Name: single myofiber culture assay for the assessment of adult muscle stem cell functionality ex vivo
Uploaded: 2021-02-15T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
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私たちは、優れた技術支援と原稿の批判的な読書のためにクリスティン・ポーザーとクリスティーナ・ピッカーに感謝します。この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフトからJvM(MA-3975/2-1)、カール・ツァイス財団、ドイツ・クレブシルフェ(DKH-JvM-861005)への助成金によって支えられました。

動物の犠牲は、動物実験のための国の規則に従って行われなければなりません。ここで説明するプロトコルは、ライプニッツ老化研究所フリッツ・リップマン研究所と欧州連合(EU)指令2010/63/EU(臓器収穫のためのライセンス番号:O_JvM_18-20)のガイドラインに従って行われました。プロトコルの重要な手順を 図 1にまとめています。
1. 培養プレート、メディア、パスツールピペットの製造
注:単一のミオファイバーを分離し培養するために必要なすべての材料および機器は、可能な限り無菌である必要があります。したがって、半滅菌解剖フードの下で単一のミオファイバーを分離することが推奨されます。
<ol><li>滅菌HS(馬血清)を使用して、組織培養プレートをコーティングします。コーティングは、プラスチック表面への単一のミオファイバーの付着を防ぎます。各マウスに対して、分離用の12ウェルプレートの4つの井戸と、培養用の24ウェルプレートの専用の数のウェルが必要です。1mLの12ウェルプレートのウェルと、RT(室温)で5分間HSの0.5mLの24ウェルプレートのウェルをインキュベートし、HSを取り除き、プレートをさらに5分間乾燥させます。 注:HSは、無菌を保持する場合、複数回、コーティング目的のために収集し、再利用することができます。</li>
	<li>DMEM(ダルベックの修飾イーグル培地に4.5 g/Lグルコースとピルビン酸ナトリウム)を20%FBS(ウシ胎児血清)で補い、フィルター0.22μmフィルターでフィルターを使用して、ミオファイバー分離培地を準備します。分離プレート(12ウェルプレート、2~4 mL分離培地)に培地を加え、約30分前に分離し、5%CO2で加湿した37°Cインキュベーターで平衡化します。</li>
	<li>DMEM(ダルベッコの修飾イーグル培地に4.5 g/Lグルコースとピルビン酸ナトリウム)を20%FBS(ウシ胎児血清)と1%鶏胚抽出物で補い、0.22μmフィルターを通してフィルターを行い、ミオファイバー培養培地を調製します。0.5 mL培地を、分離の約30分前にプレコートされた培養プレート(24ウェルプレート)の各ウェルに加え、5%CO2で加湿した37°Cインキュベーターで平衡化する。</li>
	<li>コラゲラーゼ消化液を、0.2%(w/v)コラゲラーゼ1型( クロストリジウムヒストリチカムから)をDMEM(ダルベッコの修飾イーグル培地4.5 g/Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム)に溶解し、0.22μmフィルターで濾過して調製します。2つのEDL(伸張ジジゴラムロンス)筋肉の場合、無菌15 mL反応チューブ内で2.5 mLコラゲターゼ溶液を使用します。さらに、溶液を37°Cの循環水浴で約10分前加熱してから、分離を開始する。</li>
	<li>コラゲナーゼ消化筋肉のトリチュレーションのために無菌パスツールピペットを準備します。ダイヤモンドペンを使ってパスツールのピペットを切ります。<ol>
<li>各マウスに対して、約0.3cmの開口部と約10〜12cmの長さの大きなボアピペット1個と、約0.1cmの小さな開口部と約22cmの長さの2番目のガラスピペットを使用します(図2F)。</li>
		<li>ブンゼンバーナーの炎で熱研磨することにより、両方のピペットのエッジを滑らかにします。5-10 sのピペットチップを穏やかな動きで炎の中に持ち、鋭いガラスエッジが滑らかになるまで均等に熱配分を可能にします。</li>
		<li>使用直前に、両方のタイプのガラスピペットに無菌HSをコーティングし、ピペット全体に~2 mLのHSを5分間充填し、その後、HSを排出し、ピペットをRTで5分間乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EDLの筋肉の分離とコラゲアーゼ消化
<ol><li>汚染を避けるために、すべての装置に70%エタノールをスプレーしてください。</li>
	<li>動物実験のための国の規則に従ってマウスを犠牲にする。</li>
	<li>マウスの後肢に70%エタノールをスプレーします。硬化した細かい湾曲したはさみ(24mmの刃)と細かい鉗子(Dumont 7、湾曲または直線)を使用して皮膚を取り除き、下の筋肉を露出させる。毛皮との基礎となる筋肉の接触を避ける(汚染のリスクを高める)。</li>
	<li>下の筋肉を傷つけることなく、細かい湾曲した鉗子で周囲の筋膜を取り除く(図2A)。曲がらないようにフォースを閉じます。</li>
	<li>曲面鉗子を使用して、TA(脛軸リス前部)およびEDL筋肉の遠位腱を露出させます。TAを取り外すために、鉗子で遠位TA腱をつかみ、微細なヴァンナススプリングハサミ(5mmの刃先、0.35 mmの先端の直径)で切る。腱でTAを保持しながら、膝の方に向かって引っ張り、膝の近くに筋肉を切断します(図2B)、EDLの筋肉が露出しています。 注: TA 腱のみがこのステップでつかまれるようにしてください。TAの筋肉を切断する場合は、膝の腱がその後簡単に見ることができることを確認してください。</li>
	<li>細かい湾曲した鉗子で遠位EDL腱を持ち上げ、細かいヴァンナススプリングハサミで切る(図2C)。EDLを膝に向かって慎重に引っ張って、近位EDL腱を露出します。近位腱を細かいヴァンナススプリングハサミで切ります。EDL筋肉をステップ1.4から15mL反応管内のコラゲターゼ消化液の2.5mLを予熱した37°Cに移す。(図2D)。 注:近位EDL腱を完全に露出させるために外膝結合組織で小さな切開を行います。腱だけをつかみ、EDLを伸ばしすぎないようにしてください。</li>
	<li>手順 2.3 を繰り返します。2.6に。2 番目の EDL を使用します。2.5 mL コラゲナーゼ消化液を充填した同じ 15 mL 反応チューブに両方の EDL 筋肉を追加します。</li>
	<li>37°Cの反応管中のEDL筋肉を循環水浴中にインキュベートする。 注:インキュベーション時間は、コラゲナーゼ活性、マウスの年齢、線維組織の量などのいくつかの要因に依存します。成人マウスのEDL筋肉(生後2~6ヶ月)の典型的なインキュベーション時間は1-1.5時間および老化したマウス(生後18ヶ月)1.5-2時間である。</li>
	<li>筋肉の過度の消化を避けるために, 消化時間中に筋肉をチェックします。.筋肉が緩んで単一の筋線維が見えるとき、消化を止める(図2E)。大きなボアピペットを用いて筋をミオファイバー分離媒体を含む12ウェルプレートの第1ウェルに慎重に移す(図2G)。</li>
</ol>3. 筋繊維の解離と文化
<ol><li>以下の工程では、ステレオ双眼顕微鏡を用い、加熱板(37°C)を優先的に装備する。大きなボアピペットを使用して、単一のミオファイバーが放出されるまで、温かい分離媒体で筋肉を洗い流します。所望の数のミオファイバーが溶液中に自由に浮かび上がるまで、大きなボアピペットで筋肉を解化します。 注意:ミオファイバーの損傷のリスクを減らすために、過度のトリアージを避けてください。ミオファイバーの解離に加熱プレートを使用することは、分離プロセス中に温度が低下し、ミオファイバーが死に至るので強く推奨されます。</li>
	<li>HSコーティングされた小さなボアガラスピペットを持つ非収縮したミオファイバー(図2H)を、破片を洗い流し、収縮した(損傷した)ミオファイバーを分離媒体で満たした第2の井戸に移す(図2I)。 注:分離されたミオファイバーの過度の動きを避けるために、それらは第二の井戸に移され、次にトリチャレーションプロセスを続けることができます。</li>
	<li>収縮していないミオファイバーを次の(3rd)に移し、分離媒体で満たして再び洗います。</li>
	<li>HSでコーティングされた小ボアガラスピペットを使用して、約50〜100個の非収縮ミオファイバーをミオファイバー培養培地を含む24ウェルプレートに移す。</li>
	<li>37°Cでインキュベートミオファイバー、5%CO2専用時間(最大96時間推奨)をインキュベートします。 注: MuSC は、42 時間の文化の後に平面または円錐形の基礎のどちらかを 1 回分割します。さらに、72時間培養後、MuSCは自己更新、増殖、またはコミットされた(差別化された)MuSCからなる多細胞クラスターを形成する。</li>
</ol>4. siRNA トランスフェクション
<ol><li>4時間のミオファイバー分離後、トランスフェクト・ミオファイバー関連MuSC(500μL培養液で満たされた24ウェルプレートの1ウェル内50〜100個の非収縮ミオファイバー)を脂質ベースのトランスフェクション試薬で、最終的な濃度5pmol siRNAを有するメーカーのプロトコルに従ったRNAiMAX。したがって、トランスフェクション試薬1.5μLを含む25 μL Opti-MEMに、それぞれのsiRNAの容積を含む25 μLのオプティ-MEMを加えます。反応ミックスを5分間インキュベートし、培養液500μLに加えます。 注:24時間後または48時間後の2回目のトランスフェクションは、例えば48時間を超える長い培養期間に推奨されます。トランスフェクション後の培地の交換は必要ありません。</li>
</ol>5. 固定とIF染色
<ol><li>免疫染色には、ステレオ双眼顕微鏡を使用してください。以下のステップのすべての容積は24-well版の1つの井戸に調節される。HSコーティングされた小ボアピペットを使用して、次のすべての手順を実行します。</li>
	<li>ウェルに溶液を残したまま、ミオファイバー培養培地を慎重に捨てます(24ウェルあたり約100μL)。ミオファイバーの浮動を許可するために特に記載されていない限り、これ以上のすべてのステップでこれを行います。2%PFAの500 μLを加えて、隣接するMuSCでミオファイバーを固定し、室温(RT)で5分間インキュベートします。</li>
	<li>上清を慎重に取り出し、PBSでミオファイバーを3回洗います(pH 7.4、500 μL、RTで5分間ずつ)。</li>
	<li>500 μL の透過性溶液 (0.1% トリトン X-100, 0.1 M グリシン PBS, pH 7.4) を加えて、RT で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>パーメアビライゼーション溶液を取り外し、RTで1時間500 μLブロッキング溶液(PBSでは5%HS、pH 7.4)を追加します。 注: 非特異的結合を避けるため、一次抗体の推奨ブロッキングソリューションを確認してください。</li>
	<li>ブロッキング溶液を取り除き、1井戸あたり300μLの一次抗体希釈(例えば、抗Pax7(PAX7、DSHB、希釈されていない)、抗MyoD(クローンG-1、サンタクルス、1:200))を加えます。一晩4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>1ウェルあたり500 μLのPBSで3回洗浄します(RTで5分)。</li>
	<li>PBSを取り除き、300 μLの二次抗体希釈液(例えば、抗マウス-IgG1-546および抗マウス-IgG2b-488 1:1000)を1ウェルあたりに加えます。光から保護されたRTで1時間インキュベートする。以下の手順では、軽い減らされた状態を推奨します。</li>
	<li>1ウェルあたり500 μLのPBSで2回洗浄します(RTで5分)。</li>
	<li>RTで5分間、ウェルあたり500 μL(最終DAPI濃度10 μg/mL)を使用して、DAPI染色を行います。</li>
	<li>1ウェルあたり500 μLのPBSで2回洗浄します(RTで5分)。</li>
	<li>疎水性ペンを使用して、ミオファイバーを含む液体の流出を防ぐ撥水バリアを作成するために、顕微鏡のガラススライド上に円を描きます。ミオファイバーを可能な限り最小の体積で微小なガラススライドに移し、ガラススライドに分散させます。 注: ミオファイバーからクラスタが剥離する摩擦が生じる可能性があるため、ミオファイバーを顕微鏡ガラススライド上に物理的に引っ張らないようにしてください。</li>
	<li>小さいボアのパスツールピペットまたは200 μLピペットで残留液を取り除きます。</li>
	<li>水性取り付け媒体を2滴使用し、カバースリップでミオファイバーを覆います。メーカーが推奨する時間の間、スライドを乾燥させます。スライドは暗闇の中で4°Cで保管してください。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+aging+-+Stem+cells+in+the+spotlight.">Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).</li><li>Chang, N. C., Rudnicki, M. 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T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+quiescence:+Dynamism,+restraint,+and+cellular+idling.">Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling.</a> Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).</li><li>Judson, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+Yap+plays+a+key+role+in+influencing+fate+decisions+in+muscle+satellite+cells.">The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 6009-6019 (2012).</li><li>He, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-mediated+Pax7+dysregulation+in+the+muscle+microenvironment+promotes+cancer+cachexia.">NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).</li><li>Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt7a+counteracts+cancer+cachexia.">Wnt7a counteracts cancer cachexia.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).</li><li>Feige, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+satellite+cells+and+transplantation+into+mice+for+lineage+tracing+in+muscle.">Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle.</a> Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).</li><li>Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiotoxin+induced+injury+and+skeletal+muscle+regeneration.">Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).</li></ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

ここでは、インビトロアプローチを用いてMuSCにおける特定の遺伝子の役割を機能的に調査する方法を紹介する。重要なことに、ここで説明するシステムでは、MuSCは、そのニッチとMuSCの相互作用のほとんどを維持する可能な限りインビボの状況に似た条件で培養されています。これは、浮遊条件下での隣接するMuSCsと連続したsiRNAトランスフェクションで単離されたミオファイバーを培養することによって達成される。免疫蛍光分析を通じて72時間培養中のMyofiber単離、siRNAトランスフェクションおよびMuSC集団の調査の手順について説明する。さらに、30時間培養後に、全MuSCの約74%が蛍光標識対照siRNAでトランスフェクションされたことが実証された。
特に注意深く伸び、つまむ、または圧迫が筋繊維の収縮および連続死につながるので、EDL筋肉の慎重な解剖に焦点を当てるべきです。さらに、各条件で反復ごとに少なくとも20種類のミオファイバーからMuSCのクラスタを調査することが重要です。MuSC の数とプロパティは MuSC のサブ集団の存在によって変化するため、これは必要です。フローティングミオファイバ培養法を用いてMuSCに対する特異的siRNAの効果を調べると、標的siRNAと非標的制御との条件の比較は、同一マウスおよび筋肉内で行われるべきである。これは、siRNAの影響をカバーまたは増幅する可能性のあるマウス固有の違いを避けるために推奨されます。ノックダウン効率は、隣接するMuSCを有する単一のミオファイバーを用いて、標的遺伝子に向けられた抗体による免疫蛍光分析によって決定することができる。これがオプションでない場合は、一次筋芽細胞のsiRNAノックダウン効率をテストし、続いて定量的RT-PCRまたはイムノブロット分析を行うことができます。siRNAの効率は、単一のミオファイバーに対するMuSCに対するsiRNAの影響を分析する前に決定する必要があります。4 つの異なる siRNA と 1 つの siRNA から成るスマート プールを使用すると、ノックダウン効率が向上しますが、非特異的ターゲティングのリスクも高まります。非標的siRNAはコントロールとして使用されるべきである。トランスフェクション効率を直接監視するために、ここで行う蛍光標識非標的siRNAを使用することができる。siRNAによるトランスフェクションのタイムポイントは、分離後約4時間で、MuSCを取り巻く基底層がsiRNAに対して既に透過性を有する時点である。72または96時間後のMuSCsに対する特異的siRNAの効果を調べる必要がある場合は、24時間後または48時間後に2回目のsiRNAトランスフェクションを行い、高いノックダウン効率を維持することをお勧めします。
ミオファイバー培養アッセイは、従来の細胞培養法によるMuSCの調査に比べ、多様な利点を示しています。MuSC は、全体の分離プロセス中にミオファイバーに取り付けられたままで、そのニッチ19、23、24、25と MuSC の重要な相互作用を維持します。MuSCとミオファイバーの保存された相互作用は、従来の2D筋芽細胞培養では再現できないMuSC機能に対するニッチ依存効果を研究するための前提条件である。例えば、加齢時にMuSCsは、損傷20、26の後に筋組織を再生する効率を低下させる結果として、筋原性能力の低下を示す。この障害は、少なくとも部分的には、MuSCニッチの変化、特にECM組成物27、28の変化に起因する。ミオファイバー培養プロトコルは、これらの異常なニッチ変化に対する研究と干渉を可能にする。
ここで説明する方法とは対照的に、FACS(蛍光活性化細胞分類)やMACS(磁気細胞分類)のような免疫標識およびソート技術によるMuSCの精製は、それらのニッチからMuSCを除去することを含む。興味深いことに、老化した筋肉から分離されたMuSCの2D培養は、その外因性の手掛かりを緩め、若い筋肉から分離されたMuSCと同様に振舞い、それによってインビボ状況を適切に29に再現しない。さらに、筋肉組織の完全解離および表面マーカーによるMuSCの標識は、細胞30、31、32の転写的変化および活性化をもたらす。ミオファイバー培養システムのもう一つの利点は、種々のレベルでMuSC機能を妨害する可能性である。培養されたミオファイバー上のMuSCの操作は、ここで詳細に説明するsiRNA媒介遺伝子のノックダウンによって効果的に達成することができる。同様に、化学化合物の適用または組換えタンパク質の送達は、幹細胞経路20,28を妨害するのに非常に有効である。さらに、レトロまたはレンチウイルス発現ベクターは外因性遺伝子の導入を可能にする、すなわち、構成的活性変異体33。さらに、MuSC機能に対する外因因子の影響は、ここで説明するシステムで探索することができ、例えば、培養条件は、癌のキャッシュシア34、35のような異なる状態をモデル化するために異なる生理学的または病理学的源からの上清を補うことができる。
ここで説明する方法の1つの制限は、単一のミオファイバー培養システムが、すべての全身的要因の影響または他の細胞タイプのMuSCsへの影響を完全に再現できないという事実である。また、ミオファイバーを培養で生存できる時間は限られているため、MuSC関連プロセスの研究は活性化や筋形成的コミットメントなどの初期の事象に焦点を当てています。さらに、免疫細胞や線維状異形成前駆細胞などの他のニッチ細胞とのMuSC相互作用の調査は不可能である。MuSC機能に対する全身的な影響を調べるには、筋肉損傷実験を行い、その後に生体内での筋再生の解析を行うか、移植実験を行う36,37。
一緒に考えて、ミオファイバー分離および培養プロトコルは、トランスジェニックマウスモデルの要件なしに成人MuSCに関する遺伝的または機械学的研究のための絶好の機会を提供し、潜在的に動物実験を減らすことができる。

成体の骨格筋は、主に多核化筋繊維で構成された死後の組織であり、これは自発的な動きのためのエフェクター細胞である。それは、胚性筋形成に似て、年齢および疾患1の障害を受けるプロセスである再生する顕著な能力を有する。骨格筋のこの顕著な再生能力は、筋幹細胞(MuSC)に依存し、これはまた、サルコレンマと筋繊維の基底層層間の位置のために衛星細胞とも呼ばれています2,3.安静状態下では、MuSCは静止しており、Sprouty14、5、6、7、8などの転写因子Pax7および静止マーカーの発現によって特徴付けられる。活性化すると、例えば、傷害後、MuSCは静止状態を離れ、筋原性調節因子MyoD9をアップレギュレータする。Pax7/MyoD二重陽性のMuSCは増殖し、それにより筋形成前駆細胞を生成し、しばしば筋芽細胞とも呼ばれる。これらの筋芽細胞は、次にさらに細長い筋細胞に分化し、分子および形態学的変化と一致するプロセス、例えば、Pax7の喪失およびミオゲニン発現10のアップレギュレーションを行う。その後、筋細胞は最終的に互いに融合するか、または既存の筋繊維に融合し、損傷した組織を修復する。重要なことに、筋肉幹細胞のごく一部はMyoDのアップレギュレーションを元に戻し、自己更新することができます11.MuSC分化および筋原性進行の状態は、Pax7、MyoDおよびミオゲニン10などの筋形成マーカーの調査によって容易に観察することができる。
隣接するMuSCsを伴う単一のミオファイバーの文化は、MuSCが内因性のニッチ12、13に残っているので、ex vivo設定でMuSC機能を調査するための優れた方法である。MuSCの挙動は、固有の信号だけでなく、粘液およびミオファイバー自体を取り巻く細胞外マトリックス(ECM)の成分を含む特殊な解剖学的位置であるニッチによって提供される外因性信号によって調節される。たとえば、MuSC 静止の外因性レギュレータの 1 つがノッチシグナリングです。ここでは、信号キューは、ミオファイバとECM14、15、16の両方からMuSCによって受信されます。さらに、MuSCニッチは、MuSCの分裂軸を制御するために重要であり、このようにMuSCドーター細胞17、18の細胞運命を調節する。合理的に、非対称MuSC部門、筋原性の進行および自己再生のようなパラメータは、この実験的なセットアップで一意に評価することができる。例えば、多細胞クラスターは、72時間培養期間後に1つのMuSCから生じ、自己更新、増殖およびさらに分化されたMuSCs8、19、20、21などの異なる筋原集団の発生および割合について調べることができる。MuSCの分化状態は、Pax7、MyoDおよびミオゲニンの発現/共発現の調査によって決定することができる。72時間培養後、クラスター内の細胞は、以下のパラメータによって識別することができる:Pax7細胞のみが自己更新MuSCであり、Pax7/MyoD二重陽性細胞は増殖/活性化されたMuSCであり、さらに分化した筋細胞はミオゲニン陽性22である。さらに、MuSCの数または細胞周期/活性化への再突入は、例えば、上記のパラメータに基づく免疫蛍光ベースの分析を通じて、筋形成進行に加えて調べることができる。
ここで、ミオファイバー絶縁および培養プロトコルの固有の特徴、例えば、MuSCとそのニッチとの相互作用の保存について説明する。マウス全体のEDL(伸張ジジトーム長さ)筋肉は慎重に解剖され、コラゲターゼによって消化され、物理的に三分化され、関連するMuSCを伴う単一の筋線維を得てさらなる培養を行う。さらに、このプロトコルは、トランスジェニック動物を必要とせずに、候補遺伝子の機能分析や連続した免疫蛍光ベースの分析のために、SiRNAを用いてMuSCをトランスフェクトするステップを説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>A-21141</td>
			<td>use 1:1000 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>A-21123</td>
			<td>use 1:1000 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken embryo extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td>chicken embryo extract containing growth factors etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with 4.5&#160;g/l glucose and sodium pyruvate)</td>
			<td>GibCo</td>
			<td>41966029</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoD antibody clone G-1</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-377460</td>
			<td>dilute 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>PAX7</td>
			<td>use undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO Red Transfection Indicator</td>
			<td>horizon discovery</td>
			<td>D-001630-02-05</td>
			<td>non targeting siRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single myofiber culture assay for the assessment of adult muscle stem cell functionality ex vivo

成体骨格筋組織は、再生能力に欠かせない幹細胞集団を抱えている。筋肉の損傷時に、筋肉幹細胞は静止状態を離れ、筋肉幹細胞プールの補充と共に損傷した組織の修復につながる筋形成プログラムを活性化する。様々な因子が筋肉幹細胞活性に影響を及ぼし、その中でも固有の刺激だけでなく、直接筋幹細胞環境、幹細胞ニッチからのシグナルもある。関連する筋幹細胞を持つ単一の筋線維の単一の分離および培養は、幹細胞とニッチの相互作用のほとんどを維持し、したがって、筋肉幹細胞機能ex vivoを研究する最も近い可能性である。ここで、単離のためのプロトコル、培養、siRNAトランスフェクションおよびマウスEDL(伸長ジデンマス長指)筋からのそれぞれの筋線維上の筋幹細胞の免疫染色が提供される。ここで概説する実験条件により、生体内動物実験を必要とせずに筋原性活性の調査を含む筋幹細胞ex vivoの研究と操作が可能になります。

このプロトコルは、マウスEDL筋肉からの関連するMuSCsを伴う単一の筋繊維の誘導および培養を成功させるための指示を提供する。プロトコルの重要な手順を図 1にまとめています。EDL筋肉の腱間解離を注意深く行う(図2A-C)は、生じる筋繊維の高収率にとって重要である。筋肉解離は、まずコラゲターゼ消化(図2D)、続いて物理的トリチャレーション(図2G)によって達成される。インタクトなミオファイバー(図2H)は培養され、過収縮および死んだ筋繊維(図2I)は培養および分析から除外されるべきである。
MuSC は、分離プロセス中に、myofiber に関連付けられたままになります。転写因子Pax7の免疫蛍光染色は、単離プロセスの完了直後に固定された場合、7-9 ΜSC核をミオファイバー当たりの多量から識別し、区別する(図3A)。図3Bは、図3Aからの拡大領域を示し、さらに、筋膜の細胞内筋細動構造を暴露し、MuSCの核におけるPax7免疫蛍光シグナルを示す。
筋繊維関連MuSCの活性化および筋形成進行は、筋原性マーカー発現によって解析することができる。新たに単離されたミオファイバー(0h)に関連して、主に静止したMuSCが見つかると、これはPax7発現およびMyoD発現の欠如を特徴とし、それによってin vivoホメオスタティック状態に似ている(図4、0h)。解剖/解離手順とミオファイバー培養培地組成により、MuSCは、42時間で観察されるように増殖を促進するために、転写因子MyoDを急速に活性化し、アップレジションします(図4、42h)。72時間培養後、MuSCは異なる筋原性マーカーの発現パターンと平行する異なる筋原性運命を有する子孫のクラスターを形成する(図4、72h)。Pax7+細胞だけが分化に抵抗し、自己更新幹細胞になる。Pax7+およびMyoD+二重陽性細胞は増殖し、MyoD+細胞のみが筋原系に沿ってさらに進行しており、分化するであろう。
ミオファイバー培養システムは、様々な介入によるMuSC活性の効率的な干渉を可能にし、そのうちの1つは、このプロトコルで詳細に説明されているようにsiRNAトランスフェクションである。関連するミューファイバー関連のトランスフェクション効率をモニタリングするために、蛍光標識非標的siRNAをトランスフェクションした。Pax7陽性のMuSCは、細胞質siRNAを顆粒様に蓄積し、効率的な取り込み(図5A)を示す。ミオファイバーの細胞質では、分離後4時間で天然の取り込みバリアを示唆する蛍光顆粒はなく、siRNAトランスフェクションは特にMuSCsを標的としている。ミオファイバー当たり陽性にトランスフェクトされたPax7+細胞を定量化すると、MuSCの半数以上が、24時間で第1回分割完了直前に蛍光標識siRNAの可視量を占めていたことが明らかになった。トランスフェクトされたPax7+細胞の数は、30時間後にさらに74%まで増加した(図5B)。さらに、両方の時点で、トランスフェクトまたは非トランスフェクション状態のミオファイバー当たりのPax7+細胞数に差はなく、トランスフェクション手順による幹細胞数に悪影響を及ぼさない(図5C)。
要約すると、プロトコルは、隣接する筋幹細胞を用いたEDL単一筋繊維の分離および培養の詳細な説明を提供する。これは、免疫蛍光ベースの分析によって、例えば、ex vivoの筋線維関連筋幹細胞活性の研究を可能にする。siRNAトランスフェクションによる筋幹細胞の操作は効率的であり、機能的分析のための方法論的基礎を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62257/62257fig1v2.jpg"> 図1: 重要なステップの概略この図では、単離および免疫染色手順の必須ステップを要約する。略語: DMEM, ダルベッコの修正イーグルの媒体;FBS, 胎児牛血清;CEE, 鶏胚エキス;TA,脛表前;EDL、extensorデジコンロンサス<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62257/62257fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62257/62257fig02.jpg"> 図2:マウスEDL解剖と単一筋線維分離.(A)マウス後肢の皮膚を取り除き、筋膜周囲の筋肉を引き離してTA(脛眼前)筋を露出させる。(B) TAの筋肉を取り除き、白い矢印で示されたEDL(伸長ジジットロンス)筋を露出させる。(C) EDLの筋肉は腱を切ることによって解剖される。(D) 2つのEDL筋肉はコラゲ者を消化する。(E) コラゲナーゼ消化筋肉の外観と、目に見える単一の筋繊維が組織コアから緩む。(F)大小のパスタプレットとスケール。(G)EDLの筋肉(黒い矢印で示される)は、大きなボアパスツールピペットを使用して物理的に三分引きされる。(H)単一の無傷の筋繊維は薄く光沢があり、培養および分析のために個別に採取することができる。(I) ハイパーコントラクトおよびデッドミオファイバーは、文化や分析には適していません。2Hおよび2Iの顕微鏡画像を、N-Achroplan 5x目的を用いて顕微鏡で撮影した。スケールバーは200 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62257/62257fig02large.jpg" target="_blank">です。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62257/62257fig03.jpg"> 図3:関連するMuSCsを持つ単一のミオファイバー全体の顕微鏡画像。若いC57BL/6マウスのEDLから単一の筋繊維を調製し、分離後にPFA固定(0時間)を行った。(A) Pax7とDAPI免疫蛍光染色は、筋線維関連筋幹細胞(MuSC、矢印で示される)を識別する。顕微鏡画像は、プラン・アポクロマト40x油目的を搭載した顕微鏡のタイルとZスタック機能を使用して撮影した。スケールバーは200μm(B)から拡大し、ミオ核、1 Pax7陽性核、明視野の筋線維構造からの明暗パターンを示す。スケールバーは10 μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62257/62257fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62257/62257fig04.jpg"> 図4:単繊維培養中のMuSC活性化および筋原性進行の免疫蛍光画像 新たに単離された筋線維(0h)の筋幹細胞(MuSC)は、生体内静止期に近いホメオスタティック状態を表し、Pax7の発現およびMyoD発現の欠如を特徴とする。単一の筋繊維培養中にほとんどのMuSCはMyoDをアップレレートし、細胞周期に再び入って分裂し増殖する(42時間)。培養72時間後のMuSC運命は、筋原性マーカー発現に基づいて判別することができる。Pax7のみの発現を持つ細胞は自己更新(赤い矢印)、Pax7とMyoD二重陽性細胞(赤/緑の矢印)は増殖し続けます。MyoDは、陽細胞(緑色の矢印)のみが筋原性分化に取り組んだ。顕微鏡画像は、プラン・アポクロマト20x目的(0時間、42時間)またはLDプランネオフルアー40x目的(72時間)を有する顕微鏡を用いて撮影した。スケールバーは20μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62257/62257fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62257/62257fig05.jpg"> 図5:MuSCsの蛍光siRNAトランスフェクションと取り込み分析EDL単一のミオファイバーは、このプロトコルによって提供されるステップに従って、蛍光標識siRNA(siGLO)で調製およびトランスフェクトされた。(A) 30時間培養で単一のミオファイバー上のPax7陽性筋幹細胞(MuSC)に特異的にsiGLO顆粒の細胞プラズマ蓄積。顕微鏡画像は、プラン-アポクロマト100x油目的を有する顕微鏡のZスタックおよびアポトーム機能を使用して撮影した。スケールバーは5μm(B)24または30時間の培養でPax7陽性筋幹細胞によるsiRNA取り込みの定量化である。(C)培養24時間または30時間の非トランスフェクトおよびトランスフェクト状態を比較する単一のミオファイバー当たりのPax7陽性細胞数。データは、n=4マウスの標準偏差を有する平均として示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62257/62257fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

筋肉幹細胞は内因性ニッチと関連付けられたままであり、例えばsiRNAトランスフェクションを介して容易に操作することができる。この方法により、ニッチを維持することにより、生体内の状況に近い環境で培養中の筋肉幹細胞を分析することが可能となる。まず、ダイヤモンドペンで滅菌パスツールピペットを切断します。各マウスに対して、約0.3センチメートルの開口部と約10〜12センチメートルの長さの1つの大きなボアピペットと、約0.1センチメートルの小さな開口部と約22センチメートルの長さの2番目のガラスピペットを使用してください。穏やかな動きで5〜10秒間ブンゼンバーナーの炎の中にピペットの先端を保持することによって、両方のピペットのエッジを平滑化。使用直前に、ピペット全体に2ミリリットルの馬の血清を5分間充填し、馬の血清を注入し、ピペットを室温で5分間乾燥させることで、両方のピペットに無菌馬の血清をコーティングします。70%エタノールでマウスのすべての機器と後肢をスプレーします。硬化した細かい湾曲したはさみと細かい鉗子を使用して皮膚を取り除き、下の筋肉を露出させます。下の筋肉を傷つけることなく、細かい湾曲した鉗子で周囲の筋膜を取り除きます。脛表の前またはTAを取り除くために、鉗子で遠位TA腱をつかみ、細かいはさみでそれを切る。腱でTAを保持しながら、膝の方に引っ張り、EDL筋肉を露出させるために膝に近い筋肉を切断します。遠位EDL腱を曲がった鉗子で持ち上げ、細かいヴァンナススプリングハサミで切ります。EDLを膝に向かって慎重に引っ張って、近位EDL腱を露出します。その後、近位腱をはさみで切ります。循環水浴で摂氏37度で反応管内のEDL筋肉をインキュベートします。筋肉が緩み、単一のマイルの繊維が見えるとき、消化を停止します。加熱プレートを装備した無菌双眼鏡顕微鏡の下で作業すると、大きなボアピペットを使用して温かく分離媒体で筋肉を洗い流しました。所望の数のミオファイバーが溶液中に自由に浮かび上がるまで、大きなボアピペットで筋肉を解化します。破片を洗浄するには、小さなボアガラスピペットを使用して、収縮していないミオファイバーを分離媒体で満たされた第2の井戸に移します。その後、50〜100個の非収縮ミオファイバーを、ミオファイバー培養培地で満たされた24ウェルプレートの1ウェルに移した。ミオファイバーを摂氏37度、炭酸ガス5%で72~96時間インキュベートします。筋線維の分離の4時間後に筋幹細胞に関連する筋線維をトランスフェクトする。25マイクロリットルのトランスフェクション試薬を含む25マイクロリットルのオプティ-MEMと25マイクロリットルのsiRNAの各容積とオプティ-MEMを組み合わせます。反応ミックスを5分間インキュベートし、24ウェルプレートの細胞に加えます。その後、時間の尊重のために摂氏37度でプレートをインキュベートします。ここでは、免疫蛍光染色プロトコルの重要なステップのみを示しています。慎重に、ウェル内にいくつかの溶液を残したまま、ミオファイバー培養培地を捨てます。2%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルを加え、隣接する筋肉幹細胞で筋繊維を固定します。プレートを室温で5分間インキュベートします。上清を慎重に取り出し、PBSでミオファイバーを3回洗います。二次抗体でインキュベーション後のインキュベーションステップ中に、プレートをtinfoilで覆います。疎水性ペンを使用して、顕微鏡的なガラススライドに円を描きます。その後、可能な限り最小の体積のミオファイバーをスライドに移し、それらを分散させます。小さなボアパスツールピペットまたは200マイクロリットルピペットで残留液を取り除きます。水性取り付け媒体を2滴使用し、カバースリップでミオファイバーを覆います。その後、スライドを乾燥させ、暗闇の中で摂氏4度で保存し、顕微鏡分析を行います。このプロトコルは、マウスEDL筋肉からの単一の筋繊維の導出および培養を示す。Pax7の免疫蛍光染色を用い、筋幹細胞の核を同定した。拡大領域は、隣接する筋幹細胞を有する筋繊維を露出し、筋肉幹細胞の核におけるPAX7免疫蛍光シグナルを示す。筋幹細胞筋細胞は、マーカー発現により解析することができる。Pax7の存在とMyoD発現の欠如は、新たに単離された筋線維の静止筋幹細胞と関連している。筋幹細胞の増殖において筋質発現が観察される。72時間後、筋肉幹細胞は異なる筋原性状態を有する子孫のクラスターを形成し、これは異なる筋原性マーカーの発現によって平行である。Pax7細胞だけが自己更新幹細胞である。Pax7およびMyoD二重陽性細胞が増殖している。一方、筋Dのみの細胞は細胞を分化している。筋幹細胞のsiRNAトランスフェクションは、効率的な取り込みであることを示す顆粒様式で細胞質siRNAの蓄積を示した。筋繊維当たりトランスフェクトPax7陽性細胞の定量化により、トランスフェクト細胞数は30時間後に最大74%増加し、筋肉幹細胞数に悪影響を及ぼさないことが明らかになった。このプロトコルを試みるとき、EDLを慎重に解剖することが最も重要です。siRNAトランスフェクションに加えて、トランスジェニック動物の分析や組み換えタンパク質によるインキュベーションは、隣接する筋線維上の筋肉幹細胞のさらなる機能解析のために可能です。

Research

JoVE Journal

Biology

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A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

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In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

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筋衛星細胞の単離、培養、および移植

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Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...