Name: 3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (3212007), el Programa de Investigación Científica de la Iniciativa de la Universidad de Tsinghua (20197050024), el Fondo Spring Breeze de la Universidad de Tsinghua (20201080760), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (51805294), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0703004) y el Proyecto 111 (B17026).

1. Cultivo celular
<ol><li>Complemente el Medio Esencial Mínimo Modificado (H-DMEM) modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de solución de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de penicilina G y estreptomicina, y 1% de suplemento de glutamina como medio de cultivo para células A549.</li>
	<li>Cultivo de células A549 en incubadora de CO2 a 37 °C y con 5% de CO2
</li>
	<li>Disociar las células para el subcultivo utilizando tripsina en aproximadamente el 80% de confluenci...

<ol>
	<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+Achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li><li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems.">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery.">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan:+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus.">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li><li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering:+current+and+future+strategies.">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li><li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation.">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li><li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+thermo/pH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly(N,+N-diethyl+acrylamide)+microcarriers.">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li><li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel/microcarrier+composite.">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science &amp; Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li><li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering.">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li><li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture.">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218 (2002).</li><li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels:+natural,+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds.">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology &amp; Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li><li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li><li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate/collagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer.">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).</li><li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering.">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li><li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells.">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li><li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells.">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li><li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops.">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li><li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform.">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li><li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology.">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science &amp; Engineering. 130, 137-139 (2008).</li><li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules.">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li><li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions:+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position.">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li><li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications.">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li><li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models.">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li><li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials:+a+review+of+current+research+and+applications.">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li><li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems.">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li></ol>

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para la preparación de múltiples tipos de microportadores de hidrogel y la posterior siembra celular. En comparación con los métodos de impresión de chip microfluídico y de inyección de tinta, el enfoque AVIFJ para construir microportadores ofrece una mayor flexibilidad y biocompatibilidad. Una boquilla independiente permite utilizar una amplia gama de boquillas ligeras, incluidas las micropipetas de vidrio, en estos sistemas de impresión. El procesamiento alt...

Los microportadores son perlas con un diámetro de 60-250 μm y una gran superficie específica y se utilizan comúnmente para el cultivo a gran escala de células1,2. Su superficie externa proporciona abundantes sitios de crecimiento para las células, y el interior proporciona una estructura de soporte para la proliferación espacial. La estructura esférica también proporciona conveniencia en el monitoreo y control de parámetros, incluyendo pH, O2 y concentración de nutrientes y metabolitos. Cuando se utilizan en combinación con biorreactores de tanque agitado, los microportadores pueden lograr densidades celulares más altas en un volumen relativamente pequeño en comparación con los cultivos convencionales, proporcionando así una forma rentable de lograr cultivos a gran escala3. La tecnología de cultivo de microportadores se ha convertido en una de las principales técnicas de investigación citológica, y se ha avanzado mucho en el campo de la expansión a gran escala de células madre, hepatocitos, condrocitos, fibroblastos y otras estructuras4. También se ha encontrado que son vehículos ideales de administración de fármacos y unidades de abajo hacia arriba, por lo que asumen un papel cada vez más importante en el cribado clínico de fármacos y la reparación de ingeniería de tejidos in vitro5.
Para cumplir con los requisitos de propiedad mecánica en diferentes escenarios, se han desarrollado múltiples tipos de materiales de hidrogel para su uso en la construcción de microportadoras6,7,8,9,10,11. Los hidrogeles de alginato y ácido hialurónico (HA) son dos de los materiales de microportadora más utilizados debido a su buena biocompatibilidad y reticulabilidad12,13. El alginato puede ser fácilmente reticulado por cloruro de calcio, y sus propiedades mecánicas pueden ser moduladas cambiando el tiempo de reticulación. La HA conjugada con tiramina está reticulada por el acoplamiento oxidativo de las partes de tiramina catalizadas por peróxido de hidrógeno y peroxidasa de rábano picante14. El colágeno, debido a su estructura espiral única y a su red de fibras reticuladas, se utiliza a menudo como adyuvante para mezclarse en los microportadores para promover aún más la unión celular15,16.
Los métodos actuales para preparar microportadores incluyen chips microfluídicos, impresión de inyección de tinta y electropulverización17,18,19,20,21,22,23. Se ha demostrado que los chips microfluídicos son rápidos y eficientes en la producción de microportadores de tamaño uniforme24. Sin embargo, esta tecnología se basa en un complejo proceso de diseño y fabricación de canales de flujo25. Las fuerzas de extrusión excesivas o de alta temperatura durante la impresión por inyección de tinta, así como los intensos campos eléctricos en el enfoque de electropulverización, pueden afectar negativamente las propiedades del material, especialmente su actividad biológica19. Además, cuando se aplican a varios biomateriales y diámetros, las boquillas personalizadas utilizadas en estos métodos dan como resultado una complejidad de procesamiento limitada, un alto costo y una baja flexibilidad.
Para proporcionar un método conveniente para la preparación de microportadores, se ha aplicado una técnica de impresión 3D llamada chorro de fuerzas viscosas-inerciales alternas (AVIFJ) para construir microportadores de hidrogel. La técnica utiliza fuerzas motrices hacia abajo y presión estática generada durante la vibración vertical para superar la tensión superficial de la punta de la boquilla y así formar gotas. En lugar de fuerzas severas y condiciones térmicas, pequeños desplazamientos rápidos actúan directamente sobre la boquilla durante la impresión, causando un efecto menor en las propiedades fisicoquímicas de la biotinta y presentando una gran atracción por los materiales bioactivos. Utilizando el método AVIFJ, se formaron con éxito microportadores de múltiples biomateriales con diámetros de 100-300 μm. Además, se demostró además que los microportadores se unen bien a las células y proporcionan un entorno de crecimiento adecuado para las células adheridas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>Human non-small cell lung cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipettes</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>b150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase powder</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic agent</td>
			<td>3M</td>
			<td>PN7026</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions and use after dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forge device</td>
			<td>narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids, NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G and streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen solution from rat tail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d printing of in vitro hydrogel microcarriers by alternating viscous-inertial force jetting

Los microportadores son perlas con un diámetro de 60-250 μm y una gran superficie específica, que se utilizan comúnmente como portadores para cultivos celulares a gran escala. La tecnología de cultivo de microportadores se ha convertido en una de las principales técnicas en la investigación citológica y se utiliza comúnmente en el campo de la expansión celular a gran escala. También se ha demostrado que los microportadores desempeñan un papel cada vez más importante en la construcción de ingeniería de tejidos in vitro y la detección clínica de fármacos. Los métodos actuales para preparar microportadoras incluyen chips microfluídicos e impresión de inyección de tinta, que a menudo se basan en un diseño de canal de flujo complejo, una interfaz bifásica incompatible y una forma de boquilla fija. Estos métodos enfrentan los desafíos del procesamiento complejo de boquillas, cambios inconvenientes en las boquillas y fuerzas de extrusión excesivas cuando se aplican a múltiples biotintas. En este estudio, se aplicó una técnica de impresión 3D, llamada chorro de fuerza viscoso-inercial alterna, para permitir la construcción de microportadores de hidrogel con un diámetro de 100-300 μm. Posteriormente, las células se sembraron en microportadores para formar módulos de ingeniería de tejidos. En comparación con los métodos existentes, este método ofrece un diámetro de punta de boquilla libre, conmutación de boquilla flexible, control libre de los parámetros de impresión y condiciones de impresión suaves para una amplia gama de materiales bioactivos.

Se fabricaron cabezales de impresión de variadas tasas de convergencia y diámetros para lograr la impresión de múltiples tipos de materiales. Las boquillas obtenidas con el aumento de la fuerza de tracción se muestran en la Figura 1B. Las boquillas se dividieron en tres áreas: reservorio (III), contracción (II) y cabezal de impresión (I). El depósito era la parte no procesada de la boquilla, en la que el líquido proporcionaba presión estática y entrada de biotinta para la impresi...

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3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Aquí se presenta una técnica de impresión 3D suave impulsada por fuerzas viscosas-inerciales alternas para permitir la construcción de microportadores de hidrogel. Las boquillas caseras ofrecen flexibilidad, lo que permite un fácil reemplazo para diferentes materiales y diámetros. Se pueden obtener y recolectar microportadores de unión celular con un diámetro de 50-500 μm para su posterior cultivo.

Impresión 3D de microportadores de hidrogel in vitro mediante chorro de fuerza viscoso-inercial alternado

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Ofrecemos un proceso bioimpreso suave para la preparación de microportadores con una buena controlabilidad y biocompatibilidad. Después de la encapsulación por células, los portadores también se pueden utilizar en la expansión celular in vitro y la construcción de microtejidos funcionales. El desplazamiento limitado, en lugar de fuerzas severas en condiciones similares, actúa sobre la boquilla durante el proceso de impresión, manteniendo las propiedades físicas / químicas originales de la biotinta en la máxima medida.Además de los microportadores convencionales, se pueden construir unidades con distribución celular interna o estructuras de cápsulas encapsuladas en tritosina y aplicarlas al ensamblaje de diferentes estructuras tisulares. Para la preparación de la boquilla, cargue micropipetas de vidrio en el extractor de acuerdo con las instrucciones del fabricante y establezca los parámetros de tracción para el extractor. Use una microtorra para cortar la boquilla en el diámetro designado para obtener el diámetro de punta específico para el experimento, y esterilize la boquilla en alcohol durante cinco minutos.Luego, enjuague la boquilla tres veces con agua estéril para eliminar cualquier residuo de alcohol. Para preparar la biotinta de hidrogel, diluya la solución madre de alginato de sodio al 4% esterilizada en cloruro de sodio al 0,9% a concentraciones de 0,5, 1, 1,5 y 2% en peso por volumen. Para la formación de microgotas, cargue cinco mililitros de biotinta en una jeringa estéril desechable e instale la jeringa en una bomba de jeringa.Con una manguera de un milímetro de diámetro interior, conecte la jeringa y la boquilla de impresión. Apriete el tornillo de sujeción para asegurar la boquilla en su lugar y presione rápidamente la bomba de jeringa para cargar la biotinta en la boquilla. Ajuste los parámetros del generador de señal y preestablezca la trayectoria de movimiento y el modo de disparo de la vibración para que caiga bajo demanda.A continuación, imprima las gotas siguiendo los patrones prediseñados. Para la formación de microportadores, agregue cinco mililitros de solución de reticulación a una placa de Petri y coloque el plato debajo de la boquilla de impresión como sustrato. Después de imprimir, reticule las microportadoras durante tres minutos antes de transferir la suspensión de la microportadora a un tubo de centrífuga.Luego, enriquezca los microportadores por centrifugación y resuspóndalos en un medio de cultivo apropiado a aproximadamente 600 microportadores por mililitro. Antes de su inoculación, reemplace el sobrenadante de un cultivo celular A549 con cinco mililitros de medio libre de suero complementado con colorante CMFDA verde rastreador de células 10 micromolares para una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, reemplace la solución de colorante con medio fresco y vuelva a suspender las células a una densidad de 1.6 veces 10 a las seis células por mililitro de medio.Agregue un mililitro de suspensión de microportador a las células y un mililitro de células A549 a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos de baja adherencia. Coloque la placa en un agitador en la incubadora de cultivo celular a 30 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, retire la placa del agitador y permita que los microportadores se asienten durante 30 minutos antes de observar y medir la boquilla de impresión, las placas de Petri y las células inoculadas por microscopía de fluorescencia de campo brillante y confocal.Usando una boquilla de punta de 30 micrómetros, se pueden imprimir de manera estable múltiples tipos de biotinta, incluyendo PBS, 1.5% de alginato y 1.5% de gelatina en placas de Petri. A medida que las tintas aumentan en viscosidad, el proceso de impresión se vuelve cada vez más difícil y se necesitan mayores fuerzas motrices para obtener gotas más grandes. Los parámetros de impresión se pueden configurar para imprimir las gotas en arreglos 2D específicos, como se observa en este experimento de impresión.El diámetro de la punta de la boquilla tiene un impacto directo del tamaño del microportador que se puede imprimir. Como se observa en estas imágenes de campo brillante y confocales, las células A549 se adhieren a los microportadores de alginato-colágeno después de dos días de cultivo. Después de seis días, las células A549 cubren casi por completo las superficies del microportador.Después de este procedimiento, hemos recubierto la superficie del microportador con quitosano y hemos utilizado gluconato para disolver el gel de alginato para formar una estructura quística que se puede aplicar para construir estructuras huecas como los alvéolos. El proceso de impresión para preparar microportadoras es bastante suave, por lo tanto, este método puede ser ampliamente utilizado para imprimir microportadoras que contienen células.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Investigación

Bioingeniería

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Sistema Vertical V-se dobla la fuerza: una evaluación 3D In Vitro de arcos rectangulares rígidos y elásticos

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Novedoso proceso para la impresión 3D Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D impreso celulosa poroso nanocompuesto hidrogel andamios

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...