Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Beijing Natural Science Foundation (3212007), dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), dem Spring Breeze Fund der Tsinghua University (20201080760), der National Natural Science Foundation of China (51805294), dem National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) und dem 111 Project (B17026) unterstützt.

1. Zellkultur
<ol><li>Ergänzen Sie das modifizierte Minimum Essential Medium (H-DMEM) von Dulbecco mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% nicht essentieller Aminosäurelösung (NEAA), 1% Penicillin G und Streptomycin sowie 1% Glutaminpräparat als Kulturmedium für A549-Zellen.</li>
	<li>Kultur von A549-Zellen in einem CO2-Inkubator bei 37 °C und mit 5% CO2
</li>
	<li>Dissoziieren Sie Zellen für die Subkultur mit Trypsin bei etwa 80% Konfluenz.<ol>
<li>Verwenden Sie 3 ml Trypsin, um die Zellen i...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung von Multitypen von Hydrogel-Mikroträgern und die anschließende Zellaussaat. Im Vergleich zu mikrofluidischen Chip- und Inkjet-Druckverfahren bietet der AVIFJ-Ansatz zum Bau von Mikrocarriern eine größere Flexibilität und Biokompatibilität. Eine unabhängige Düse ermöglicht den Einsatz einer breiten Palette von Leichtbaudüsen, einschließlich Glasmikropipetten, in diesen Drucksystemen. Die hochgradig kontrollierbare Verarbeitung ermöglicht...

Mikroträger sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche und werden üblicherweise für die großflächige Kultur von Zellen verwendet1,2. Ihre äußere Oberfläche bietet reichlich Wachstumsstellen für Zellen, und das Innere bietet eine Stützstruktur für die räumliche Proliferation. Die sphärische Struktur bietet auch Komfort bei der Überwachung und Kontrolle von Parametern, einschließlich pH-Wert, O2 und Konzentration von Nährstoffen und Metaboliten. In Kombination mit Rührkessel-Bioreaktoren können Mikrocarrier im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen höhere Zelldichten in einem relativ kleinen Volumen erreichen und bieten damit eine kostengünstige Möglichkeit, Großkulturen zu erhalten3. Die Mikroträgerkulturtechnologie ist zu einer der wichtigsten Techniken in der zytologischen Forschung geworden, und auf dem Gebiet der großflächigen Expansion von Stammzellen, Hepatozyten, Chondrozyten, Fibroblasten und anderen Strukturen wurden große Fortschritte erzielt4. Sie haben sich auch als ideale Arzneimittelverabreichungsvehikel und Bottom-up-Einheiten erwiesen und übernehmen daher eine immer wichtigere Rolle beim klinischen Arzneimittelscreening und bei der Reparatur von In-vitro-Geweben5.
Um die Anforderungen an die mechanischen Eigenschaften in verschiedenen Szenarien zu erfüllen, wurden mehrere Arten von Hydrogelmaterialien für den Bau von Mikrocarriern entwickelt6,7,8,9,10,11. Alginat- und Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele sind aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und Vernetzungsfähigkeit zwei der am häufigsten verwendeten Mikrocarriermaterialien12,13. Alginat kann leicht durch Calciumchlorid vernetzt werden, und seine mechanischen Eigenschaften können durch Änderung der Vernetzungszeit moduliert werden. Tyramin-konjugiertes HA wird durch die oxidative Kopplung von Tyraminresten, die durch Wasserstoffperoxid und Meerrettichperoxidase katalysiert werden, vernetzt14. Kollagen wird aufgrund seiner einzigartigen Spiralstruktur und seines vernetzten Fasernetzwerks häufig als Adjuvans verwendet, um sich in die Mikroträger zu mischen, um die Zellbindung weiter zu fördern15,16.
Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips, Tintenstrahldruck und Elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidische Chips haben sich bei der Herstellung von Mikrocarriern in einheitlicher Größe als schnell und effizient erwiesen24. Diese Technologie beruht jedoch auf einem komplexen Fließkanaldesign- und Fertigungsprozess25. Hohe Temperaturen oder übermäßige Extrusionskräfte beim Tintenstrahldruck sowie intensive elektrische Felder beim Elektrospray-Ansatz können die Eigenschaften des Materials, insbesondere seine biologische Aktivität, beeinträchtigen19. Wenn sie auf verschiedene Biomaterialien und Durchmesser angewendet werden, führen die in diesen Methoden verwendeten kundenspezifischen Düsen zu einer begrenzten Verarbeitungskomplexität, hohen Kosten und geringer Flexibilität.
Um eine bequeme Methode für die Mikrocarrier-Vorbereitung bereitzustellen, wurde eine 3D-Drucktechnik namens Alternating Viscous-Inertial Forces Jetting (AVIFJ) angewendet, um Hydrogel-Mikroträger zu konstruieren. Die Technik nutzt nach unten gerichtete Antriebskräfte und statischen Druck, die während vertikaler Vibrationen erzeugt werden, um die Oberflächenspannung der Düsenspitze zu überwinden und so Tröpfchen zu bilden. Anstelle von starken Kräften und thermischen Bedingungen wirken kleine schnelle Verschiebungen während des Druckens direkt auf die Düse, was einen geringen Einfluss auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Biotinte hat und eine große Anziehungskraft auf bioaktive Materialien ausübt. Mit der AVIFJ-Methode wurden mikrocarrier aus mehreren Biomaterialien mit Durchmessern von 100-300 μm erfolgreich gebildet. Außerdem wurde bewiesen, dass die Mikrocarrier Zellen gut binden und eine geeignete Wachstumsumgebung für adhärente Zellen bieten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

Microcarrier sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche, die üblicherweise als Träger für großflächige Zellkulturen verwendet werden. Die Mikrocarrierkulturtechnologie ist zu einer der Haupttechniken in der zytologischen Forschung geworden und wird häufig im Bereich der großflächigen Zellexpansion eingesetzt. Es hat sich auch gezeigt, dass Mikrocarrier eine immer wichtigere Rolle bei der In-vitro-Tissue-Engineering-Konstruktion und beim klinischen Arzneimittelscreening spielen. Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips und Tintenstrahldruck, die oft auf einem komplexen Strömungskanaldesign, einer inkompatiblen Zweiphasenschnittstelle und einer festen Düsenform beruhen. Diese Methoden stehen vor den Herausforderungen komplexer Düsenverarbeitung, unbequemer Düsenwechsel und übermäßiger Extrusionskräfte, wenn sie auf mehrere Biotinten angewendet werden. In dieser Studie wurde eine 3D-Drucktechnik, die als alternierende viskos-inertiale Kraftstrahlung bezeichnet wird, angewendet, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern mit einem Durchmesser von 100-300 μm zu ermöglichen. Anschließend wurden Zellen auf Mikroträgern ausgesät, um Tissue-Engineering-Module zu bilden. Im Vergleich zu bestehenden Verfahren bietet diese Methode einen freien Düsenspitzendurchmesser, flexibles Düsenschalten, freie Kontrolle der Druckparameter und milde Druckbedingungen für eine Vielzahl von bioaktiven Materialien.

Druckköpfe mit unterschiedlichen Konvergenzraten und Durchmessern wurden hergestellt, um den Druck mehrerer Arten von Materialien zu erreichen. Die mit zunehmender Zugfestigkeit erhaltenen Düsen sind in Abbildung 1B dargestellt. Die Düsen wurden in drei Bereiche unterteilt: Reservoir (III), Kontraktion (II) und Druckkopf (I). Das Reservoir war der unverarbeitete Teil der Düse, in dem die Flüssigkeit statischen Druck und Bioink-Input für den Druck lieferte. Der Kontraktionsbereich war d...

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3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Hier wird eine milde 3D-Drucktechnik vorgestellt, die durch abwechselnd viskos-inertiale Kräfte angetrieben wird, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern zu ermöglichen. Hausgemachte Düsen bieten Flexibilität und ermöglichen einen einfachen Austausch für verschiedene Materialien und Durchmesser. Zellbindende Mikroträger mit einem Durchmesser von 50-500 μm können erhalten und für die weitere Kultivierung gesammelt werden.

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Wir bieten ein mildes biogedrucktes Verfahren zur Herstellung von Mikrocarriern mit einer guten Kontrollierbarkeit und Biokompatibilität. Nach der Verkapselung durch Zellen können die Träger auch in der In-vitro-Zellexpansion und der funktionellen Mikrogewebekonstruktion eingesetzt werden. Während des Druckprozesses wirken eine begrenzte Verschiebung anstelle von starken Kräften unter ähnlichen Bedingungen auf die Düse und erhalten die ursprünglichen physikalischen/chemischen Eigenschaften der Biotinte in größtmöglichem Umfang.Neben herkömmlichen Mikrocarriern können Einheiten mit innerer Zellverteilung oder Tritosin-verkapselten Kapselstrukturen konstruiert und auf den Aufbau verschiedener Gewebestrukturen angewendet werden. Für die Düsenvorbereitung laden Sie nach Herstellerangaben Glasmikropipetten auf den Abzieher und stellen die Zugparameter für den Abzieher ein. Verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Düse mit dem angegebenen Durchmesser abzuschneiden, um den spezifischen Spitzendurchmesser für das Experiment zu erhalten, und sterilisieren Sie die Düse fünf Minuten lang in Alkohol.Dann spülen Sie die Düse dreimal mit sterilem Wasser ab, um Restalkohol zu entfernen. Um die Hydrogel-Biotinte herzustellen, verdünnen Sie die sterilisierte 4% ige Natriumalginat-Stammlösung in 0,9% Natriumchlorid bei Konzentrationen von 0,5, 1, 1,5 und 2% Gewicht. Für die Bildung von Mikrotröpfchen laden Sie fünf Milliliter Biotinte in eine sterile Einwegspritze und installieren Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe.Verbinden Sie die Spritze und die Druckdüse mit einem Schlauch mit einem Millimeter Innendurchmesser. Ziehen Sie die Klemmschraube fest, um die Düse zu befestigen, und drücken Sie schnell die Spritzenpumpe, um die Biotinte in die Düse zu laden. Stellen Sie die Parameter des Signalgenerators ein und stellen Sie den Bewegungspfad und den Triggermodus der Vibration so ein, dass sie bei Bedarf abfällt.Drucken Sie dann die Tröpfchen nach den vorgefertigten Mustern. Für die Bildung von Mikroträgern fügen Sie einer Petrischale fünf Milliliter Vernetzungslösung hinzu und legen Sie die Schale als Substrat unter die Druckdüse. Nach dem Drucken die Mikrocarrier drei Minuten lang vernetzen, bevor die Mikrocarrier-Suspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt wird.Anschließend werden die Mikroträger durch Zentrifugation angereichert und in einem geeigneten Kulturmedium bei etwa 600 Mikroträgern pro Milliliter resuspendiert. Ersetzen Sie vor ihrer Impfung den Überstand einer A549-Zellkultur durch fünf Milliliter serumfreies Medium, ergänzt mit 10-mikromolarem Zelltracker grünem CMFDA-Farbstoff für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die Farbstofflösung durch frisches Medium und resuspenieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 1,6 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter Medium.Fügen Sie einen Milliliter Mikroträgersuspension zu den Zellen und einen Milliliter A549-Zellen zu jeder Vertiefung einer niedrig haftenden Sechs-Well-Kulturplatte hinzu. Legen Sie die Platte mit 30 Umdrehungen pro Minute auf einen Shaker im Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Platte aus dem Shaker und lassen Sie die Mikroträger sich 30 Minuten lang absetzen, bevor Sie die Druckdüse, die Petrischalen und die mikrocarrier-impften Zellen durch Hellfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie beobachten und messen.Mit einer 30-Mikrometer-Spitzendüse können mehrere Arten von Bio-Tinte, einschließlich PBS, 1,5% Alginat und 1,5% Gelatine, stabil auf Petrischalen gedruckt werden. Mit zunehmender Viskosität der Tinten wird der Druckprozess immer schwieriger und es werden größere Antriebskräfte benötigt, um größere Tröpfchen zu erhalten. Die Druckparameter können so eingestellt werden, dass die Tröpfchen in bestimmten 2D-Anordnungen gedruckt werden, wie in diesem Druckexperiment beobachtet.Der Durchmesser der Düsenspitze hat einen direkten Einfluss auf die Größe des Mikroträgers, der gedruckt werden kann. Wie in diesen Hellfeld- und konfokalen Bildern beobachtet, haften A549-Zellen nach zwei Tagen Kultur an den Alginat-Kollagen-Mikroträgern. Nach sechs Tagen bedecken die A549-Zellen die Mikroträgeroberflächen fast vollständig.Nach diesem Verfahren haben wir die Mikrocarrieroberfläche mit Chitosan beschichtet und Gluconat verwendet, um das Alginatgel aufzulösen, um eine zystische Struktur zu bilden, die angewendet werden kann, um Hohlstrukturen wie Alveolen zu konstruieren. Der Druckprozess zur Herstellung von Mikrocarriern ist recht schonend, daher kann dieses Verfahren häufig zum Drucken zellhaltiger Mikroträger eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Forschung

Biotechnik

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

System mit vertikal V-Kurven zu zwingen: eine 3D In-vitro- Bewertung der elastisch und starr rechteckigen Bögen

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D-Druck poröse Zellulose Nanocomposites Hydrogel Gerüste

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Eine Open-Source-Technologieplattform zur automatisierten und standardisierten Herstellung von Hydrogel-basierten 3D-Kulturmodellen

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...