Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).

1. Cellekultur
<ol><li>Suppler højglukose Dulbeccos modificerede Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin og 1% glutamintilskud som kulturmedie til A549-celler.</li>
	<li>Kultur A549-celler i en CO2-inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2
</li>
	<li>Dissociere celler til subkultur ved hjælp af trypsin ved ca. 80% sammenløb.<ol>
<li>Brug 3 ml trypsin til behandling af cellerne i T75-kulturkolben ...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

Protokollen beskrevet her giver instruktioner til fremstilling af multityper af hydrogelmikrobærere og efterfølgende cellesåning. Sammenlignet med mikrofluidiske chip- og inkjetudskrivningsmetoder giver AVIFJ's tilgang til konstruktion af mikrobærere større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uafhængig dyse gør det muligt at anvende en bred vifte af letvægtsdyser, herunder mikropipetter af glas, i disse tryksystemer. Den meget kontrollerbare behandling gør det muligt frit at justere parametre, herunder reserv...

Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal og anvendes almindeligvis til storstilet dyrkning af celler1,2. Deres ydre overflade giver rigelige vækststeder for celler, og interiøret giver en støttestruktur til rumlig spredning. Den sfæriske struktur giver også bekvemmelighed ved overvågning og kontrol af parametre, herunder pH, O2 og koncentration af næringsstoffer og metabolitter. Når mikrobærere anvendes i kombination med omrørte tankbioreaktorer, kan de opnå højere celletætheder i et relativt lille volumen sammenlignet med konventionelle kulturer og derved give en omkostningseffektiv måde at opnå store kulturer på3. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning, og der er gjort store fremskridt inden for storstilet udvidelse af stamceller, hepatocytter, chondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist sig at være ideelle lægemiddelleveringskøretøjer og bottom-up-enheder og påtager sig derfor en stadig vigtigere rolle i klinisk lægemiddelscreening og reparation af in vitro-vævsteknik5.
For at opfylde mekaniske egenskabskrav i forskellige scenarier er der udviklet flere typer hydrogelmaterialer til brug ved konstruktion af mikrobærere6,7,8,9,10,11. Hydrogeler af alginat og hyaluronsyre (HA) er to af de mest anvendte mikrobærermaterialer på grund af deres gode biokompatibilitet og tværbindbarhed12,13. Alginat kan let krydsbindes af calciumchlorid, og dets mekaniske egenskaber kan moduleres ved at ændre tværbindingstiden. Tyraminkonjugeret HA er tværbundet ved den oxidative kobling af tyraminmoieties katalyseret af hydrogenperoxid og peberrodsperoxidase14. Kollagen bruges på grund af sin unikke spiralstruktur og tværbundne fibernetværk ofte som en adjuvans til at blande sig i mikrobærerne for yderligere at fremme cellefastgørelse15,16.
Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere inkluderer mikrofluidiske chips, inkjetudskrivning og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist sig at være hurtige og effektive til at producere mikrobærere i ensartet størrelse24. Denne teknologi er imidlertid afhængig af et komplekst flowkanaldesign og fremstillingsproces25. Høj temperatur eller overdreven ekstruderingskræfter under inkjetudskrivning samt intense elektriske felter i elektrospray-tilgangen kan påvirke materialets egenskaber negativt, især dets biologiske aktivitet19. Desuden resulterer de tilpassede dyser, der anvendes i disse metoder, når de anvendes på forskellige biomaterialer og diametre, i begrænset behandlingskompleksitet, høje omkostninger og lav fleksibilitet.
For at tilvejebringe en bekvem metode til mikrobærerforberedelse er en 3D-udskrivningsteknik kaldet vekslende viskøse inertielle kræfter jetting (AVIFJ) blevet anvendt til at konstruere hydrogelmikrobærere. Teknikken udnytter nedadgående drivkræfter og statisk tryk, der genereres under lodret vibration, til at overvinde dysespidsens overfladespænding og dermed danne dråber. I stedet for alvorlige kræfter og termiske forhold virker små hurtige forskydninger direkte på dysen under udskrivning, hvilket forårsager en mindre effekt på bioblækets fysisk-kemiske egenskaber og præsenterer stor tiltrækning for bioaktive materialer. Ved hjælp af AVIFJ-metoden blev mikrobærere af flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm dannet med succes. Desuden blev mikrobærerne yderligere bevist at binde celler godt og give et passende vækstmiljø for klæbede celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal, som almindeligvis anvendes som bærere til store cellekulturer. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning og anvendes almindeligvis inden for celleudvidelse i stor skala. Mikrobærere har også vist sig at spille en stadig vigtigere rolle i in vitro-vævsteknisk konstruktion og screening af kliniske lægemidler. Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere omfatter mikrofluidiske chips og inkjetudskrivning, som ofte er afhængige af komplekst flowkanaldesign, en inkompatibel tofaset grænseflade og en fast dyseform. Disse metoder står over for udfordringerne ved kompleks dysebehandling, ubelejlige dyseændringer og overdrevne ekstruderingskræfter, når de påføres flere bioblæk. I denne undersøgelse blev en 3D-udskrivningsteknik, kaldet vekslende viskøs-inertial kraftstråle, anvendt til at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere med en diameter på 100-300 μm. Celler blev efterfølgende podet på mikrobærere for at danne vævstekniske moduler. Sammenlignet med eksisterende metoder tilbyder denne metode en fri dysespidsdiameter, fleksibel dyseskift, fri kontrol over udskrivningsparametre og milde udskrivningsforhold for en lang række bioaktive materialer.

Skrivehoveder med varierende konvergenshastigheder og diametre blev fremstillet for at opnå udskrivning af flere typer materialer. Dyserne opnået med stigende trækstyrke er vist i figur 1B. Dyserne blev opdelt i tre områder: reservoir (III), sammentrækning (II) og skrivehoved (I). Reservoiret var den uforarbejdede del af dysen, hvor væsken leverede statisk tryk og bioblækindgang til udskrivning. Sammentrækningsområdet var hoveddelen til at generere nedadgående drivkræfter. Trækst...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Præsenteret her er en mild 3D-udskrivningsteknik drevet af vekslende viskøse inertikræfter for at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere. Hjemmelavede dyser giver fleksibilitet, hvilket gør det nemt at udskifte forskellige materialer og diametre. Cellebindende mikrobærere med en diameter på 50-500 μm kan opnås og opsamles til yderligere dyrkning.

3D-udskrivning af in vitro hydrogelmikrobærere ved vekslende viskøs inertial kraftstråle

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Vi tilbyder en mild bioprintet proces til fremstilling af mikrobærere med en god styrbarhed og biokompatibilitet. Efter indkapsling af celler kan bærerne også anvendes i in vitro-celleudvidelse og funktionel mikrovævskonstruktion. Begrænset forskydning snarere end alvorlige kræfter under lignende forhold virker på dysen under trykprocessen og opretholder bioblækkets oprindelige fysiske/kemiske egenskaber i det maksimale omfang.Ud over konventionelle mikrobærere kan enheder med intern cellefordeling eller tritosinindkapslede kapselstrukturer konstrueres og påføres til samling af forskellige vævsstrukturer. Til dyseforberedelsen skal du lægge glasmikropipetter på aftrækkeren i henhold til producentens anvisninger og indstille trækparametrene for aftrækkeren. Brug en mikrosmedje til at afskære dysen ved den angivne diameter for at opnå den specifikke spidsdiameter til eksperimentet, og steriliser dysen i alkohol i fem minutter.Skyl derefter dysen tre gange med sterilt vand for at fjerne eventuel resterende alkohol. For at fremstille hydrogelbioblækket fortyndes steriliseret 4% natriumalginatopløsning i 0,9% natriumchlorid ved 0,5, 1, 1,5 og 2% vægt-for-volumen koncentrationer. Til dannelse af mikrodrømme skal du lægge fem milliliter bioblæk i en steril engangssprøjte og installere sprøjten på en sprøjtepumpe.Tilslut sprøjten og trykdysen ved hjælp af en slange med en millimeter indvendig diameter. Spænd spændeskruen for at fastgøre dysen på plads, og tryk hurtigt på sprøjtepumpen for at lægge bioblækket i dysen. Indstil signalgeneratorparametrene, og forudindstil bevægelsesstien og udløsertilstanden for vibrationen til at falde efter behov.Udskriv derefter dråberne efter de foruddesignede mønstre. Til dannelse af mikrobærere tilsættes fem milliliter tværbindingsopløsning til en petriskål, og anbring skålen under trykdysen som substrat. Efter udskrivning skal du tværbinde mikrobærerne i tre minutter, før mikrobærersuspensionen overføres til et centrifugerør.Derefter beriges mikrobærerne ved centrifugering og suspenderes igen i et passende dyrkningsmedium ved ca. 600 mikrobærere pr. Milliliter. Før deres podning skal du erstatte supernatanten i en A549-cellekultur med fem milliliter serumfrit medium suppleret med 10-mikromolær celle tracker grøn CMFDA-farvestof til en 30-minutters inkubation i cellekulturinkubatoren. Ved afslutningen af inkubationen udskiftes farvestofopløsningen med frisk medium og suspenderes cellerne med en densitet på 1,6 gange 10 til de seks celler pr. Milliliter medium.Tilsæt en milliliter mikrobærersuspension til cellerne og en milliliter A549-celler til hver brønd af en lavkhævende seks-brønds kulturplade. Placer pladen på en ryster i cellekulturinkubatoren ved 30 omdrejninger pr. Minut. Ved afslutningen af inkubationen skal du fjerne pladen fra rysteren og lade mikrobærerne slå sig ned i 30 minutter, før de observerer og måler trykdysen, petriskåle og mikrobærer-podede celler ved hjælp af lysfelt- og konfokal fluorescensmikroskopi.Ved hjælp af en dyse med 30 mikrometer spids kan flere typer bioblæk, herunder PBS, 1,5% alginat og 1,5% gelatine, udskrives stabilt på petriskåle. Efterhånden som blækket øges i viskositet, bliver udskrivningsprocessen stadig vanskeligere, og der er behov for større drivkræfter for at opnå større dråber. Udskrivningsparametrene kan indstilles til at udskrive dråberne i specifikke 2D-arrangementer, som observeret i dette udskrivningseksperiment.Dysespidsens diameter har en direkte indvirkning på størrelsen af mikrobæreren, der kan udskrives. Som observeret i disse lysfelt- og konfokale billeder klæber A549-celler til alginat-kollagenmikrobærerne efter to dages dyrkning. Efter seks dage dækker A549-cellerne næsten fuldt ud mikrobæreroverfladerne.Efter denne procedure har vi belagt mikrobæreroverfladen med chitosan og brugt gluconat til at opløse alginatgelen for at danne en cystisk struktur, der kan påføres til at konstruere hule strukturer såsom alveoler. Udskrivningsprocessen til fremstilling af mikrobærere er ret blid, og denne metode kan derfor i vid udstrækning anvendes til udskrivning af celleholdige mikrobærere.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for In Vitro modellering af Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Tvinge System med lodrette V-bøjninger: en 3D In vitro- vurdering af elastisk og stive rektangulære Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable calciumalginat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemer fremkalde celle klumpformet dannelse

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Roman processen for 3D udskrivning Decellularized matricer

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En open source-teknologiplatform til fremstilling af hydrogelbaserede 3D-kulturmodeller på en automatiseret og standardiseret måde

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...