового привода, длину импульса и амплитуду акустического давления на генераторе сигналов произвольной формы и внутривенно введите 50 микролитров микропузырькового образца в хвостовую вену. Затем изобразите сосудистую систему, как показано. Анализ микропузырьков конфокальной флуоресцентной микроскопией выявляет неравномерное распределение частиц микропузырьковой оболочки.Общая структура микропузырьков может быть дополнительно визуализирована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Анализ радиальной динамики и феноменологического поведения инсонифицированного микропузырька методом микроскопии Брайтфилда позволяет оценить относительное изменение радиуса микропузырька с течением времени. Здесь показана последовательность изображений типичной успешной доставки флуоресцентно меченых наночастиц.Можно наблюдать, как наночастицы, встроенные в микропузырьковую оболочку, флуоресцируют, когда лазерный свет достигает пузыря. Однако, как наблюдалось в этой неудачной доставке, флуоресцентные наночастицы светятся на оболочке микропузырька, которая остается неповрежденной во время ультразвукового воздействия. Прижизненная многофотонная визуализация может быть использована для определения пространственной и временной экстравазации наночастиц во время ультразвукового воздействия, что может быть полезно для понимания и оптимизации механизмов, лежащих в основе доставки наночастиц, опосредованных ультразвуком.Благодаря идеальному выравниванию оптических и акустических путей на всех протяженностях и во всех временных масштабах обеспечивается всестороннее понимание доставки лекарств, вызванных ультразвуком. Ответы, полученные в результате наших многомасштабных экспериментов, теперь будут переведены в клиническую практику. Результаты предоставят ценную информацию для целого ряда терапевтических применений, включая терапию рака.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Синтез, монтаж, и характеристика монослоя охраняемые пленок золота наночастицы для Белки электрохимии монослоя

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Методы Характеризуя совместного развития биопленки и Хабитат неоднородности

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Переменное магнитное поле-Отзывчивый Hybrid желатиновых микрогелей для дозирования лекарственных препаратов

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Методы самостоятельной интеграции Megamolecular биополимеров на сушильный воздух-LC интерфейс

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Всеобъемлющая оценка эффективности и безопасности препарата плаценты целевой доставки с помощью трех взаимодополняющих методов

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...