Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (3212007), dal Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), dal Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), dalla National Natural Science Foundation of China (51805294), dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) e dal Progetto 111 (B17026).

1. Coltura cellulare
<ol><li>Integrare il mezzo essenziale minimo modificato (H-DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA), l'1% di penicillina G e streptomicina e l'1% di integratore di glutammina come terreno di coltura per le cellule A549.</li>
	<li>Coltura di cellule A549 in un incubatore a CO2 a 37 °C e con co2 al 5%
</li>
	<li>Dissociare le cellule per la sottocoltura usando la tripsina a cir...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per la preparazione di multi-tipi di microcarrier idrogel e la successiva semina cellulare. Rispetto ai metodi di stampa a chip microfluidico e a getto d'inchiostro, l'approccio AVIFJ alla costruzione di microcarrier offre maggiore flessibilità e biocompatibilità. Un ugello indipendente consente di utilizzare in questi sistemi di stampa un'ampia gamma di ugelli leggeri, tra cui micropipette di vetro. L'elaborazione altamente controllabile consente di regolare liberamente ...

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica e sono comunemente usati per la coltura su larga scala di cellule1,2. La loro superficie esterna fornisce abbondanti siti di crescita per le cellule e l'interno fornisce una struttura di supporto per la proliferazione spaziale. La struttura sferica offre anche praticità nel monitoraggio e nel controllo dei parametri, tra cui pH, O2 e concentrazione di nutrienti e metaboliti. Se utilizzati in combinazione con bioreattori a serbatoio agitato, i microcarrier possono raggiungere densità cellulari più elevate in un volume relativamente piccolo rispetto alle colture convenzionali, fornendo così un modo economico per ottenere colture su larga scala3. La tecnologia di coltura di microcarrier è diventata una delle principali tecniche nella ricerca citologica e sono stati fatti molti progressi nel campo dell'espansione su larga scala di cellule staminali, epatociti, condrociti, fibroblasti e altre strutture4. Sono stati anche trovati come veicoli ideali per la somministrazione di farmaci e unità dal basso verso l'alto, assumendo quindi un ruolo sempre più importante nello screening clinico dei farmaci e nella riparazione in vitro dell'ingegneria tissutale5.
Per soddisfare i requisiti di proprietà meccanica in diversi scenari, sono stati sviluppati diversi tipi di materiali idrogel per l'uso nella costruzione di microcarrier6,7,8,9,10,11. Gli idrogel di alginato e acido ialuronico (HA) sono due dei materiali microvettori più utilizzati grazie alla loro buona biocompatibilità e reticolabilità12,13. L'alginato può essere facilmente reticolato dal cloruro di calcio e le sue proprietà meccaniche possono essere modulate modificando il tempo di reticolazione. L'HA coniugato con tiramina è reticolato dall'accoppiamento ossidativo di porzioni di tiramina catalizzate da perossido di idrogeno e perossidasi di rafano14. Il collagene, grazie alla sua struttura a spirale unica e alla rete di fibre reticolate, viene spesso utilizzato come coadiuvante da miscelare nei microcarrier per promuovere ulteriormente l'attaccamento cellulare15,16.
I metodi attuali per la preparazione di microcarrier includono chip microfluidici, stampa a getto d'inchiostro ed elettrospray17,18,19,20,21,22,23. I chip microfluidici hanno dimostrato di essere veloci ed efficienti nella produzione di microcarrier di dimensioni uniformi24. Tuttavia, questa tecnologia si basa su un complesso processo di progettazione e fabbricazione del canale di flusso25. Le alte temperature o le eccessive forze di estrusione durante la stampa a getto d'inchiostro, così come i campi elettrici intensi nell'approccio elettrospray, possono influire negativamente sulle proprietà del materiale, in particolare sulla sua attività biologica19. Inoltre, se applicati a vari biomateriali e diametri, gli ugelli personalizzati utilizzati in questi metodi si traducono in una complessità di lavorazione limitata, costi elevati e bassa flessibilità.
Per fornire un metodo conveniente per la preparazione del microcarrier, è stata applicata una tecnica di stampa 3D chiamata alternanza di forze viscose-inerziali (AVIFJ) per costruire microcarrier idrogel. La tecnica utilizza le forze motrici verso il basso e la pressione statica generata durante la vibrazione verticale per superare la tensione superficiale della punta dell'ugello e quindi formare goccioline. Invece di forze severe e condizioni termiche, piccoli spostamenti rapidi agiscono direttamente sull'ugello durante la stampa, causando un effetto minore sulle proprietà fisico-chimiche del bioink e presentando una grande attrazione per i materiali bioattivi. Utilizzando il metodo AVIFJ, sono stati formati con successo microcarrier di più biomateriali con diametri di 100-300 μm. Inoltre, i microcarrier hanno ulteriormente dimostrato di legare bene le cellule e fornire un ambiente di crescita adatto per le cellule aderenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica, che sono comunemente usati come vettori per colture cellulari su larga scala. La tecnologia di coltura del microcarrier è diventata una delle principali tecniche nella ricerca citologica ed è comunemente usata nel campo dell'espansione cellulare su larga scala. I microcarrier hanno anche dimostrato di svolgere un ruolo sempre più importante nella costruzione di ingegneria tissutale in vitro e nello screening clinico dei farmaci. I metodi attuali per la preparazione di microcarrier includono chip microfluidici e stampa a getto d'inchiostro, che spesso si basano su un complesso design del canale di flusso, un'interfaccia bifase incompatibile e una forma a ugello fisso. Questi metodi affrontano le sfide della complessa lavorazione degli ugelli, dei cambiamenti scomodi degli ugelli e delle forze di estrusione eccessive quando applicati a più bioink. In questo studio, è stata applicata una tecnica di stampa 3D, chiamata alternanza viscoso-inerziale a getto di forza, per consentire la costruzione di microcarrier idrogel con un diametro di 100-300 μm. Le cellule sono state successivamente seminate su microcarrier per formare moduli di ingegneria tissutale. Rispetto ai metodi esistenti, questo metodo offre un diametro libero della punta dell'ugello, commutazione flessibile dell'ugello, controllo libero dei parametri di stampa e condizioni di stampa miti per una vasta gamma di materiali bioattivi.

Testine di stampa di vari tassi di convergenza e diametri sono state fabbricate per ottenere la stampa di più tipi di materiali. Gli ugelli ottenuti con una forza di trazione crescente sono mostrati nella Figura 1B. Gli ugelli sono stati divisi in tre aree: serbatoio (III), contrazione (II) e testina di stampa (I). Il serbatoio era la parte non elaborata dell'ugello, in cui il liquido forniva pressione statica e input bioink per la stampa. L'area di contrazione era la parte principale per g...

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3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Qui viene presentata una lieve tecnica di stampa 3D guidata dall'alternanza di forze viscose-inerziali per consentire la costruzione di microcarrier in idrogel. Gli ugelli fatti in casa offrono flessibilità, consentendo una facile sostituzione di diversi materiali e diametri. I microcarrier leganti le cellule con un diametro di 50-500 μm possono essere ottenuti e raccolti per un'ulteriore coltivazione.

Stampa 3D di microcarrier idrogel in vitro mediante getto alternato di forza viscosa-inerziale

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Offriamo un delicato processo bioprinted per la preparazione di microcarrier con una buona controllabilità e biocompatibilità. Dopo l'incapsulamento da parte delle cellule, i supporti possono anche essere utilizzati nell'espansione cellulare in vitro e nella costruzione funzionale di microtessuti. Lo spostamento limitato, piuttosto che forze gravi in condizioni simili, agiscono sull'ugello durante il processo di stampa, mantenendo al massimo le proprietà fisico/chimiche originali del bio-inchiostro.Oltre ai microcarrier convenzionali, le unità con distribuzione cellulare interna o strutture di capsule incapsulate in tritosina possono essere costruite e applicate all'assemblaggio di diverse strutture tissutali. Per la preparazione dell'ugello, caricare micropipette di vetro sull'estrattore secondo le istruzioni del produttore e impostare i parametri di trazione per l'estrattore. Utilizzare un microforge per tagliare l'ugello al diametro designato per ottenere il diametro specifico della punta per l'esperimento e sterilizzare l'ugello in alcool per cinque minuti.Quindi, risciacquare l'ugello tre volte con acqua sterile per rimuovere eventuali residui di alcol. Per preparare il bio-inchiostro idrogel, diluire la soluzione madre di alginato di sodio al 4% sterilizzata in cloruro di sodio allo 0,9% a concentrazioni di 0,5, 1, 1,5 e 2% peso per volume. Per la formazione di microgoccioline, caricare cinque millilitri di bio-inchiostro in una siringa sterile monouso e installare la siringa su una pompa a siringa.Utilizzando un tubo flessibile di un millimetro di diametro interno, collegare la siringa e l'ugello di stampa. Stringere la vite di serraggio per fissare l'ugello in posizione e premere rapidamente la pompa della siringa per caricare il bio-inchiostro nell'ugello. Impostare i parametri del generatore di segnali e preimpostare il percorso del movimento e la modalità di attivazione della vibrazione per cadere su richiesta.Quindi stampare le goccioline seguendo i modelli pre-progettati. Per la formazione di microcarrier, aggiungere cinque millilitri di soluzione reticolante a una capsula di Petri e posizionare la parabola sotto l'ugello di stampa come substrato. Dopo la stampa, reticolare i microcarrier per tre minuti prima di trasferire la sospensione del microvettore su un tubo della centrifuga.Quindi, arricchire i microcarrier mediante centrifugazione e risospenderli in un terreno di coltura appropriato a circa 600 microcarrier per millilitro. Prima della loro inoculazione, sostituire il surnatante di una coltura cellulare A549 con cinque millilitri di mezzo privo di siero integrato con colorante CMFDA verde tracker cellulare 10 micromolari per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di colture cellulari. Alla fine dell'incubazione, sostituire la soluzione colorante con mezzo fresco e risospese le cellule ad una densità di 1,6 volte 10 alle sei cellule per millilitro di mezzo.Aggiungere un millilitro di sospensione di microcarrier alle celle e un millilitro di celle A549 a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti a bassa aderenza. Posizionare la piastra su uno shaker nell'incubatore di colture cellulari a 30 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la piastra dallo shaker e lasciare che i microcarrier si depositino per 30 minuti prima di osservare e misurare l'ugello di stampa, le piastre di Petri e le cellule inoculate da microvettore mediante microscopia a fluorescenza a campo luminoso e confocale.Utilizzando un ugello a punta di 30 micrometri, è possibile stampare stabilmente su piastre di Petri più tipi di bio-inchiostro, tra cui PBS, alginato all'1,5% e gelatina all'1,5%. Man mano che gli inchiostri aumentano di viscosità, il processo di stampa diventa sempre più difficile e sono necessarie maggiori forze motrici per ottenere goccioline più grandi. I parametri di stampa possono essere impostati per stampare le goccioline in specifiche disposizioni 2D, come osservato in questo esperimento di stampa.Il diametro della punta dell'ugello ha un impatto diretto delle dimensioni del microvettore che può essere stampato. Come osservato in queste immagini a campo luminoso e confocali, le cellule A549 aderiscono ai microcarrier alginato-collagene dopo due giorni di coltura. Dopo sei giorni, le celle dell'A549 coprono quasi completamente le superfici del microvettore.Seguendo questa procedura, abbiamo rivestito la superficie del microvettore con chitosano e utilizzato gluconato per sciogliere il gel di alginato per formare una struttura cistica che può essere applicata per costruire strutture cave come gli alveoli. Il processo di stampa per la preparazione di microcarrier è abbastanza delicato, quindi questo metodo può essere ampiamente utilizzato per la stampa di microcarrier contenenti cellule.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

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Ricerca

Bioingegneria

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