Name: single myofiber culture assay for the assessment of adult muscle stem cell functionality ex vivo
Uploaded: 2021-02-15T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए क्रिस्टीन Poser और क्रिस्टीना बीनने का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट से जेवीएम (एमए-3975/2-1), कार्ल ज़ीस फाउंडेशन और ड्यूश क्रेशहिल्फे (डीकेएच-जेवीएम-861005) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

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लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

यहां, इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग करके एमयूएससी में एक विशिष्ट जीन की भूमिका की कार्यात्मक रूप से जांच करने की एक विधि प्रस्तुत की गई है। महत्वपूर्ण बात, यहां वर्णित प्रणाली में MuSCs स्थितियों में सुसंस्कृत हैं, जो वीवो स्थिति में जितना संभव हो उतना समान है जो अपने आला के साथ MuSCs की अधिकांश बातचीत को संरक्षित करता है। यह अस्थायी परिस्थितियों और लगातार सिराना ट्रांसफैक्शन के तहत अपने आसन्न MuSCs के साथ अलग myofibers खेती द्वारा पूरा किया जाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के माध्यम से संस्कृति के ७२ घंटे के दौरान मायोफाइबर अलगाव, सिरर्ना ट्रांसफैक्शन और म्यूएससी आबादी की जांच की प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया था कि सभी MuSCs के लगभग ७४% संस्कृति के 30 घंटे के बाद एक फ्लोरोसेंटी लेबल नियंत्रण सिरना से संक्रमित थे ।
ईडीएल मांसपेशियों के सावधानीपूर्वक विच्छेदन पर विशेष ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए क्योंकि व्यापक खींचना, चुटकी लेना या फैलाएंगे जिससे मिओफिबर की संकुचन और लगातार मृत्यु हो जाएगी। इसके अलावा, प्रति शर्त प्रति दोहराने के लिए कम से कम 20 विभिन्न मायोफिबर से MuSCs के समूहों की जांच करना महत्वपूर्ण है। यह आवश्यक है क्योंकि म्यूएससी की संख्या और गुण म्यूएससी उपआबादी के अस्तित्व के कारण भिन्न होते हैं। फ्लोटिंग माइफइबर कल्चर विधि का उपयोग करके म्यूएससी पर एक विशिष्ट सिरना के प्रभाव की जांच करते समय गैर-लक्षित नियंत्रण के लिए लक्षित सिरना के साथ स्थिति की तुलना एक ही माउस और मांसपेशियों के भीतर की जानी चाहिए। यह माउस-विशिष्ट मतभेदों से बचने के लिए अनुशंसित है जो सिरएनए के प्रभावों को कवर या बढ़ा सकता है। नॉकडाउन दक्षता को उनके आसन्न MuSCs के साथ एकल myofibers का उपयोग कर लक्ष्य जीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यदि यह एक विकल्प नहीं है, तो कोई भी प्राथमिक मायोब्लास्ट में सिरना नॉकडाउन दक्षता का परीक्षण कर सकता है जिसके बाद मात्रात्मक आरटी-पीसीआर या इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण होते हैं। सिंगल माइफबर्स पर म्यूएससी पर सिरना के प्रभाव का विश्लेषण करने से पहले सिरना की दक्षता निर्धारित की जानी चाहिए। एक स्मार्ट पूल का उपयोग जिसमें 4 अलग-अलग सीआरएएनए बनाम एक एकल शामिल है, नॉकडाउन दक्षता को बढ़ाता है लेकिन अविशिष्ट लक्ष्यीकरण का खतरा भी बढ़ाता है। एक गैर-लक्षित सिराना को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ट्रांसफेक्शन दक्षता की सीधे निगरानी करने के लिए, कोई भी फ्लोरोसेंटी लेबल वाले गैर-लक्षित सिरना का उपयोग कर सकता है जैसा कि यहां किया जाता है। सिरना के साथ ट्रांसफैक्शन के लिए समय बिंदु अलगाव के बाद लगभग 4 घंटे है, एक समय बिंदु जब MuSCs के आसपास बेसल लैमिना पहले से ही सिरना के लिए पारगम्य है । यदि 72 या 96 घंटे के बाद एमयूएससी पर एक विशिष्ट सिराना के प्रभाव की जांच की जानी चाहिए, तो उच्च नॉकडाउन दक्षता बनाए रखने के लिए 24 एच या 48 एच के बाद दूसरा सिरना ट्रांसफैक्शन करने की सिफारिश की जाती है।
myofiber संस्कृति परख पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों के साथ MuSCs की जांच की तुलना में विविध लाभ प्रदर्शित करता है । MuSCs पूरी अलगाव प्रक्रिया के दौरान myofibers से जुड़ा रहता है, जिससे अपने आला19,23, 24,25के साथ MuSC की महत्वपूर्ण बातचीत को संरक्षित करता है। मायोफिबर के साथ MuSCs की संरक्षित बातचीत MuSC कार्यक्षमता पर आला निर्भर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है, जिसे पारंपरिक 2डी मायोब्लास्ट संस्कृतियों में पुन: स्थापित नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उम्र बढ़ने के दौरान एमयूएससी प्रदर्शित करने से मायोजेनिक क्षमता बिगड़ी जिसके परिणामस्वरूप20,26को नुकसान पहुंचाने के बाद मांसपेशियों के ऊतकों को पुनर्जीवित करने की दक्षता कम हो जाती है । यह हानि कम से कम आंशिक रूप से एमयूएससी आला में परिवर्तन के कारण होती है, ईसीएम संरचना27,28में विशेष परिवर्तन। माइोफिबर संस्कृति प्रोटोकॉल इन गुमराह आला परिवर्तनों के साथ अध्ययन और हस्तक्षेप की अनुमति देता है।
यहां वर्णित विधि के विपरीत, इम्यूनोलेबेलिंग द्वारा एमयूएससी की शुद्धि और FACS (फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई) या एमएसीएस (चुंबकीय सेल छंटाई) जैसी तकनीकों को छांटने में एमयूएससी को उनके आला से हटाना शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि वृद्ध मांसपेशियों से अलग-थलग पड़े म्यूएससी की 2डी संस्कृतियां अपने बाह्य संकेतों को ढीला कर देती हैं और युवा मांसपेशियों से अलग किए गए MuSCs के समान व्यवहार करती हैं जिससे वीवो स्थिति में उचित रूप से29का पुनर्मूल्यांकन नहीं होता है। इसके अलावा , मांसपेशियों के ऊतकों का पूर्ण विघटन और सतह के मार्कर के साथ म्यूएससी की लेबलिंग के परिणामस्वरूप 30 ,31,32कोशिकाओं में प्रतिलिपि परिवर्तन और सक्रियता होती है। माइफइबर संस्कृति प्रणाली का एक और लाभ विभिन्न स्तरों पर MuSC कार्यक्षमता के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना है। सुसंस्कृत myofibers पर MuSCs के हेरफेर प्रभावी ढंग से सिरना मध्यस्थता जीन नॉकडाउन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के रूप में यहां विस्तार से वर्णित है । इसी तरह, रासायनिक यौगिकों का उपयोग या पुनः संयोजन प्रोटीन की डिलीवरी स्टेम सेलपाथवे 20,28के साथ हस्तक्षेप करने के लिए बहुत प्रभावी है। इसके अलावा, रेट्रो या लेंटिवल अभिव्यक्ति वैक्टर एक्सोजेनस जीन, यानी संविलियन सक्रिय म्यूटेंट33की शुरूआत की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित प्रणाली में म्यूएससी कार्यक्षमता पर बाह्य कारकों के प्रभाव का पता लगाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संस्कृति की स्थिति को विभिन्न शारीरिक या रोग स्रोतों से कैंसर कैशेक्सिया34, 35जैसे मॉडल विभिन्न राज्यों में सुपरनेट के साथ पूरक किया जा सकता है।
यहां वर्णित विधि की एक सीमा तथ्य यह है कि एकल माइोफिबर संस्कृति प्रणाली सभी प्रणालीगत कारकों या म्यूएससी पर अन्य सेल प्रकारों के प्रभाव के प्रभाव को पूरी तरह से पुन: कृत नहीं कर सकती है। इसके अलावा, जिस समय में मायोफिबरर्स को संस्कृति में व्यवहार्य रखा जा सकता है, वह सीमित है और इसलिए म्यूएससी से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन सक्रियण और मायोजेनिक प्रतिबद्धता जैसी शुरुआती घटनाओं पर केंद्रित है । इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं या फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं जैसी अन्य आला कोशिकाओं के साथ म्यूएससी इंटरैक्शन की जांच संभव नहीं है। एमयूएससी कार्यक्षमता पर प्रणालीगत प्रभावों की जांच करने के लिए कोई भी व्यक्ति मांसपेशियों की चोट के प्रयोगों को अंजाम दे सकता है जिसके बाद वीवो में मांसपेशियों के उत्थान का विश्लेषण किया जा सकता है या प्रत्यारोपण प्रयोग36,37कर सकते हैं ।
एक साथ लिया, myofiber अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की आवश्यकता के बिना वयस्क MuSCs पर आनुवंशिक या मशीनी अध्ययन के लिए महान अवसर प्रदान करता है और संभवतः पशु प्रयोग को कम कर सकते हैं ।

वयस्क में कंकाल की मांसपेशी मुख्य रूप से बहुनीय मायोफिबर से बना एक पोस्टमिटोटिक ऊतक है, जो स्वैच्छिक आंदोलनों के लिए प्रभावक कोशिकाएं हैं। इसमें पुनर्जीवित करने की एक उल्लेखनीय क्षमता है, एक प्रक्रिया जो भ्रूणीय मायोजेनेसिस जैसा दिखता है और उम्र और रोग में हानि से गुजरता है1। कंकाल की मांसपेशियों की यह हड़ताली पुनर्योजी क्षमता मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) पर निर्भर करती है, जिन्हें सारकोलम्मा और मायोफिबर2, 3के बेसल लैमिना के बीच उनके स्थान के कारण उपग्रह कोशिकाएं भी कहाजाताहै। विश्राम की स्थिति में एमयूएससी शांत होते हैं और इसकी विशेषता है कि ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पैक्स 7 और क्विसेंस मार्कर जैसे स्प्राउट14,5 ,6,7,8की अभिव्यक्ति होती है । सक्रियण पर, उदाहरण के लिए, चोट के बाद, MuSCs शांत राज्य छोड़ दें और मायोजेनिक नियामक कारक मायोडी 9 को बढ़ादें। पैक्स7/मायोड डबल पॉजिटिव एमयूएससी पैदा होते हैं और अंतर करते हैं जिससे मायोजेनिक अग्रदूत कोशिकाएं पैदा होती हैं, जिन्हें अक्सर मायोब्लास्ट के रूप में भी जाना जाता है । वे मायोब्लास्ट तो आगे विस्तारित मायोसाइट्स में अंतर करते हैं, एक प्रक्रिया जो आणविक और रूपात्मक परिवर्तनों के साथ मेल खाता है, उदाहरण के लिए, पैक्स 7 का नुकसान और मायोजिनिन अभिव्यक्ति10का अपरेगुलेशन। Myocytes तो अंततः एक दूसरे को फ्यूज या मौजूदा myofibers जिससे क्षतिग्रस्त ऊतक की मरंमत । महत्वपूर्ण बात यह है कि मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश मायओडी अपरेगुलेशन को वापस करता है और11को आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम है। पैक्स 7, मायोडी और मायोजेनिन10जैसे मायोजेनिक मार्कर की जांच से म्यूएससी भेदभाव और मायोजेनिक प्रगति की स्थिति को आसानी से देखा जा सकता है।
अपने निकटवर्ती MuSCs के साथ एकल myofibers की संस्कृति एक पूर्व वीवो सेटिंग में MuSC कार्यक्षमता की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है क्योंकि MuSCs अपने अंतर्जात आला12,13में शेष हैं । एमयूएससी के व्यवहार को आंतरिक संकेतों के साथ-साथ आला द्वारा प्रदान किए गए बाह्य संकेतों द्वारा विनियमित किया जाता है, एक विशेष शारीरिक स्थान जिसमें एमयूएससी और माइफइबर के आसपास के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के घटक शामिल होते हैं। उदाहरण के लिए, MuSC quiescence के बाह्य नियामकों में से एक पायदान संकेत है । यहां, म्यूएससी द्वारा मायोफाइबर और ईसीएम14, 15, 16दोनों से सिग्नलिंग संकेत प्राप्तहोतेहैं। इसके अलावा, म्यूएससी आला एमयूएससी के विभाजन धुरी को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है इस प्रकार MuSC बेटी कोशिकाओं के सेल भाग्य को विनियमित17,18। यथोचित, असममित MuSC डिवीजनों, मायोजेनिक प्रगति और आत्म नवीकरण जैसे मापदंडों विशिष्ट इस प्रयोगात्मक सेटअप में मूल्यांकन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक बहुकोशिकीय क्लस्टर 72 घंटे की संस्कृति अवधि के बाद एक म्यूएससी से उत्पन्न हो सकता है, जिसकी जांच अलग-अलग मायोजेनिक आबादी जैसे स्वयं-नवीनीकरण, प्रसार और आगे विभेदित एमयूएससी8,19,20, 21के प्रतिशत के लिए की जा सकती है। एमयूएससी की विभेदन स्थिति पैक्स7, मायोड और मायोजिन की अभिव्यक्ति/सह-अभिव्यक्ति की जांच से निर्धारित की जा सकती है । संस्कृति के ७२ घंटे के बाद एक क्लस्टर में कोशिकाओं को निम्नलिखित मापदंडों द्वारा भेदभाव किया जा सकता है: पैक्स7 केवल कोशिकाओं को स्वयं MuSCs नवीनीकरण कर रहे हैं, जबकि Pax7/MyoD डबल सकारात्मक कोशिकाओं का प्रसार कर रहे है/सक्रिय MuSCs और आगे विभेदित मायोजेनिक कोशिकाओं Myogenin सकारात्मक22हैं । इसके अलावा, एमयूएससी संख्या या कोशिका चक्र/सक्रियण में पुनः प्रवेश की जांच मायोजेनिक प्रगति के अलावा की जा सकती है, उदाहरण के लिए, ऊपर वर्णित मापदंडों के आधार पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विश्लेषणों के माध्यम से ।
यहां, मायोफिबर अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषताएं, उदाहरण के लिए, अपने आला के साथ MuSC की बातचीत के संरक्षण का वर्णन किया गया है। माउस पूरे ईडीएल(एक्सटेंसर डिजोरम लांगस)मांसपेशियों को ध्यान से विच्छेदित किया जाता है, कोलेजनेस द्वारा पचाया जाता है, और आगे की संस्कृति के लिए अपने जुड़े म्यूएससी के साथ एकल माइफबरर्स प्राप्त करने के लिए शारीरिक रूप से त्रिसंरित होता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक जानवरों की आवश्यकता के बिना उम्मीदवार जीन और लगातार इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित विश्लेषणों के कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए सिरना के साथ MuSCs को ट्रांसफेक्ट करने के कदमों को चित्रित करता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>A-21141</td>
			<td>use 1:1000 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>A-21123</td>
			<td>use 1:1000 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken embryo extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td>chicken embryo extract containing growth factors etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with 4.5&#160;g/l glucose and sodium pyruvate)</td>
			<td>GibCo</td>
			<td>41966029</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoD antibody clone G-1</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-377460</td>
			<td>dilute 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>PAX7</td>
			<td>use undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO Red Transfection Indicator</td>
			<td>horizon discovery</td>
			<td>D-001630-02-05</td>
			<td>non targeting siRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single myofiber culture assay for the assessment of adult muscle stem cell functionality ex vivo

वयस्क कंकाल मांसपेशी ऊतक एक स्टेम सेल आबादी है कि अपनी को पुनर्जीवित करने की क्षमता के लिए अपरिहार्य है बंदरगाहों । मांसपेशियों की क्षति पर, मांसपेशी स्टेम सेल अपने शांत राज्य छोड़ दें और मायोजेनिक कार्यक्रम को सक्रिय करते हैं जिससे अंततः मांसपेशियों के स्टेम सेल पूल की भरपाई के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत होती है। विभिन्न कारक मांसपेशियों की स्टेम सेल गतिविधि को प्रभावित करते हैं, उनमें से आंतरिक उत्तेजनाएं लेकिन प्रत्यक्ष मांसपेशी स्टेम सेल वातावरण, स्टेम सेल आला से भी संकेत मिलता है। अलगाव और उनके जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के साथ एकल myofibers की संस्कृति अपने आला के साथ स्टेम सेल की बातचीत के सबसे बरकरार रखता है और इसलिए, निकटतम संभावना मांसपेशी स्टेम सेल कार्यक्षमता पूर्व वीवो का अध्ययन करने के लिए है । यहां, माउस ईडीएल(एक्सटेंसर डिजॉरमल लॉन्गस)मांसपेशियों से अपने संबंधित मायोफिबर पर मांसपेशियों के स्टेम कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, सिरना ट्रांसफैक्शन और इम्यूनोस्टेपिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। यहां उल्लिखित प्रायोगिक स्थितियां वीवो पशु प्रयोगों में अंतर्निहित आवश्यकता के बिना मायोजेनिक गतिविधि की जांच सहित मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन और हेरफेर की अनुमति देती हैं।

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Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

इस प्रोटोकॉल में मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के लिए एक इन विट्रो संस्कृति और कार्यात्मक विश्लेषण विधि का वर्णन किया गया है, जो उनके अंतर्जात आला के साथ उनकी अधिकांश बातचीत को बरकरार रखता है।

वयस्क मांसपेशी स्टेम सेल कार्यक्षमता पूर्व वीवो के मूल्यांकन के लिए एकल Myofiber संस्कृति परख

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

मांसपेशियों स्टेम कोशिकाएं अपने अंतर्जात आला से जुड़ी रहती हैं और उदाहरण के लिए, siRNA अभिकर्मक के माध्यम से आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। यह विधि एक सेटिंग में संस्कृति में मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं का विश्लेषण करना संभव बनाती है जो आला को संरक्षित करके मानक 2 डी संस्कृति मॉडल की तुलना में इन-विवो स्थिति से अधिक निकटता से मिलती-जुलती है। एक हीरे की कलम के साथ बाँझ पास्चर पिपेट्स को काटकर शुरू करें।प्रत्येक माउस के लिए, लगभग 0.3 सेंटीमीटर के उद्घाटन और लगभग 10 से 12 सेंटीमीटर की लंबाई के साथ एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग करें और लगभग 0.1 सेंटीमीटर के छोटे से उद्घाटन और लगभग 22 सेंटीमीटर की लंबाई के साथ एक दूसरा ग्लास पिपेट। कोमल आंदोलन के साथ पांच से 10 सेकंड के लिए एक Bunsen बर्नर की लौ में पिपेट युक्तियों को पकड़कर दोनों पिपेट्स के किनारों को चिकना करना। उपयोग से तुरंत पहले, पांच मिनट के लिए घोड़े के सीरम के 2 मिलीलीटर के साथ पूरे पिपेट को भरकर बाँझ घोड़े के सीरम के साथ दोनों पिपेट्स को कोट करें, फिर घोड़े के सीरम को इंजेक्ट करें और पिपेट्स को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें।70% इथेनॉल के साथ माउस के सभी उपकरणों और हिंद अंगों को स्प्रे करें। त्वचा को हटाने और अंतर्निहित मांसपेशियों को उजागर करने के लिए कठोर ठीक घुमावदार कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करें। अंतर्निहित मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना ठीक घुमावदार संदंश के साथ आसपास के प्रावरणी को हटा दें।टिबिलिस पूर्वकाल या टीए को हटाने के लिए, संदंश के साथ डिस्टल टीए कण्डरा को पकड़ो और इसे ठीक कैंची के साथ काट लें। कण्डरा पर टीए को पकड़ते समय, इसे घुटने की ओर खींचें और ईडीएल मांसपेशी को उजागर करने के लिए घुटने के करीब मांसपेशियों को काट दें। घुमावदार संदंश के साथ डिस्टल ईडीएल कण्डरा उठाएं और ठीक Vannas वसंत कैंची के साथ कटौती करें।ध्यान से घुटने की ओर ईडीएल खींचकर समीपस्थ ईडीएल कण्डरा को बेनकाब करें। फिर कैंची के साथ समीपस्थ कण्डरा काटें। एक परिसंचारी पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूब में ईडीएल मांसपेशियों को इनक्यूबेट करें।पाचन को रोकें जब मांसपेशियां ढीली हो जाती हैं और एकल मील फाइबर दिखाई देते हैं। एक हीटिंग प्लेट से सुसज्जित एक बाँझ दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत काम करने से मांसपेशियों को बड़े बोर पिपेट का उपयोग करके गर्म अलगाव माध्यम के साथ फ्लश किया गया। बड़े बोर पिपेट के साथ मांसपेशियों को अलग करें जब तक कि मायोफाइबर की वांछित संख्या समाधान में स्वतंत्र रूप से तैर रही न हो।मलबे को धोने के लिए, गैर-अनुबंधित मायोफाइबर को अलगाव माध्यम से भरे दूसरे कुएं में स्थानांतरित करने के लिए छोटे बोर ग्लास पिपेट का उपयोग करें। फिर 50 से 100 गैर-अनुबंधित मायोफाइबर को मायोफाइबर संस्कृति माध्यम से भरे 24 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। 72 से 96 घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर मायोफाइबर को इनक्यूबेट करें।मायोफाइबर अलगाव के चार घंटे बाद मायोफाइबर से जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें। 25 माइक्रोलीटर ऑप्टी-एमईएम के साथ एसआईआरएनए की संबंधित मात्रा के साथ ऑप्टी-एमईएम के 25 माइक्रोलीटर को संयोजित करें जिसमें अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.5 माइक्रोलीटर होते हैं। पांच मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें और इसे 24 अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं में जोड़ें।फिर समय के सम्मान के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। Immunofluorescent धुंधला प्रोटोकॉल के केवल महत्वपूर्ण चरणों यहाँ प्रदर्शित कर रहे हैं. ध्यान से, कुएं में कुछ समाधान छोड़ते समय मायोफाइबर संस्कृति माध्यम को छोड़ दें।उनके आसन्न मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के साथ मायोफाइबर को ठीक करने के लिए 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। supernatant को ध्यान से निकालें और पीबीएस के साथ तीन बार मायोफाइबर को धोएं।द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद इनक्यूबेशन चरणों के दौरान tinfoil के साथ प्लेट को कवर करें। एक माइक्रोस्कोपिक ग्लास स्लाइड पर एक सर्कल खींचने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें। फिर myofibers को स्लाइड पर संभव सबसे छोटी मात्रा में स्थानांतरित करें और उन्हें तितर-बितर करें।छोटे बोर पाश्चर पिपेट या 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ अवशिष्ट तरल को हटा दें। जलीय बढ़ते माध्यम की दो बूँदें का उपयोग करें और एक कवर पर्ची के साथ myofibers कवर. फिर स्लाइड को सूखने की अनुमति दें और उन्हें अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण के बाद।यह प्रोटोकॉल म्यूरीन ईडीएल मांसपेशियों से एकल मायोफाइबर की व्युत्पत्ति और संस्कृति को दर्शाता है। Pax7 के लिए immunofluorescent धुंधला मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं के नाभिक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। आवर्धित क्षेत्र अपने आसन्न मांसपेशी स्टेम सेल के साथ मायोफाइबर को उजागर करता है और एक मांसपेशी स्टेम सेल के नाभिक में PAX7 immunofluorescence संकेत को प्रदर्शित करता है।मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं मायोजेनिक प्रगति मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। Pax7 की उपस्थिति और MyoD अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति ताजा अलग मायोफाइबर की quiescent मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है। मायोडी अभिव्यक्ति मांसपेशियों के स्टेम कोशिकाओं के प्रसार में देखी जा सकती है।72 घंटों के बाद, मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाएं विभिन्न मायोजेनिक राज्यों के साथ संतानों के समूह बनाती हैं, जो विभिन्न मायोजेनिक मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा समानांतर होती हैं। Pax7 केवल कोशिकाएं स्वयं-नवीनीकृत स्टेम कोशिकाएं हैं। Pax7 और MyoD डबल सकारात्मक कोशिकाओं proliferating रहे हैं.जबकि मायो डी केवल कोशिकाएं कोशिकाओं को अलग कर रही हैं। मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के siRNA अभिकर्मक ने एक दानेदार फैशन में साइटोप्लाज्मिक siRNA के संचय को दिखाया जो कुशल अपटेक का संकेत देता है। प्रति मायोफाइबर ट्रांसफेक्टेड पैक्स 7 सकारात्मक कोशिकाओं के परिमाणीकरण से पता चला कि 30 घंटे के बाद ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की संख्या 74% तक बढ़ गई है, जिसमें मांसपेशियों की स्टेम सेल संख्याओं पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ता है।इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, किसी भी क्षति का कारण बने बिना ईडीएल को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। siRNA अभिकर्मक के अलावा, ट्रांसजेनिक जानवरों का विश्लेषण या पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ इनक्यूबेशन उनके आसन्न मायोफाइबर पर मांसपेशियों के स्टेम कोशिकाओं के आगे के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए संभव है।

Research

JoVE Journal

Biology

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