Name: multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.

Olika optiska mikroskopimetoder kombinerades för att få information om de olika stegen i leveransen av nanopartiklar från ytan av mikrobubblor till det omgivande mediet. Imaging av bubbla svängningar utfördes, liksom imaging av frisättningen av nanopartiklarna från bubbla skal, extravasation och penetration genom extracellular matrisen av tumörer in vivo. In vitro-avbildning möjliggör screening av många ultraljudsparametrar jämfört med de mer komplexa in vivo-installationerna . Fördelen med att kombinera detta utbud av bildframställning modaliteter är den kompletterande information som kan erhållas på olika tidsskalor - en funktion som är avgörande för att karakterisera och optimera mikrobubblorna för framgångsrik leverans och för att erhålla terapeutisk effekt. Detta tillvägagångssätt är användbart för att förstå leveransmekanismerna för alla mikrobubblor, inklusive konstruktioner med fluorescerande märkta nanopartiklar och droger.
De mest kritiska stegen i mikroskopimetoderna som används för att studera enskilda mikrobubblor är följande. För fluorescensmikroskopi bör nanopartiklarna märkas fluorescerande för att möjliggöra visualisering av partikelutsläppet. Dessutom bör provlösningen spädas ut tillräckligt för att isolera enstaka mikrobubblor för analys i konfokala, ljusa fält och fluorescensmikroskopimetoder. Dessutom är det viktigt att välja en ultraljudskörningsfrekvens och akustiskt tryck för att excitera bubblorna mest effektivt, nämligen vid deras resonans. Om forskningsfrågan gäller leverans av nanopartikel nyttolasten, bör lämpliga ultraljudsparametrar vara en del av undersökningen. Förutom resonans bör dessa bubblor också drivas vid eller över tröskelvärdet för nanopartikelfrisättning, vanligtvis vid relativt höga akustiska tryckamplituder (MI > 0,3)51. För ljusfältsmikroskopiavbildning är det viktigt att välja en höghastighetskamera med en tillräckligt hög bildhastighet för att minimera rörelseoskärpa och undvika aliasing.
Ljusfältsmikroskopi begränsas huvudsakligen av bildbildsbildsbildhastigheten och intensiteten hos tillgängliga ljuskällor, eftersom en högre framerate skulle ge en mer detaljerad tidsupplöst inblick i bubbeldynamiken, men kräver mer intensiv belysning på grund av kortare exponeringstider. För att studera partikelutsläpp mer i detalj kan ramhastigheten för fluorescensavbildning i princip ökas genom att öka laserljusets intensitet. Absorptionen av det högintensiva laserljuset av de fluorescerande märkta mikrobubblorna genererar dock värme, även med färgämnen med hög kvantutbyte. Denna värme kan störa de experiment som står på spel, och i extrema fall inducera foto-termisk kavitation52. Således finns det i praktiken en gräns för den applicerade laserfluensen. Men intensiv laserbelysning kan också avsiktligt användas för att inducera partikelutsläpp från liposomer53. Temperaturen påverkar bubbeldynamik och ultraljudsrespons, beroende på bubbeltyp54. Om in vitro- och intravitala metoder ska jämföras objektivt bör därför de in vitro-metoder som diskuteras i protokollet utföras vid 37 °C. En annan begränsning av de in vitro-metoder som diskuteras i det aktuella papperet är att bubblorna inte är i en frifältsmiljö, eftersom mikrobubblor kommer att flyta under provhållarmembranet. Dessutom finns det en urvalsförskjutning när du avbildar enstaka mikrobubblor. Att utföra upprepade experiment på enskilda bubblor gör det dock möjligt att undersöka effekten av storlek och avlägsnande av den förvirrande faktorn - storleksfördelningen. Om bubbelresponsen som en funktion av storlek kan förstås medan koncentrationen inte är för hög för att förhindra bubbelbubblainteraktioner, kan svaret från någon godtycklig bubbelpopulation beräknas. Slutligen ger både ljusfälts- och fluorescensmikroskopimetoder insikt i mikrobubblor invecklade i en tvådimensionell (2D) bild. Om forskningsfrågan kräver mer än 2D-avbildning kan bubblornas 3D-beteende lösas genom att kombinera installationen som beskrivs i protokollet med en sidovyinställning för multiplansavbildning55.
En alternativ metod för att studera mikrobubblor är akustisk karakterisering56. Att mäta ekot från en enda mikrobubble kräver dock att man lokaliserar och isolerar en enda mikrobubble i ultraljudsstrålen56, vilket utgör en utmaning som vanligtvis hanteras genom användning av ett smalt rör eller optiska eller akustiska pincett57,58. För att storleksanpassa bubblor akustiskt kan mikrobubblorna insonifieras i den geometriska spridningsregimen vid frekvenser som är mycket högre än deras resonansfrekvens, vilket inte inducerar volymetriska mikrobubble svängningar59. Användningen av en "akustisk kamera" är en sådan metod för att avbilda den radiella dynamiken hos enstaka mikrobubblor som svar på ultraljud, där en högfrekvent ultraljudssond används för att bestämma bubblans radiella svar på en lågfrekvent körvåg60. Nackdelen med denna metod är att den endast kan användas för att bestämma den relativa förändringen av mikrobubbleradien. Därför behövs en annan metod för att bestämma den absoluta bubbelradien, t.ex. genom optisk avbildning61,62. Nackdelen med metoder där mikrobubblor utsätts för ultraljud vid frekvenser högre än deras resonansfrekvens är att vid så höga frekvenser minskar penetrationsdjupet59, vilket begränsar användbarheten för in vivo-applikationer. Andra former av mikroskopi kan också användas för att studera mikrobubblor som scanningelektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi63. Den uppnåeliga spatio-temporal upplösningen av dessa alternativa mikroskopi tekniker är dock i allmänhet mer begränsad, och dessa tekniker har nackdelen att imaging utförs antingen före eller efter ultraljud exponering genom off-line analys och vanligtvis presenterar en låg genomströmning63. Ett annat alternativ är att använda en ljusspridningsmetod, som kan användas för att studera radiell dynamik hos enskilda mikrobubblor i realtid, men har ett lågt signal-brusförhållande jämfört med akustiska spridningsmetoder64.
Intravital mikroskopi i realtid under ultraljudsexponering är en kraftfull metod för att få ny insikt om vaskulaturen, beteendet hos mikrobubblor, nanopartiklar eller andra molekyler (såsom dextran i detta fall) under ultraljudsexponering. En allmän begränsning när man utför intravital mikroskopi i realtid är att endast ett litet område av vävnaden avbildas, och ljusets penetrationsdjup i vävnaden är begränsat. Om de avbildade kärlen innehåller mycket få mikrobubblor och/eller nanopartiklar inom synfältet kan lite eller ingen information om nanopartiklarnas beteende och extravasation erhållas. Dessutom, på grund av det begränsade synfältet, är en korrekt justering mellan ljus- och ultraljudsvägarna avgörande. Om ultraljudstrycket är tillräckligt högt för att inducera bubbeldestruktion är det också viktigt att välja en pulsrepetitionsfrekvens som gör att färska bubblor kan reperfusera in i synfältet mellan ultraljudspulser. Dessutom, eftersom ultraljudet kommer att reflekteras från täckglaset i fönsterkammaren och målet, är det viktigt att placera givaren i en vinkel för att minska reflektioner för att förhindra bildandet av stående vågor, vilket förvränger det kalibrerade tryckfältet. En annan praktisk fråga är att installationen måste ha tillräckligt med utrymme för att montera ultraljudsgivaren och vågledaren över eller under målet i mikroskopinställningen. Tumörerna i dorsala fönsterkammaren kommer att ha en begränsad tjocklek på grund av den begränsande kammaren och täckslipen; Om det behövs kan dock andra modeller användas. Exempel är hudveckstumörer, till exempel i bröstfett pad65 eller buken intravital avbildning av tumörer i de olika organen66. Sådana tumörer kan odlas orthotopically i lämplig mikromiljön, och som sådan, presentera ett mer kliniskt relevant fall.
De metoder som beskrivs i detta arbete upplysa potentialen hos fluorescerande märkta mikrobubblor att studera grunderna för läkemedelsleveransapplikationer med hjälp av bubblor och ultraljud. Denna kombination av mikroskopi metoder ger värdefull inblick i microbubble svar på ultraljud insonation och dess tillhörande akustiska parameter utrymme och presenterar en tydlig bild av microbubble och nyttolast beteende över ett relevant intervall av tid och längd skalor.

Ultraljud är den mest använda medicinska bildtekniken. Det är icke-invasivt, snabbt, säkert, kostnadseffektivt och bärbart1,2,3. Blod är dock en dålig ultraljudsspridare, och kontrasten i blodpoolen kan förbättras genom en intravenös injektion av ultraljud kontrastmedel3. Denna förbättrade blodpoolkontrast möjliggör kvantifiering av organperfusion för diagnostiska ändamål, t.ex. vid påvisande av kranskärlssjukdom4 och metastaserad leversjukdom5. Tumör vaskulatur visade sig vara en viktig prognostisk faktor6. En stor forskningsinsats riktas nu mot mikrobubble-assisterade, riktade molekylära avbildningar och skräddning av kontrastmedel för terapeutisk användning.
Kommersiellt tillgängliga ultraljud kontrastmedel består vanligtvis av en suspension av belagda mikrobubblor7,8 med diametrar som sträcker sig från 1 μm till 10 μm9. Eftersom ultraljud kontrastmedel mikrobubblor är något mindre än röda blodkroppar7, kan mikrobubblorna säkert nå även de minsta kapillärerna utan att skapa en ocklusion3. Microbubbles har en dramatiskt ökad ultraljud backscattering koefficient jämfört med vävnad10, på grund av deras komprimerbara gas core11. Dessutom är mikrobubbleekoet mycket ickelinjärt, dvs. Dessutom är ekostyrkan starkt beroende av den resonanta reaktionen från bubblan12. Medan vävnaden endast sprider sig linjärt, är ett litet antal mikrobubblor tillräckliga för att uppnå en hög detektionskänslighet vid harmonisk avbildning13,14. Denna icke-linjära kontrastgenerering kan till och med vara tillräckligt stark för att spåra enstaka bubblor i kroppen15.
Skalet av ultraljud kontrastmedel stabiliserar bubblorna mot upplösning och coalescence, vilket ökar deras cirkulationstid i blodpoolen16. Skalet kan bestå av lipider, polymerer eller denaturerade proteiner3,8. Det minskar den interfacial spänningen, vilket begränsar effekten av Laplace tryckdriven upplösning17 och skapar en resistiv barriär mot gasspridning18. För att ytterligare öka stabiliteten fylls kontrastmikrobubblorna vanligtvis med en gas med hög molekylvikt med låg löslighet i blod11. Microbubble skal förändrar dramatiskt svaret av microbubbles till ultraljud insonation11. Obelagda gasbubblor har en karakteristisk resonansfrekvens som är omvänt proportionell mot deras storlek och tillsatsen av en lipidbeläggning ökar resonansfrekvensen med avseende på en obestruken bubbla på grund av skalets inneboende styvhet. Dessutom avleder skalet energi genom dilatationell viskositet, vilket utgör den dominerande källan till dämpning för belagda bubblor3. Stabiliseringsskalet har den extra fördelen att det kan funktionaliseras, t.ex. genom att binda inriktningen på ligands till ytan av mikrobubblor. Denna inriktning möjliggör många tillämpningar för dessa bubblor och i synnerhet molekylär avbildning med ultraljud14,19.
Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Mikrobubblor som oscillerar i inneslutningen av ett blodkärl kan orsaka mikroströming samt lokala normala och skjuvningsspänningar på kapillärväggen3. Vid högt akustiskt tryck kan stora amplitudsvängningar leda till mikrobubble kollaps i en våldsam process som kallas inertiell kavitation, vilket i sin tur kan leda till bristning eller invagination av blodkärlet20. Dessa våldsamma fenomen kan inducera bioeffects såsom sonopermeation21, förbättra extravasation av terapeutiska läkemedel i interstitium över endotelväggen, antingen paracellulärt eller transcellularly. det kan också förbättra penetrationen av terapeutiska medel genom den extracellulära matrisen av stroma-rika tumörer21,22 och biofilmer23,24, även om denna mekanism fortfarande är dåligt förstådd26.
Ultraljudsmedierad läkemedelsleverans har visat lovande resultat både prekliniskt27,28 och i kliniska prövningar22. Dessutom, när de används med relativt lågfrekvent ultraljud (~ 1 MHz), mikrobubblor har rapporterats för att lokalt och tillfälligt öka blod - hjärnbarriären permeabilitet, vilket gör det möjligt för läkemedel att komma in i hjärnan parenkym, både i prekliniska och kliniska studier29,30,31,32,33,34.
Det finns i allmänhet två metoder för ultraljudsmedierad läkemedelsleverans: det terapeutiska materialet kan administreras tillsammans med bubblorna, eller det kan fästas vid eller laddas i bubbelskalet28,35,36. Det andra tillvägagångssättet har visat sig vara mer effektivt när det gäller läkemedelsleverans37. Mikrobubblor kan laddas med läkemedel eller genetiskt material inkapslat i nanopartiklar (liposomer eller polymera nanokonstruktioner) som fästs på skalet eller införlivas direkt i mikrobubbleskalet35,36. Nanopartikelbelastade mikrobubblor kan aktiveras med (fokuserad) ultraljud för att lokalt frigöra nanopartikelns nyttolast28,33,38,39,40. Om en sådan mikrobubble är i direkt kontakt med en cell har det visats in vitro att nyttolasten till och med kan deponeras på cellens cytoplasmiska membran i en process som kallas sonoprinting34,35.
Ultraljud parameter utrymme för microbubble insonation är omfattande, och in vivo biologiska villkor ytterligare lägga komplexitet. Således utgör kombinationen av fokuserad ultraljud och nanopartikel-laddade mikrobubblor en utmaning inom området riktade terapier.
Syftet med detta arbete är att tillhandahålla protokoll som kan användas för att i detalj avbilda svaret från mikrobubblor som en funktion av ultraljudsparametrarna och att studera mekanismerna som leder till skalbrott och efterföljande frisättning av det fluorescerande märkta skalmaterialet. Denna uppsättning protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med skal som innehåller ett fluorescerande färgämne. Figur 1 visar en schematisk representation av de polymera nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som utvecklats vid SINTEF (Trondheim, Norge). Dessa bubblor är fyllda med perfluorpropangas (C3F8) och nanopartiklarna som stabiliserar skalet innehåller NR668, som är ett lipofilt derivat av Nile Red fluorescerande färgämne38,43. Nanopartiklarna består av poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) (PEBCA) och är PEGylated. Funktionalisering med polyetylenglykol (PEG) minskar opsonization och fagocytos genom det mononukleära fagocytsystemet, vilket förlänger cirkulationstiden14,44. Som ett resultat ökar PEGylation mängden nanopartiklar som når målplatsen och förbättrar därmed effekten av behandlingen16. Figur 2 illustrerar hur användningen av fyra mikroskopimetoder gör det möjligt för forskare att täcka alla relevanta tids- och längdskalor. Det bör noteras att den rumsliga upplösning som kan uppnås i optisk mikroskopi bestäms av diffraktionsgränsen, som beror på våglängden hos målets och objektbelysningskällans våglängd45. För de system som finns till hands är den optiska upplösningsgränsen vanligtvis 200 nm. Dessutom kan intravital mikroskopi användas för att avbilda på subcellulär nivå46. För de nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som används i detta arbete är den minsta längdskala som är relevant för intravital mikroskopi storleken på små kapillärer (≥10 μm). In vitro höghastighets optisk avbildning (10 miljoner bilder per sekund) och höghastighetsfluorescensavbildning (500 000 bilder per sekund) experiment beskrivs för enstaka mikrobubblor. Höghastighets ljusfältsavbildning vid nanosekunders tidsskalor är lämplig för att studera den tidsupplösta radiella dynamiken hos de vibrerande bubblorna. Höghastighetsfluorescensmikroskopi möjliggör däremot direkt visualisering av frisättningen av de fluorescerande märkta nanopartiklarna. Dessutom kan mikrobubbleskalets struktur undersökas med hjälp av Z-stack tredimensionell (3D) konfokal mikroskopi och scanningelektronmikroskopi (protokollet för den senare ingår inte i det aktuella arbetet). Intravital mikroskopi består i att använda multifoton mikroskopi för att avbilda tumörer som växer i dorsala fönsterkammare för att ge realtidsinformation om lokalt blodflöde och om ödet för fluorescerande märkta nanopartiklar i vivo47. Kombinationen av dessa mikroskopi metoder ger i slutändan detaljerad inblick i beteendet hos terapeutiska microbubble agenter som svar på ultraljud, både in vitro och in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td>
			<td>Tabor Electronics</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 L</td>
			<td>ENI</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 MDa dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33522 A</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE I</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td></td>
			<td>Dimmable AC halogen light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipemazol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon 24 G</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company</td>
			<td></td>
			<td>Tail vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC model 575</td>
			<td>Berkely Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Pulse/delay generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLINIcell 25</td>
			<td>Laboratoires Mabio International</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohlibri</td>
			<td>Lightline</td>
			<td></td>
			<td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Actavis Group HF</td>
			<td></td>
			<td>Anaesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Supplement for cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td></td>
			<td>Used for alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumanezil</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>Antidote to wake animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated animal holder</td>
			<td>Custom design</td>
			<td></td>
			<td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&#176;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyper Vision HPV-X2</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health&#160;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>open source image processing program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo SliceScope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOTON</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Pulsed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Accord Healthcare Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia of mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Strobe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT C305</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&#34;, diameter 1&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panametrics-NDT V304</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&#34;, diameter 1.25&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluoropropane gas</td>
			<td>F2 Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td>
			<td>Gibco Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td>
			<td>IKA laboratory technology</td>
			<td></td>
			<td>Dispersion tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDS 210</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td></td>
			<td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-TLU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tube lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VBA100-200</td>
			<td>Vectawave</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window chambers</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used in window chamber setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>20x water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(Z) translation stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Inkapsling av läkemedel i nanopartiklar minskar systemisk toxicitet och ökar cirkulationstiden för drogerna. I en ny metod för mikrobubble-assisterad läkemedelsleverans, nanopartiklar införlivas i eller på microbubble skal, vilket möjliggör lokal och utlöst frisättning av nanopartikel nyttolasten med ultraljud. En grundlig förståelse av frisättningsmekanismerna inom det stora ultraljudsparameterutrymmet är avgörande för effektiv och kontrollerad frisättning. Denna uppsättning presenterade protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med ett skal som innehåller en fluorescerande etikett. Här ligger fokus på mikrobubblor laddade med poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) polymera nanopartiklar, dopade med ett modifierat Nile Red-färgämne. Partiklarna fixeras i ett denaturerat kaseinskal. Mikrobubblorna produceras genom kraftig omrörning och bildar en spridning av perfluorpropangas i vätskefasen som innehåller kasein och nanopartiklar, varefter mikrobubbleskalet självmonteras. En mängd olika mikroskopitekniker behövs för att karakterisera nanopartikelstabiliserade mikrobubblor vid alla relevanta tidsskalor i nanopartikelfrisättningsprocessen. Fluorescens av nanopartiklarna möjliggör konfokal avbildning av enstaka mikrobubblor, vilket avslöjar partikelfördelningen i skalet. In vitro ultra-höghastighets avbildning med ljusfält mikroskopi vid 10 miljoner bilder per sekund ger insikt i bubbla dynamiken som svar på ultraljuds insonation. Slutligen visualiseras nanopartikelfrisättning från bubbelskalet bäst med hjälp av fluorescensmikroskopi, utförd vid 500 000 bilder per sekund. För att karakterisera läkemedelsleverans in vivo studeras den utlösta frisättningen av nanopartiklar inom vaskulaturen och deras extravasation bortom endotelskiktet med intravital mikroskopi i tumörer implanterade i dorsala hudveck fönsterkammare, över en tidsskala på flera minuter. Kombinationen av dessa kompletterande karakteriseringstekniker ger unik inblick i beteendet hos mikrobubblor och deras nyttolastutgivning på en rad tids- och längdskalor, både in vitro och in vivo.

Mikrobubblorna, som produceras enligt beskrivningen i protokollet, analyserades med hjälp av olika mikroskopimetoder och vid olika tidsskalor.
Nanopartiklarnas fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerar att skalet har en ojämn partikelfördelning. Andra mikroskopimetoder kan användas för bubbelkarakterisering. Figur 6B visar till exempel mikrobubbelns övergripande struktur med hjälp av scanningelektronmikroskopi, som presenteras i tidigare arbete34.
Radiell dynamik och fenomenologiska bubbla beteende kan studeras med hjälp av den beskrivna in vitro ljusfält mikroskopi metoden där mikrobubblor avbildades med 10 miljoner bilder per sekund. Radien av enskilda mikrobubblor extraherades med tiden med hjälp av ett skript skrivet internt. Ett exempel på ett sådant radiellt svar visas i figur 7.
En bildsekvens av typisk lyckad nanopartikelleverans, som beskrivs i avsnitt 2.3.6, visas i figur 8A. Nanopartiklarna som är inbäddade i mikrobubbleskalet kan ses lysa upp på grund av fluorescens när laserljuset når bubblan. Drivna av ultraljudsorsonation lossnar fluorescerande nanopartiklar från mikrobubblornas gaskärna och deponeras på provhållarens membran. Slutligen stängs lasern av och de fluorescerande nanopartiklarna är inte längre upphetsade. Misslyckad leverans av den fluorescerande märkta nyttolasten av mikrobubblorna ser vanligtvis ut som den bildsekvens som visas i figur 8B, där de fluorescerande nanopartiklarna lyser upp på skalet på mikrobubbeln som förblir intakt under ultraljudsexponering.
Realtid intravital multifoton mikroskopi under ultraljud användes för att undersöka effekterna av ultraljud och mikrobubblor på nanopartiklar beteende i blodet, förbättring av permeabiliteten av tumör blodkärl och förbättring av leveransen av nanopartiklar. Omfattningen och kinetiken av penetration i den extracellulära matrisen som en funktion av akustiskt tryck, frekvens och pulslängder kan karakteriseras. Effekten av ultraljudsbehandlingen kan variera med avseende på kärlens storlek och morfologi och den resulterande inneslutningen av bubblan. Hur ultraljudsbehandlingen påverkar blodflödet och riktningen kan bestämmas. Ett exempelexperiment som visar extravasation av nanopartiklar över tid visas i figur 9 vid ett mekaniskt index (MI) på 0,826. Resultaten av intravital multifoton mikroskopi belyser rumsliga och tidsmässiga extravasation av nanopartiklar under ultraljud exponering, vilket är mycket fördelaktigt för fullständig förståelse av mekanismerna bakom ultraljud-medierad leverans av nanopartiklar och att optimera sådan teknik26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av en mikrobubbel med ett skal av fluorescerande märkta polymera nanopartiklar i denaturerade kasein. Mikrobubblorna är vanligtvis mellan 1 μm och 10 μm i diameter. Nanopartiklarna har en diameter mestadels mellan 100 nm och 200 nm38. Förkortning: C3F8 = perfluorpropangas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Bild 2: Schematisk översikt som visar relevanta tids- och längdskalor för ljusfält, fluorescens, konfokal och intravital mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Bild 3: Schematisk representation av experiment med ljusfältsmikroskopi. (A) Experimentell installation, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad bildruta. Skalstång i (C) = 10 μm. Förkortning: fps = bildrutor per sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figur 4: Schematisk framställning av fluorescensmikroskopiexperiment. (A) Experimentell inställning, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad ram. Skalstång i (C) = 10 μm. Förkortning: fps = bildrutor per sekund. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Bild 5: Schematisk representation av intravitala mikroskopiexperiment. (A) Experimentell installation, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad ram. Skalstång i (C) = 50 μm. Grönt motsvarar dextran-FITC och rött till nanopartiklar. Förkortning: GaAsP = galliumarsenidfosfid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Bild 6: 3D-struktur hos en enda nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel. B) har reproducerats med tillstånd från34. Skalstång i (A) = 5 μm; skalstång i (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figur 7: Typiska sfäriska svängningar av en 2,89 μm radie nanopartikel-och-protein-stabiliserad mikrobubble insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 1 MHz och en akustisk tryckamplitud på 142 kPa. (A-D) Bilder från höghastighetsregistreringen och motsvarande bubbelradie över tidskurvan (nederkant). Skalningsstaplar = 5 μm och den röda linjen anger den ursprungliga radien. Belysningsprofilen (godtyckliga enheter) indikeras med gult. Förstoringen är 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Bild 8: Bildsekvens från höghastighetsfluorescensmikroskopi. (A) Lyckad leverans av fluorescerande märkta nanopartiklar av en nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel som är insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 2 MHz och en akustisk tryckamplitud på 600 kPa. (B) Misslyckad leverans av fluorescerande märkta nanopartiklar av en nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel som är insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 2 MHz och en akustisk tryckamplitud på 210 kPa. Skalstänger = 10 μm. Förstoringen är 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figur 9: Intravital mikroskopi efter insonation av nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor med en ultraljudsfrekvens på 1 MHz och en akustisk tryckamplitud på 800 kPa. (A) Nanopartiklar i kärlet, och (B) en bildsekvens av det område som indikeras av den vita streckade kvadraten i (A) som visar extravasationen av dexppartiklar (grön) och nanopartiklar (röd). Skalstänger = 50 μm. Förstoringen är 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release at JoVE.com

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

De presenterade protokollen kan användas för att karakterisera svaret av fluorescerande märkta mikrobubblor utformade för ultraljud-utlösta läkemedelsleveransapplikationer, inklusive deras aktiveringsmekanismer samt deras bioeffects. Detta dokument täcker en rad in vitro- och in vivo-mikroskopitekniker som utförs för att fånga relevanta längd- och tidsskalor.

Multi-timescale Mikroskopimetoder för karakterisering av fluorescerande märkta mikrobubblor för ultraljud-utlöst läkemedelsfrisättning

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Detta protokoll kan användas för att karakterisera svaret från fluorescerande märkta mikrobubblor som är utformade för ultraljudsutlösta läkemedelsleveransapplikationer som inkluderar aktiveringsmekanismer och bioeffektiva. Nyckeln ligger i kombinationen av bildteknik som gör att vi kan lösa upp det flerskaliga problemet med ultraljudsutlöst läkemedelsleverans med bubblor, både på olika rumsliga skalor och vid olika tidsskalor. För enbubbla avbildning av Brightfield-mikroskopi, placera en 19 gauge venting nål och använd en en milliliter spruta utrustad med en 19 gauge nål för att ta bort en liten mängd av mikrobubble suspensionen från glasflaskan i ett litet rör för enklare pipettering i nästa steg.Späd mikrobubblelösningen med hjälp av en pipetter i filtrerad fosfatbuffrad saltlösning. Använd en 10 ml spruta för att injicera provet i ett utlopp på provhållaren tills hållaren är full utan att skapa luftbubblor och injicera mer av provet om det behövs. Stäng provhållarens båda ventiler och placera provhållaren vinkelrätt mot mikroskopets optiska axel.Innan provanalysen, ställ in önskad ultraljudsfrekvens och akustiskt tryck på den godtyckliga vågformsgeneratorn och börja med synfältet i ett hörn av provhållaren, använd XYZ-scenen för att flytta hållaren för att lokalisera enskilda mikrobubblor i mikroskopets synfält, fäst sedan en optisk fiber ansluten till ett vattenbad till ett stroboskopljus och starta inspelningen. Upprepa avbildningen så många gånger som önskas per ultraljudsinställning och flytta provhållaren minst två millimeter till ett synfält som innehåller okoniska mikrobubblor för varje analys. För fluorescens mikroskopisk avbildning av mikrobubblorna, efter utspädd mikrobubblelösningen i fosfatbuffrad saltlösning som visats, ställ in önskad ultraljudsfrekvens och akustiskt tryck på den godtyckliga vågformsgeneratorn och ställ in utlösarfördröjningen för lasern på pulsfördröjningsgeneratorn för fluorescens excitation av nanopartiklarna från mikrobubblorna, använd sedan XYZ-scenen för att flytta provhållaren för att lokalisera enskilda mikrobubblor och sätta dem i fokus för mikrobubblorna. målet och sedan utlösa inspelningen.Upprepa bilden efter önskemål genom att ändra ultraljudsinställningarna och flytta provhållaren till det nya synfältet enligt vad som visas. För avbildning genom intravital mikroskopi, placera först en uppvärmd djurhållare på XY-positioneringssteget mellan vågledaren och målet och tillsätt kopplingsgel till vågledaren. För in en svansvenerkateter i svansvenen på en sövd tumörbärande mus och placera musen med en fönsterkammare i den uppvärmda hållaren.Tillsätt en vattendroppe till täckslipet. För att visualisera tumör vävnad vaskulatur, intravenöst injicera 30 mikroliter av fyra milligram per milliliter fluorescerande märkt 2 megadalton dextran i svansven kateter och använda XY översättningssteg för att flytta musen tills ett synfält med lämpliga blodkärl kan lokaliseras. Justera bildhastigheten, synfältet och längden på inspelningen enligt parametrarna för experimentet och registrera originalbilderna för fartygen.När baslinjebilderna har förvärvats, ställ in ultraljud körfrekvens, pulslängd och akustisk tryck amplitud på den godtyckliga vågform generatorn och intravenöst injicera 50 mikroliter av microbubble prov i svansvenen. Föreställ dig sedan vaskulaturen som visats. Analys av mikrobubblor av confocal fluorescence mikroskopi avslöjar en icke-enhetlig partikelfördelning av microbubble skal.Mikrobubblornas övergripande struktur kan visualiseras ytterligare genom att skanna elektronmikroskopi. Analys av den radiella dynamiken och fenomenologiska beteendet hos insonifierad mikrobubble av Brightfield mikroskopi möjliggör värdering av den relativa förändringen i mikrobubble radien över tiden. Här visas en bildsekvens av en typisk lyckad leverans av fluorescerande märkta nanopartiklar.Nanopartiklarna som är inbäddade i mikrobubbleskalet kan observeras för att fluorescera när laserljuset når bubblan. Som observerats i denna misslyckade leverans, dock, de fluorescerande nanopartiklarna ljus på skalet av microbubble, som förblir intakt under ultraljud exponering. Intravital multi-foton imaging kan användas för att bestämma rumsliga och tidsmässiga extravasation av nanopartiklarna under ultraljud exponering, vilket kan vara fördelaktigt för att förstå och optimera mekanismerna bakom ultraljud-medierad nanopartikel leverans.Med den perfekta inriktningen av de optiska och akustiska vägarna på alla längd- och tidsskalor, ges en omfattande inblick i ultraljud-utlöst läkemedelsleverans. Svaren från våra storskaliga experiment kommer nu att översättas till klinisk praxis. Resultaten kommer att ge värdefull insikt för en rad terapeutiska tillämpningar, inklusive cancerbehandling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Syntes, församling, och karakterisering av monolager skyddade guld nanopartiklar Films för protein monolager Elektrokemi

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder för att karakterisera Co-utveckling Biofilm och Habitat Heterogen

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Alternerande magnetfält-Responsive Hybrid Gelatin Mikrogeler för kontrollerad läkemedelsdosering

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Metoder för själv integrationen av Megamolecular Biopolymerer på torkluft LC-gränssnitt

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatiserad bild Scanning och segmentering i Fluorescently-märkt vävnader Widefield High-innehåll analyssystem med

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattande utvärdering av effektiviteten och säkerheten av Placenta-Targeted Drug Delivery med tre kompletterande metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes och det inre membranet i Bacillus subtilis sporer

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...