Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (3212007), תוכנית המחקר המדעית של יוזמת אוניברסיטת צינגחואה (20197050024), קרן רוח האביב של אוניברסיטת צינגחואה (20201080760), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (51805294), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2018YFA0703004), ופרויקט 111 (B17026).

1. תרבות התא
<ol><li>יש להשלים את המדיום החיוני המינימלי (H-DMEM) המותאם לגלוקוז גבוה של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פתרון חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% פניצילין G וסטרפטומיצין, ותוסף גלוטמין 1% כמדיה תרבית לתאי A549.</li>
	<li>תרבית A549 תאים בחממת CO2 ב 37 °C (5° C) עם 5% CO2
</li>
	<li>לנתק תאים עבור תת ?...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות להכנת סוגים רבים של מיקרוקארים הידרוג'ל וזריעת תאים לאחר מכן. בהשוואה לשיטות הדפסת שבבים מיקרופלואידיים והזרקת דיו, גישת AVIFJ לבניית מיקרו-מכוניות מציעה גמישות רבה יותר והתאמה ביולוגית. זרבובית עצמאית מאפשרת שימוש במגוון רחב של חרירים קלים, כולל מיקרופיפט?...

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול והם משמשים בדרך כלל עבור תרבות בקנה מידה גדול של תאים1,2. המשטח החיצוני שלהם מספק אתרי צמיחה בשפע לתאים, והפנים מספקים מבנה תמיכה להתפשטות מרחבית. המבנה הכדורי מספק גם נוחות בניטור ובקרה של פרמטרים, כולל pH, O2, וריכוז של חומרים מזינים ומטבוליטים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם bioreactors טנק מעורבב, microcarriers יכול להשיג צפיפות תאים גבוהה יותר בנפח קטן יחסית לעומת תרבויות קונבנציונליות, ובכך לספק דרך חסכונית להשיג תרביות בקנה מידה גדול3. טכנולוגיית תרבות מיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי, והתקדמות רבה נעשתה בתחום ההתרחבות בקנה מידה גדול של תאי גזע, הפטוציטים, כונדרוציטים, פיברובלסטים ומבנים אחרים4. הם גם נמצאו כלי רכב משלוח סמים אידיאליים ויחידות מלמטה למעלה, ולכן לוקח על עצמו תפקיד חשוב יותר ויותר בהקרנת תרופות קליניות ותיקון הנדסת רקמות במבחנה5.
כדי לענות על דרישות רכוש מכני בתרחישים שונים, סוגים רבים של חומרים הידרוג'ל פותחו לשימוש בבניית microcarriers6,7,8,9,10,11. הידרוג'לים של חומצה אלגינטית וחומצה היאלורונית (HA) הם שניים מהחומרים המיקרו-קרוריים הנפוצים ביותר בשל תאימותם הביולוגית הטובה ויכולת ההצלבה שלהם12,13. Alginate יכול להיות מקושר בקלות על ידי סידן כלוריד, ואת המאפיינים המכניים שלה ניתן לאפנן על ידי שינוי הזמן חוצה קישור. HA מצומד טיירמין מקושר על ידי צימוד חמצוני של moieties טירמין מזורז על ידי מי חמצן ופרוקסידאז חזרת14. קולגן, בשל המבנה הספירלי הייחודי שלו ורשת סיבים מקושרת, משמש לעתים קרובות כאדג'ובנט להתערבב לתוך microcarriers כדי לקדם עוד יותר את הקובץ המצורף לתאים15,16.
השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים, הדפסת הזרקת דיו ו electrospray17,18,19,20,20,21,22,23. שבבים מיקרופלואידיים הוכחו כמהירים ויעילים בייצור מיקרו-קרניים בגודל אחיד24. עם זאת, טכנולוגיה זו מסתמכת על תכנון וייצור ערוץ זרימה מורכב25. טמפרטורה גבוהה או כוחות שחול מוגזמים במהלך הדפסת הזרקת דיו, כמו גם שדות חשמליים אינטנסיביים בגישת electrospray, עלול להשפיע לרעה על המאפיינים של החומר, במיוחד את הפעילות הביולוגית שלה19. חוץ מזה, כאשר מוחל על ביו-חומרים וקטרים שונים, חרירים מותאמים אישית המשמשים בשיטות אלה לגרום למורכבות עיבוד מוגבלת, עלות גבוהה, וגמישות נמוכה.
כדי לספק שיטה נוחה להכנת מיקרוקרייר, טכניקת הדפסה תלת-ממדית הנקראת סילון כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין (AVIFJ) יושמה לבניית מיקרו-מכוניות הידרוג'ל. הטכניקה משתמשת בכוחות הנעה כלפי מטה ובלחץ סטטי שנוצר במהלך רטט אנכי כדי להתגבר על מתח פני השטח של קצה הזרבובית ובכך ליצור טיפות. במקום כוחות חמורים ותנאים תרמיים, עקירות מהירות קטנות פועלות ישירות על הזרבובית במהלך ההדפסה, וגורמות להשפעה מינורית על התכונות הפיזיקוכימיות של הביוינק ומציגות משיכה גדולה לחומרים ביו-אקטיביים. תוך שימוש בשיטת AVIFJ, מיקרוקארים של ביו-חומרים מרובים עם קטרים של 100-300 מיקרומטר נוצרו בהצלחה. חוץ מזה, המיקרו-מכוניות הוכחו עוד יותר כקושרות תאים היטב ומספקות סביבת גדילה מתאימה לתאים דבוקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול, אשר משמשים בדרך כלל כנשאים עבור תרביות תאים בקנה מידה גדול. טכנולוגיית תרבות המיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי והיא נפוצה בתחום התרחבות התאים בקנה מידה גדול. Microcarriers הוכחו גם לשחק תפקיד חשוב יותר ויותר בבניית הנדסת רקמות במבחנה והקרנת תרופות קליניות. השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים והדפסת הזרקת דיו, המסתמכים לעתים קרובות על עיצוב ערוץ זרימה מורכב, ממשק דו-פאזי לא תואם וצורת זרבובית קבועה. שיטות אלה מתמודדות עם האתגרים של עיבוד זרבובית מורכב, שינויי זרבובית לא נוחים, וכוחות שחול מוגזמים כאשר מוחלים על bioink מרובים. במחקר זה, טכניקת הדפסה 3D, הנקראת סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין, הוחלה כדי לאפשר בנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל בקוטר של 100-300 מיקרומטר. תאים נזרעו לאחר מכן על מיקרו-מכוניות כדי ליצור מודולים להנדסת רקמות. בהשוואה לשיטות הקיימות, שיטה זו מציעה קוטר קצה זרבובית חינם, החלפת זרבובית גמישה, שליטה חופשית בפרמטרים של הדפסה ותנאי הדפסה קלים למגוון רחב של חומרים ביו-אקטיביים.

ראשי הדפסה של שיעורי התכנסות וקטרים מגוונים היו מפוברקים כדי להשיג את ההדפסה של סוגים מרובים של חומרים. החרירים המתקבלים עם כוח המשיכה הגובר מוצגים באיור 1B. החרירים חולקו לשלושה תחומים: מאגר (III), התכווצות (II) וראש הדפסה (I). המאגר היה החלק הלא מעובד של הזרבובית, שבו הנוזל סיפק ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

מוצג כאן היא טכניקת הדפסה 3D מתון מונע על ידי כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין כדי לאפשר את הבנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל. חרירים תוצרת בית מציעים גמישות, ומאפשרים החלפה קלה לחומרים וקטרים שונים. מיקרוקארים מחייבים תא בקוטר של 50-500 מיקרומטר ניתן להשיג ולאסוף עבור culturing נוסף.

הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

אנו מציעים תהליך ביו-הדפסה מתון להכנת מיקרוקריירים עם שליטה טובה ותאימות ביולוגית. לאחר אנקפסולציה על ידי תאים, נשאים יכולים לשמש גם בהרחבת תאים במבחנה ובניית microtissue פונקציונלי. עקירה מוגבלת, ולא כוחות חמורים בתנאים דומים פועלים על הזרבובית במהלך תהליך ההדפסה, תוך שמירה על התכונות הפיזיקליות/כימיות המקוריות של הביו-דיו במידה המרבית.בנוסף מיקרוקארים קונבנציונליים, יחידות עם הפצת תאים פנימיים או מבני כמוסה tritosin-encapsulated ניתן לבנות וליישם על הרכבה של מבני רקמות שונים. להכנת הזרבובית, לטעון micropipettes זכוכית על המושך על פי הוראות היצרן ולהגדיר את הפרמטרים משיכה עבור מושך. השתמש microforge כדי לחתוך את הזרבובית בקוטר המיועד כדי לקבל את קוטר הקצה הספציפי לניסוי, ולחטא את הזרבובית באלכוהול במשך חמש דקות.לאחר מכן, לשטוף את הזרבובית שלוש פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר כל אלכוהול שיורית. כדי להכין את הידרוג'ל ביו-דיו, לדלל מעוקר 4% פתרון מלאי נתרן אלגינט ב 0.9% נתרן כלורי ב 0.5, 1, 1.5, ו 2% ריכוזי משקל אחר נפח. להיווצרות מיקרו-טיפת, טענו חמישה מיליליטר של ביו-דיו למזרק סטרילי חד פעמי והניחו את המזרק על משאבת מזרק.באמצעות צינור בקוטר פנימי של מילימטר אחד, חברו את המזרק ואת זרבובית ההדפסה. הדקו את בורג ההידוק כדי לאבטח את הזרבובית למקומה ולדכא במהירות את משאבת המזרק כדי לטעון את הביו-דיו לתוך הזרבובית. הגדר את הפרמטרים של מחולל האותות וקבע מראש את נתיב התנועה ואת מצב ההדק של הרטט כך שיורד לפי דרישה.לאחר מכן הדפס את הטיפות בהתאם לתבניות שעוצבו מראש. להיווצרות מיקרו-מכוניות, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת crosslinking לצלחת פטרי, והניחו את המנה מתחת לזרבובית ההדפסה כמצע. לאחר ההדפסה, תצליבו את המיקרו-מכוניות במשך שלוש דקות לפני העברת ההשעיה של המיקרו-קרויר לצינור צנטריפוגה.לאחר מכן, להעשיר את microcarriers על ידי צנטריפוגה ו resuspened אותם במדיום תרבות מתאים בכ 600 מיקרוקארים למיליליטר. לפני החיסון שלהם, להחליף את supernatant של תרבית תאים A549 עם חמישה מיליליטר של מדיום ללא סרום בתוספת עם 10 מיקרומולרי גשש תאים ירוק CMFDA צבע עבור דגירה של 30 דקות בחממה תרבית התא. בסוף הדגירה, להחליף את פתרון הצבע עם בינוני טרי resuspend התאים בצפיפות של 1.6 פעמים 10 כדי שישה תאים למיליליטר של בינוני.הוסף מיליליטר אחד של השעיית מיקרוקרייר לתאים ומיליליטר אחד של תאי A549 לכל באר של צלחת תרבית בעלת שש בארות בעלת דבקות נמוכה. מניחים את הצלחת על שייקר בחממה תרבית התא ב 30 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, הסר את הצלחת מן השייקר ולאפשר microcarriers להסתפק במשך 30 דקות לפני התבוננות ומדידת זרבובית ההדפסה, צלחות פטרי, ותאים מחוסנים microcarrier על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית שדה בהיר קונפוקלי.באמצעות זרבובית קצה 30 מיקרומטר, סוגים רבים של ביו-דיו, כולל PBS, 1.5%alginate, ו 1.5% ג'לטין ניתן להדפיס ביציבות על צלחות פטרי. ככל שהדיו גדל בצמיגות, תהליך ההדפסה הופך לקשה יותר ויותר ויש צורך בכוחות מניעים גדולים יותר כדי להשיג טיפות גדולות יותר. ניתן להגדיר את פרמטרי ההדפסה כך שידפיסו את הטיפות בסידורים דו-ממדיים ספציפיים, כפי שנצפה בניסוי הדפסה זה.הקוטר של קצה הזרבובית יש השפעה ישירה של גודל של microcarrier שניתן להדפיס. כפי שניתן לראות בתמונות שדה בהירות וקונפוקליות אלה, תאי A549 נצמדים למיקרו-קרטרים של קולגן אלגינט לאחר יומיים של תרבות. לאחר שישה ימים, תאי A549 מכסים כמעט באופן מלא את משטחי המיקרו-קרויר.בעקבות הליך זה, יש לנו מצופה את פני השטח microcarrier עם chitosan, והשתמש גלוקונאט כדי להמיס את ג'ל אלגינט כדי ליצור מבנה ציסטי שניתן ליישם לבניית מבנים חלולים כגון alveoli. תהליך ההדפסה להכנת מיקרו-מכוניות הוא עדין למדי, ולכן, שיטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב להדפסת מיקרו-מכוניות המכילות תאים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

לאלץ את המערכת עם V אנכי-כפיפות: הערכה 3D במבחנה של Archwires מלבני גמישה ונוקשה

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D מודפס נקבובי תאית Nanocomposite הידרוג פיגומים

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...