Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
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この研究は、北京自然科学財団(3212007)、清華大学イニシアチブ科学研究プログラム(20197050024)、清華大学春風基金(20201080760)、中国国家自然科学財団(51805294)、中国国家重点研究開発プログラム(2018YFA0703004)、および111プロジェクト(B17026)の支援を受けました。

1. 細胞培養
<ol><li>高グルコースダルベッコの改変最小必須培地(H-DMEM)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1%ペニシリンGおよびストレプトマイシン、および1%グルタミンサプリメントでA549細胞の培養培地として補充する。</li>
	<li>A549細胞を37°CのCO2インキュベーターで5%のCO2で培養する
</li>
	<li>継代培養のために細胞を約80%のコンフルエントでトリプシンを用...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

ここで説明するプロトコールは、マルチタイプのヒドロゲルマイクロキャリアの調製およびその後の細胞播種のための指示を提供する。マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷方法と比較して、マイクロキャリアを構築するためのAVIFJアプローチは、より大きな柔軟性および生体適合性を提供する。独立したノズルにより、ガラスマイクロピペットを含む幅広い軽量ノズルをこれらの?...

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、細胞の大規模培養に一般的に使用されています1,2。それらの外表面は細胞に豊富な増殖部位を提供し、内部は空間的増殖のための支持構造を提供する。球状構造はまた、pH、O2、栄養素および代謝産物の濃度を含むパラメータの監視および制御において利便性を提供する。撹拌槽バイオリアクターと組み合わせて使用すると、マイクロキャリアは従来の培養物と比較して比較的少量でより高い細胞密度を達成することができ、それによって大規模培養を達成するための費用対効果の高い方法を提供する3。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の一つとなっており、幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞などの大規模増殖の分野では大きな進歩を遂げています4。また、理想的な薬物送達ビヒクルおよびボトムアップユニットであることも判明しており、臨床薬物スクリーニングおよびインビトロ組織工学修復においてますます重要な役割を果たしています5。
異なるシナリオにおける機械的特性要件を満たすために、マイクロキャリアの構築に使用するために複数のタイプのヒドロゲル材料が開発されている6,7,8,9,10,11。アルギン酸およびヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルは、その良好な生体適合性および架橋性のために、最も使用されるマイクロ担体材料の2つである12,13。アルギン酸塩は塩化カルシウムによって容易に架橋することができ、その機械的特性は架橋時間を変えることによって調節することができる。チラミン共役HAは、過酸化水素および西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒されるチラミン部分の酸化的結合によって架橋される14。コラーゲンは、その独特のスパイラル構造と架橋繊維ネットワークのために、細胞付着をさらに促進するためにマイクロキャリアに混合するためのアジュバントとしてしばしば使用される15,16。
マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップ、インクジェット印刷、およびエレクトロスプレー17、18、19、20、21、22、23が含まれる。マイクロ流体チップは、均一なサイズのマイクロキャリアを製造するのに迅速かつ効率的であることが証明されています24。しかし、この技術は複雑な流路の設計と製造プロセスに依存しています25。インクジェット印刷中の高温または過剰な押出力、ならびにエレクトロスプレーアプローチにおける強烈な電界は、材料の特性、特にその生物学的活性に悪影響を及ぼす可能性がある19。さらに、さまざまな生体材料および直径に適用すると、これらの方法で使用されるカスタマイズされたノズルは、処理の複雑さ、高コスト、および柔軟性の低下を限定する。
マイクロ担体調製のための便利な方法を提供するために、交互粘性慣性力噴射(AVIFJ)と呼ばれる3D印刷技術がヒドロゲルマイクロキャリアを構築するために適用されている。この技術は、垂直振動時に発生する下向きの駆動力と静圧を利用してノズル先端の表面張力を克服し、液滴を形成する。厳しい力や熱条件の代わりに、小さな急激な変位が印刷中にノズルに直接作用し、バイオインクの物理化学的特性にわずかな影響を与え、生物活性材料に大きな魅力をもたらします。AVIFJ法を利用して、直径100~300μmの複数の生体材料のマイクロキャリアの形成に成功しました。その上、マイクロキャリアは、細胞によく結合し、接着した細胞に適切な増殖環境を提供することがさらに証明された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、大規模細胞培養用担体として一般的に使用されています。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の1つとなっており、大規模な細胞増殖の分野で一般的に使用されている。マイクロキャリアはまた、 インビトロ 組織工学構築および臨床薬物スクリーニングにおいてますます重要な役割を果たすことが示されている。マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷が含まれ、これらはしばしば複雑な流路設計、互換性のない二相界面、および固定ノズル形状に依存する。これらの方法は、複雑なノズル加工、不便なノズル交換、および複数のバイオインクに適用した場合の過度の押出力の課題に直面しています。本研究では、直径100~300μmのハイドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、交互粘性慣性力噴射と呼ばれる3Dプリンティング技術を適用した。その後、細胞をマイクロキャリア上に播種し、組織工学モジュールを形成した。既存の方法と比較して、この方法は、幅広い生物活性材料に対して、自由なノズル先端直径、柔軟なノズル切り替え、印刷パラメータの自由な制御、および穏やかな印刷条件を提供する。

さまざまな収束速度と直径のプリントヘッドが製造され、複数のタイプの材料の印刷が実現しました。引っ張り強度の増加に伴って得られたノズルを 図1Bに示す。ノズルは、リザーバ(III)、収縮(II)、およびプリントヘッド(I)の3つの領域に分割された。リザーバはノズルの未処理部分であり、液体が静圧を提供し、印刷用のバイオインク入力を行った。収縮領域は、下向...

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3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

ここでは、ヒドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、粘性慣性力を交互に駆動する穏やかな3D印刷技術を紹介します。自家製ノズルは柔軟性を提供し、異なる材料や直径を簡単に交換できます。直径50〜500μmの細胞結合マイクロ担体を取得し、さらなる培養のために回収することができる。

交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

当社は、良好な制御性と生体適合性を有するマイクロキャリアを調製するための穏やかなバイオプリントプロセスを提供します。細胞による封入後、担体は、インビトロでの細胞増殖および機能的な微小組織構築において使用することもできる。同様の条件下での厳しい力ではなく、限られた変位が印刷プロセス中にノズルに作用し、バイオインクの元の物理的/化学的特性を最大限に維持します。従来のマイクロキャリアに加えて、内部細胞分布またはトリトシン内包カプセル構造を有するユニットを構築し、異なる組織構造の集合に適用することができる。ノズルの準備のために、製造元の指示に従ってガラスマイクロピペットをプーラーにロードし、プーラーの引っ張りパラメータを設定します。マイクロフォージを使用してノズルを指定直径で切断し、実験用の特定の先端直径を求め、ノズルをアルコールで5分間滅菌します。その後、ノズルを滅菌水で3回すすぎ、残留アルコールを除去した。ヒドロゲルバイオインクを調製するために、滅菌した4%アルギン酸ナトリウム原液を0.9%塩化ナトリウムで0.5、1、1.5、および2%体積重量比濃度で希釈する。微小液滴形成のために、5ミリリットルのバイオインクを使い捨ての滅菌シリンジにロードし、シリンジをシリンジポンプに取り付ける。内径1mmのホースを使用して、シリンジと印刷ノズルを接続します。クランプネジを締めてノズルを所定の位置に固定し、シリンジポンプを素早く押し下げてバイオインクをノズルにロードします。信号発生器のパラメータを設定し、必要に応じてドロップするように振動のモーションパスとトリガモードをプリセットします。次に、事前に設計されたパターンに従って液滴を印刷します。マイクロキャリア形成のために、5ミリリットルの架橋溶液をシャーレに加え、ディッシュを基材としての印刷ノズルの下に置く。印刷後、マイクロキャリア懸濁液を遠沈管に移す前に、マイクロキャリアを3分間架橋する。次いで、遠心分離によってマイクロキャリアを濃縮し、1ミリリットル当たり約600マイクロキャリアで適切な培養培地に再懸濁する。接種前に、A549 細胞培養の上清を、10 マイクロモルのセルトラッカー緑色 CMFDA 色素を添加した 5 ミリリットルの無血清培地と交換し、細胞培養インキュベーターで 30 分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、色素溶液を新鮮な培地と交換し、培地1ミリリットルあたり6個の細胞に対して10倍の1.6倍の密度で細胞を再懸濁する。細胞に1ミリリットルのマイクロキャリア懸濁液を加え、低接着性6ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルのA549細胞を加える。プレートを細胞培養インキュベーター内のシェーカー上に毎分30回転で置く。インキュベーションの最後に、プレートをシェーカーから取り出し、マイクロキャリアを30分間沈降させてから、印刷ノズル、ペトリ皿、およびマイクロキャリア接種細胞を明視野および共焦点蛍光顕微鏡で観察および測定します。30マイクロメートルの先端ノズルを使用して、PBS、1.5%アルギン酸塩、1.5%ゼラチンを含む複数種類のバイオインクをペトリ皿に安定して印刷することができます。インクの粘度が上昇するにつれて、印刷プロセスはますます困難になり、より大きな液滴を得るためにより大きな駆動力が必要となる。印刷パラメータは、この印刷実験で観察されるように、液滴を特定の2D配置で印刷するために設定することができる。ノズル先端の直径は、印刷可能なマイクロキャリアのサイズに直接影響する。これらの明視野および共焦点画像で観察されるように、A549細胞は培養の2日後にアルギン酸コラーゲンマイクロキャリアに接着する。6日後、A549セルはマイクロキャリア表面をほぼ完全に覆います。この手順に従って、マイクロキャリア表面をキトサンで被覆し、グルコン酸塩を用いてアルギン酸ゲルを溶解させ、肺胞などの中空構造の構築に適用できる嚢胞構造を形成した。マイクロキャリアを調製するための印刷プロセスは非常に穏やかであり、したがって、この方法は、細胞含有マイクロキャリアの印刷に広く使用することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

強制的に垂直 V ベンドとシステム: 弾性体と剛体の長方形型の 3 Dの in Vitro評価

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3 D プリントのための新規プロセス脱行列

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3 D プリントされた多孔性セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル足場

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

ヒドロゲルベースの3D培養モデルを自動化および標準化された方法で製造するためのオープンソース技術プラットフォーム

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

交互の粘性慣性力噴射によるインビトロヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷